酶学分析技术2016

绝对定量法（酶量直接测定法）：免疫学方法 酶测定 相对定量法（酶活性间接测定法）：生化检测方法
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一、定时法
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原理： 定时法是固定时间法的简称，是指底物 与酶反应一段时间（t1～t2）后,加入强酸、 强碱、蛋白沉淀剂等终止反应,测定这段时间 内产物的增加量或底物的减少量以测定酶活 性的方法。
吸 光 度 A t1 t2
线、速率曲线、时间曲线）
吸 光 度 A 延 滞 期 非 线 性 期 线 性 期
t1 图5-1
t2 酶促反应进程曲线
时间t
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（一）延滞期（lag phase、延迟期 ）
特点：为反应的初始阶段，反应速率一开始时较慢，通常为几秒到几 分钟
吸 光 度
A
延 滞 期
非 线 性 期
延 滞 期
孵 育 期
R1
线 性 期
无需停止酶促反应 连续观测反应进程 标本和试剂用量少
不需添加其他呈色试剂 在线性期测定酶活性 可在短时间内完成测定
对仪器要求高
连续监测法的分类
（一）直接法
指直接测定酶促反应产物或底物的理化指标以测定酶 活性的方法。 测定NAD（P）H的方法 测定人工合成的色素原底物的方法 测定耗氧量的方法 测定pH改变的方法 等
酶偶联法
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（三）酶活性浓度的计算
摩尔消光系数(ε)：在特定条件下，当吸光物质的浓度为1 mol/L，吸 收池厚为1cm，以一定波长的光通过时，所引起的吸光度值A。 意义：ε值取决于入射光的波长和吸光物质的吸光特性，亦受溶剂和温 度的影响。显然，显色反应产物的ε值愈大，基于该显色反应的光度测 定法的灵敏度就愈高。 在测酶时，常数K值的选择是很重要的。此值过高虽然测定的线性范围较 宽，但重复性差，反之，虽然精密度好，但线性窄。改变K值最方便的途 径就是改变标本稀释度，稀释倍数愈大，K值愈大
组织细胞 体液：以血浆或血清为主

测定方法： 酶质量测定：绝对质量，以g/L为表示单位
酶活性测定：相对质量，以U/L为表示单位
(一)、酶活性浓度表示方法
酶活性（enzyme activity）也称为酶活力，指酶促反应速 率，即规定条件下在单位时间内产物的生成量或底物的减 少量。 表示方法：
d [ P] v dt
鉴别酶的种类
反映酶对底物亲和力的大小 选择酶的最适底物或天然底物 设计适宜的底物浓度
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Vmax的含义
定义：Vmax表示在一定酶量时的最大反应速率，即酶完 全被底物所饱和时的反应速率，与酶活性浓度呈正比。 应用：计算酶的转换数（TN，催化常数Kcat）单位时间内每 个酶分子将底物分子转换成产物的最大值 。
特点：各单位对温度、时间、物质量的定义不同，导致各测 定值、参考范围相差很大，彼此间无法比较,现在临床应用较 少。
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2.国际单位IU（µmol/min）
IFCC,2001年 37℃
定义：在规定条件下（25℃及其他最适条件），每min催化1µmol 底物转变为产物的酶量，为1IU或1U，1IU=1µmol/min。
进入非线性期的原因：
反应的不断进行，底物消耗越来越多，可逆反应增强、产物抑制 增加等使得反应速率明显下降。
特点：
若为单底物的反应，则此时反应速率与单底物浓度[S]的一次方 成正比，为一级反应。
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酶学分析技术的应用
第二节 酶活性测定方法 第三节 代谢物酶学分析技术
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第二节 酶活性测定方法
E E
酶单位/升 = —————————×————————
· L· V标 实际保温时间
正常上限升高倍数（ULN）

概念：某标本酶活性测得的结果除以该法正常参考范围上 限所得倍数。

即ULN＝
酶活性实测值 正常参考范围上限
例：如某人血ALT测定结果为80u/L，该测定方法正常 参考范围上限为40mmol/L，其ULN＝80/40＝2
情况下都被不严格地称为酶活性单位乃至酶活性.
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计算公式:
产物的增加量 每单位规定的保温时间 1000（ml） 酶单位/升 = —————————×——————————×———————— 每单位规定的产物增加量 实际保温时间 实际标本用A测定 – A对照）· V总 · 106 每单位规定的保温时间
或
d[S ] v dt
式中v：反应速率，[P ]：产物浓度，t：时间，[S]：底物浓度。
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酶活性单位
定义：表示酶的相对含量，指在一定条件下，单位时间内
生成一定量的产物或消耗一定量的底物所催化的酶量。
表示方法： 惯用单位（一定的反应量/一定的反应时间） 国际单位IU（µmol/min） Katal单位（mol/s）
计算公式为：
TN =底物转化量（mol/s）/酶量（mol）
= Vmax / [E]
(单位是s-1)
计算时要保证酶的浓度单位与底物的浓度单位一致）
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（二）、Km与Vmax的应用
1. Km的计算 2.鉴定酶的种类
Km值是酶的特征常数，在反应条件一定时，只与 酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。不同种
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1．惯用单位：
20世纪60年代以前根据酶活性测定方法建立者的姓氏命名的单位
ALP的金氏单位（King） 举例： 氨基移转酶的卡门氏单位（Karmen）
金氏单位：100ml血清ALP在37℃与底物作用15min，产生1mg酚。 卡门氏单位：1.0ml血清在25℃，340nm，反应体积3.0ml,光径1.0cm 时每分钟测定吸光度下降0.001，即消耗4.82 10-4μmol NADH为一 个卡门氏单位
(二)、酶质量浓度表示方法

原理：用免疫学技术直接测定酶的质量，以质量浓度单位
报告结果。如ng/ml或μg/L等。

优点：
1、灵敏度高； 2、特异性高
3、无活性酶蛋白测定
4、适于同工酶测定

不足：
1、抗体难以制备；2、方法繁杂；3、测定成本高
三、酶促反应动力学
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研究内容：(初速度,单因素)
第五章
酶学分析技术
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第一节 酶学分析技术基本知识
简介内容：
一、酶的基础知识 二、酶含量的表示方法 三、酶促反应动力学
四、酶促反应进程
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一、酶的基础知识
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酶（enzyme）：由活细胞产生的能高效催化特异生化反应的蛋白质，属于生物催化剂 酶的组成和命名 胰蛋白水解酶
酶的催化特点：
高效性、高度特异性、高度不稳定性、可调节性
v = —————
〔S〕+ Km
Vmax〔S〕
v
Vmax
代表反应速度
代表最大反应速度
〔S〕 代表底物浓度 Km 米氏常数
Km值是酶的特征常数，具有重要的应用价值。
Km的含义:
当Km=[S]时， v
V max ，可见Km值等于反应速率达 2
到最大反应速率Vmax一半时的底物浓度。
Km的意义：
Km是酶的一个特征性常数（其他如等电点），Km的大小只与酶的性质有关
由于酶的特异性强，催化反应的速度快，反应条件温和等， 因此酶试剂一般化学试剂，具有更高的特异性和灵敏度， 更易于自动化，可为临床更加及时地提供准确的检验信息。
酶的应用：
酶活性/含量的检测、代谢物的酶学分析和同工酶及亚型 测定用于临床诊断和疗效判断。
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二、酶含量的表示方法
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酶测定标本及方法类型

标本：
特
点
与定时法相比，属于即时观测，无需停止酶促反应、不需添加其他 呈色试剂，且可将多点的测定结果绘图连线，快速、直观查看酶促 反应进程，很容易找到呈直线的线性期，检查到是否偏离零级反应； 标本和试剂用量少，可在短时间内完成测定； 连续监测法要求不显色而是直接测定底物（或辅助底物即中间底物） 或产物量的变化，因此，在测定原理上，可以选择紫外吸收法或生 色原显色法； 要求能够准确地控制温度、pH值和底物浓度等，要求仪器具有恒温 装臵及自动监测功能，半自动及全自动生化分析仪都能满足这些要 求 。
2-氯-硝基酚-α-岩藻糖苷 α-岩藻糖苷酶（AFU） 2-CP（405nm，pH6.5） 6.2
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（二）间接法 是指加入相应试剂后间接测定酶促反应的产物转化物或 底物转化物的理化指标以测定酶活性的方法。 一步间接法
在反应体系中加入一些与酶促反应无关同时也不影响 酶活性的试剂，这些试剂只和酶反应物（一般是产物） 迅速作用，产生信号变化
研究酶促反应的速率及其各种影响因素（如底物浓度、 酶活性浓度、温度、pH、激活剂和抑制剂等）的科学 。
研究意义:
指导选择底物种类、确定底物浓度，确定最适温度、最 适pH、激活剂和抑制剂类型与含量等，从而准确测定酶活性
或代谢物浓度。
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(一)、酶促反应机制 E + S ES → E + P
米-曼氏方程(数学表达式)
3.反映酶与底物的亲合力 Km值越大，酶与底物亲合力越小，
Km值越小，酶与底物亲合力越大。
4.选择酶的最适底物 当酶可有几种底物时，其Km值最小者，为
该酶的最适底物。酶活力测定时，应优先选择
酶的最适底物。
5.设计适宜的底物浓度
酶促反应进程曲线表明，只有初速度才能真
正代表酶活性，一般要求初速度达到最大速度的
第三节 代谢物酶法分析技术
酶法分析（enzymatic method）是以酶为试剂测定酶促反应的底物、辅酶、 辅基、激活剂或抑制剂，以及利用酶促反应测定酶活性的一类方法。
1．测定NAD（P）H的方法
原理：监测340nm吸光度的变化可以反映NAD（P）H量的 变化，其变化与待测酶的含量正相关。
对象：以NAD（P）+或NAD（P）H为辅酶的脱氢酶类。例 如LD、G-6-PD、GLDH等 。