干细胞及其应用20151015
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19
自体骨髓 MSC 的优点
1. 取自自身，不受伦理、道德及法律方面的限制； 2. 无HLA限制，无GVHD和HVGD； 3. 可多向分化，在神经、心肌等细胞治疗方面具有广阔 的临床前景。 4. 可调节免疫反应，适宜于自身免疫病的调节。
自体骨髓 MSC 的缺点
1. 2. 3. 4. 过程痛苦； 老人和某些患者（如运动神经元病）无法扩增培养； 在某些疾病中使用自身MSC可能会加重（如肝硬化）； 生长慢。
下的全部有核细胞。
其中富含各系血细胞、造血干细胞、造血
各系祖细胞、血管内皮祖细胞和内皮细胞。
9 9
目前细胞治疗常用的细胞种类
二：单个核细胞（MNC）
从自体骨髓或异体脐血中获得，去除绝大部分红
细胞、血小板、巨核细胞和多核细胞，剩下的单
个核细胞。
其中富含胚胎样多能干细胞、造血干细胞、造
血各系祖细胞和血管内皮祖细胞。
洗涤
母 血 病 毒 检 测
分离华通胶
制 备 流 程
HUMSC
组织贴壁培养
传代培养
种子冻存
细胞复苏
微生物，支/衣原体、 内毒素检测
传代扩增 收获灌装 微生物检测，支/衣 原体、内毒素检测
MSC临床治疗机制
替代和修复死亡和受损伤的细胞
激活休眠和处于抑制状态的细胞 旁分泌作用（分泌趋化因子、神经营养因子、抗凋亡因子等）
自体骨髓 MSC 的优点
1. 取自自身，不受伦理、道德及法律方面的限制； 2. 无HLA限制，无GVHD和HVGD； 3. 可多向分化，在神经、心肌等细胞治疗方面具有广阔 的临床前景。 4. 可调节免疫反应，适宜于自身免疫病的调节。
自体骨髓 MSC 的缺点
1. 过程痛苦； 2. 老人和某些患者（如运动神经元病）无法扩增培养； 3. 生长慢。
21
HUMSC制备方法
脐带组织结构： 脐带由两条动脉、一条静 脉、粘液结缔组织（华通 胶，Wharton’s Jelly）及 羊膜上皮组织构成。 脐带血管内皮及内皮下、 羊膜上皮组织也能培养出 MSC样细胞，但细胞表型、 分化功能不够完整。华通 胶成为HUMSC的主要来源 部分。
脐带 采集
HUMSC制备方法
干细胞及其应用
高志买 江苏银丰鼎城生物工程有限公司 南京军区干细胞库
干细胞技术是医学发展的未来
《Science》于1999年和2000年连续两次 将干细胞技术评为世界十大科学成就之一
2
干细胞技术是医学发展的未来
3
干细胞基本知识
干细胞分类来源及功能
定义：
1、BECKER AJ, McCULLOCH EA, TILL JE.Cytological demonstration of the clonal nature of spleen colonies derived from transplanted mouse marrow cells。 Nature. 1963 Feb2;197:452-4. 2、SIMINOVITCH L, MCCULLOCH EA, TILL JE. THE DISTRIBUTION OF COLONY-FORMING CELLS AMONG SPLEEN COLONIES. J Cell Physiol. 1963 Dec;62:327-36.
干细胞(stem cells, SC)是指一类具 有自我复制能力(self-renewing)和 分化（differentiating）潜能的细 胞，在一定条件下，它可以分化成 多种功能细胞。
恩尼斯特· 莫科百度文库克和詹姆士· 堤尔脾脏来源细胞集落形成的发现开启了 干细胞研究的大门
根据发育过程分类
人 类 5～6 天 的 胚 胎 干 细 胞
18
脐带 MSC 的优点
1. 取材方便，易于收集、保存和冷冻。 2. 不受伦理、道德及法律方面的限制。 3. 由于胎血屏障，没有病毒污染，使其在神经、心肌等 细胞治疗方面具有广阔的临床前景。 4. 人脐带MSCs含量丰富，较为原始，分化能力强，可在 体外进行分离、培养，扩增迅速，且生物性能稳定， 多次传代扩增仍能保持旺盛功能，可以为临床提供充 足的细胞来源。 5. 人脐带MSCs不表达或低表达免疫排斥相关标记，免疫 原性低，是一类免疫缺陷细胞，不须经过严格配对使 用，异体移植无免疫排斥反应或反物较弱，适宜于不 同个体之间的移植，是细胞治疗的理想的工具细胞。
Radiologic views of patient 3. (A) A preoperative computed tomography (CT) image in the horizontal plane at the level of the nipples. Only a very thin fatty layer is observed around the mammary glands. (B) A horizontal magnetic resonance image (MRI) (T1 weighted) 24 months after surgery. Transplanted adipose tissues survived and formed thick layers around and under the mammary glands. (C) Mammograms 24 months after surgery
干细胞条件培养液的抗辐射损伤作用
干细胞抗衰老
衰老的本质
在生理上，衰老是人的诞生，即受精卵的形 成开始一直进行到老年死亡的个体发育史。 人体衰老所表现的组织器官结构退行性变化 和机能降低，其本质是细胞衰减，而细胞的 衰减又主要由干细胞衰减所致。 从临床医学的角度看，干细胞疗法可能很好 的改变许多疾病的治疗方法，特别是通过组 织和器官替代和修复治疗许多难治性疾病。
10 10
目前细胞治疗常用的细胞种类
三：CD34+细胞 （HSC & EPC）
从骨髓或脐血单个核细胞中经免疫磁珠法分选
的表达CD34糖蛋白的细胞。
其中造血干细胞和血管内皮祖细胞的纯度极高，
对实验室人员操作要求较高。
11 11
目前细胞治疗常用的细胞种类
四：间充质干细胞（MSC） 首先分离骨髓、脐带或脂肪组织的单个核细胞，经 过培养获得贴壁细胞群，呈梭形，体型较大，能分 化为多种细胞。 其中富含间质干细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、树 突状细胞和内皮细胞。还残留少量单个核细胞。对 实验室操作人员要求较高。
Preoperative (top) and postoperative (bottom) views at 24 months. A 30year-old woman underwent breast augmentation with cell-assisted lipotransfer (CAL) (310 ml in each breast). Her breasts were dramatically augmented with an increase in breast circumference difference by 8 cm at 24 months. The breast mounds were soft with no subcutaneous indurations.
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脐带 MSC 的优点
1. 取材方便，易于收集、保存和冷冻。 2. 不受伦理、道德及法律方面的限制。 3. 由于胎血屏障，没有病毒污染，使其在神经、心肌等 细胞治疗方面具有广阔的临床前景。 4. 人脐带MSCs含量丰富，较为原始，分化能力强，可在 体外进行分离、培养，扩增迅速，且生物性能稳定， 多次传代扩增仍能保持旺盛功能，可以为临床提供充 足的细胞来源。 5. 人脐带MSCs不表达或低表达免疫排斥相关标记，免疫 原性低，是一类免疫缺陷细胞，不须经过严格配对使 用，异体移植无免疫排斥反应或反物应较弱，适宜于 不同个体之间的移植，是细胞治疗的理想的工具细胞。
12
间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSC）
起源于中胚层，存在于骨髓、脐带、脐血、脂肪、乳牙 组织、胎盘等，具备干细胞的自我复制和多向分化性， 在发育的不同阶段和特定环境条件下，能分化为多种间 质起源的组织。
形态：在标准培养条件下呈贴壁生长 细胞表型：表达CD105, CD73和CD90,不表 达CD45, CD34, CD14或CD11b, CD79a或 CD19和HLA2DR; 分化功能：在体外至少能向成骨细胞、脂肪 细胞和软骨细胞分化。
Development of the ovary in BMT animal (A) compared to untreated control animal (B).
PLoS ONE 7(3): e32462.
脂肪来源MSC在丰胸上的应用
人数：40 平均输入脂肪体积270ml 平均乳房增大100-200ml 2个月后未见明显的萎缩 几乎所有人都对柔软且外观自然的丰胸效果 表示满意
Leukemia.2008；22：593-599.（IF 8.6)（同期刊发表两篇专家述
评）
Leukemia.2009；23：179-180.（IF 8.6)
髓芯减压联合干细胞治疗股骨头坏死
Indian J Orthop. 2009 Jan-Mar; 43(1): 40–
干细胞治疗骨不连
干细胞治疗卵巢早衰
胚胎干细胞
成体干细胞
根据功能性分类
全能干细胞 多功能干细胞 单功能干细胞
造 血 干 细 胞 胚 胎 干 细 胞
成 肌 细 胞
用于临床的干细胞来源
1 自体外周血
2 自体骨髓 3 胎盘及其附属物（脐带、脐血）
4 脂肪、牙周组织
目前细胞治疗常用的细胞种类
一：骨髓总有核细胞（NC）
从自体骨髓获得，去除大部分红细胞，剩
FACS检测干细胞的免疫表型
15
16
不同来源MSC生物特性比较
MSC来源
取材操作
细胞含量
增殖分化能力
免疫原 伦理争议 性 较高 较高 低 低 存在 存在 无 无
骨髓 脂肪 脐血 脐带组织
有创，痛苦 有创 无创 无创
较低 较高 极低 丰富
较低，受年龄影响 较强，受年龄影响 较强，无年龄影响 较强，无年龄影响
免疫调控机制（诱导免疫耐受和免疫调节）
促进细胞间电能力、电传导的恢复（分泌连接蛋白帮助细胞间连接、 促进离子通道的开放等）
MSC的适应症
自身免疫性疾病 神经系统疾病 消化系统疾病 骨骼及运动系统 疾病 股骨头缺血性坏 死、关节软骨病 变、骨折不愈合 及延迟愈合 系统性红斑狼疮、 共济失调、帕金 肝硬化、溃疡性 类风湿关节炎、 森、脊髓损伤、 结肠炎、克隆氏 系统性硬化病 脑萎缩、老年痴 病 呆、运动神经元 病、多发性硬化、 脑中风、脑瘫 心脑血管疾病 心肌梗塞、脑梗 塞、冠心病、缺 血缺氧性脑病 呼吸系统疾病 肺动脉高压、肺 纤维化 泌尿系统疾病 慢性肾小球炎、 肾病综合征、高 血压肾病、糖尿 病肾病及所致的 急慢性肾衰竭 亚健康
脂肪来源MSC的抗皱效果
Evaluation of wrinkles by replica analysis after ADSC injection. Control (A), 1 *103 cells (B), 1*104 cells (C), and 1*105 cells (D).
Representative clinical photography of fractional carbon dioxide laser-treated sites. The ADSC-CMtreated side shows less erythema and hyperpigmentation. FxCR 8 mJ with ADSC-CM (T1), FxCR 8 mJ with DMEM medium (C1), FxCR 16 mJ with ADSC-CM (T2), and FxCR 16 mJ with DMEM
内分泌系统疾病 糖尿病、下肢血 管性疾病、糖尿 病足
眼科疾病 视神经萎缩、黄 斑病变
美容
军事医学科学院307医院血液科陈虎主任
供者MSC联合HSC移植明显降低了 GVHD的发生率
临床结果 急性GVHD Grade II-IV 慢性GVHD MSC n=10 11.1% (1/9) 14.3% (1/7) Non-MSC n=15 53.3% (8/15) 28.6% (4/14)
自体骨髓 MSC 的优点
1. 取自自身，不受伦理、道德及法律方面的限制； 2. 无HLA限制，无GVHD和HVGD； 3. 可多向分化，在神经、心肌等细胞治疗方面具有广阔 的临床前景。 4. 可调节免疫反应，适宜于自身免疫病的调节。
自体骨髓 MSC 的缺点
1. 2. 3. 4. 过程痛苦； 老人和某些患者（如运动神经元病）无法扩增培养； 在某些疾病中使用自身MSC可能会加重（如肝硬化）； 生长慢。
下的全部有核细胞。
其中富含各系血细胞、造血干细胞、造血
各系祖细胞、血管内皮祖细胞和内皮细胞。
9 9
目前细胞治疗常用的细胞种类
二：单个核细胞（MNC）
从自体骨髓或异体脐血中获得，去除绝大部分红
细胞、血小板、巨核细胞和多核细胞，剩下的单
个核细胞。
其中富含胚胎样多能干细胞、造血干细胞、造
血各系祖细胞和血管内皮祖细胞。
洗涤
母 血 病 毒 检 测
分离华通胶
制 备 流 程
HUMSC
组织贴壁培养
传代培养
种子冻存
细胞复苏
微生物，支/衣原体、 内毒素检测
传代扩增 收获灌装 微生物检测，支/衣 原体、内毒素检测
MSC临床治疗机制
替代和修复死亡和受损伤的细胞
激活休眠和处于抑制状态的细胞 旁分泌作用（分泌趋化因子、神经营养因子、抗凋亡因子等）
自体骨髓 MSC 的优点
1. 取自自身，不受伦理、道德及法律方面的限制； 2. 无HLA限制，无GVHD和HVGD； 3. 可多向分化，在神经、心肌等细胞治疗方面具有广阔 的临床前景。 4. 可调节免疫反应，适宜于自身免疫病的调节。
自体骨髓 MSC 的缺点
1. 过程痛苦； 2. 老人和某些患者（如运动神经元病）无法扩增培养； 3. 生长慢。
21
HUMSC制备方法
脐带组织结构： 脐带由两条动脉、一条静 脉、粘液结缔组织（华通 胶，Wharton’s Jelly）及 羊膜上皮组织构成。 脐带血管内皮及内皮下、 羊膜上皮组织也能培养出 MSC样细胞，但细胞表型、 分化功能不够完整。华通 胶成为HUMSC的主要来源 部分。
脐带 采集
HUMSC制备方法
干细胞及其应用
高志买 江苏银丰鼎城生物工程有限公司 南京军区干细胞库
干细胞技术是医学发展的未来
《Science》于1999年和2000年连续两次 将干细胞技术评为世界十大科学成就之一
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干细胞技术是医学发展的未来
3
干细胞基本知识
干细胞分类来源及功能
定义：
1、BECKER AJ, McCULLOCH EA, TILL JE.Cytological demonstration of the clonal nature of spleen colonies derived from transplanted mouse marrow cells。 Nature. 1963 Feb2;197:452-4. 2、SIMINOVITCH L, MCCULLOCH EA, TILL JE. THE DISTRIBUTION OF COLONY-FORMING CELLS AMONG SPLEEN COLONIES. J Cell Physiol. 1963 Dec;62:327-36.
干细胞(stem cells, SC)是指一类具 有自我复制能力(self-renewing)和 分化（differentiating）潜能的细 胞，在一定条件下，它可以分化成 多种功能细胞。
恩尼斯特· 莫科百度文库克和詹姆士· 堤尔脾脏来源细胞集落形成的发现开启了 干细胞研究的大门
根据发育过程分类
人 类 5～6 天 的 胚 胎 干 细 胞
18
脐带 MSC 的优点
1. 取材方便，易于收集、保存和冷冻。 2. 不受伦理、道德及法律方面的限制。 3. 由于胎血屏障，没有病毒污染，使其在神经、心肌等 细胞治疗方面具有广阔的临床前景。 4. 人脐带MSCs含量丰富，较为原始，分化能力强，可在 体外进行分离、培养，扩增迅速，且生物性能稳定， 多次传代扩增仍能保持旺盛功能，可以为临床提供充 足的细胞来源。 5. 人脐带MSCs不表达或低表达免疫排斥相关标记，免疫 原性低，是一类免疫缺陷细胞，不须经过严格配对使 用，异体移植无免疫排斥反应或反物较弱，适宜于不 同个体之间的移植，是细胞治疗的理想的工具细胞。
Radiologic views of patient 3. (A) A preoperative computed tomography (CT) image in the horizontal plane at the level of the nipples. Only a very thin fatty layer is observed around the mammary glands. (B) A horizontal magnetic resonance image (MRI) (T1 weighted) 24 months after surgery. Transplanted adipose tissues survived and formed thick layers around and under the mammary glands. (C) Mammograms 24 months after surgery
干细胞条件培养液的抗辐射损伤作用
干细胞抗衰老
衰老的本质
在生理上，衰老是人的诞生，即受精卵的形 成开始一直进行到老年死亡的个体发育史。 人体衰老所表现的组织器官结构退行性变化 和机能降低，其本质是细胞衰减，而细胞的 衰减又主要由干细胞衰减所致。 从临床医学的角度看，干细胞疗法可能很好 的改变许多疾病的治疗方法，特别是通过组 织和器官替代和修复治疗许多难治性疾病。
10 10
目前细胞治疗常用的细胞种类
三：CD34+细胞 （HSC & EPC）
从骨髓或脐血单个核细胞中经免疫磁珠法分选
的表达CD34糖蛋白的细胞。
其中造血干细胞和血管内皮祖细胞的纯度极高，
对实验室人员操作要求较高。
11 11
目前细胞治疗常用的细胞种类
四：间充质干细胞（MSC） 首先分离骨髓、脐带或脂肪组织的单个核细胞，经 过培养获得贴壁细胞群，呈梭形，体型较大，能分 化为多种细胞。 其中富含间质干细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、树 突状细胞和内皮细胞。还残留少量单个核细胞。对 实验室操作人员要求较高。
Preoperative (top) and postoperative (bottom) views at 24 months. A 30year-old woman underwent breast augmentation with cell-assisted lipotransfer (CAL) (310 ml in each breast). Her breasts were dramatically augmented with an increase in breast circumference difference by 8 cm at 24 months. The breast mounds were soft with no subcutaneous indurations.
20
脐带 MSC 的优点
1. 取材方便，易于收集、保存和冷冻。 2. 不受伦理、道德及法律方面的限制。 3. 由于胎血屏障，没有病毒污染，使其在神经、心肌等 细胞治疗方面具有广阔的临床前景。 4. 人脐带MSCs含量丰富，较为原始，分化能力强，可在 体外进行分离、培养，扩增迅速，且生物性能稳定， 多次传代扩增仍能保持旺盛功能，可以为临床提供充 足的细胞来源。 5. 人脐带MSCs不表达或低表达免疫排斥相关标记，免疫 原性低，是一类免疫缺陷细胞，不须经过严格配对使 用，异体移植无免疫排斥反应或反物应较弱，适宜于 不同个体之间的移植，是细胞治疗的理想的工具细胞。
12
间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSC）
起源于中胚层，存在于骨髓、脐带、脐血、脂肪、乳牙 组织、胎盘等，具备干细胞的自我复制和多向分化性， 在发育的不同阶段和特定环境条件下，能分化为多种间 质起源的组织。
形态：在标准培养条件下呈贴壁生长 细胞表型：表达CD105, CD73和CD90,不表 达CD45, CD34, CD14或CD11b, CD79a或 CD19和HLA2DR; 分化功能：在体外至少能向成骨细胞、脂肪 细胞和软骨细胞分化。
Development of the ovary in BMT animal (A) compared to untreated control animal (B).
PLoS ONE 7(3): e32462.
脂肪来源MSC在丰胸上的应用
人数：40 平均输入脂肪体积270ml 平均乳房增大100-200ml 2个月后未见明显的萎缩 几乎所有人都对柔软且外观自然的丰胸效果 表示满意
Leukemia.2008；22：593-599.（IF 8.6)（同期刊发表两篇专家述
评）
Leukemia.2009；23：179-180.（IF 8.6)
髓芯减压联合干细胞治疗股骨头坏死
Indian J Orthop. 2009 Jan-Mar; 43(1): 40–
干细胞治疗骨不连
干细胞治疗卵巢早衰
胚胎干细胞
成体干细胞
根据功能性分类
全能干细胞 多功能干细胞 单功能干细胞
造 血 干 细 胞 胚 胎 干 细 胞
成 肌 细 胞
用于临床的干细胞来源
1 自体外周血
2 自体骨髓 3 胎盘及其附属物（脐带、脐血）
4 脂肪、牙周组织
目前细胞治疗常用的细胞种类
一：骨髓总有核细胞（NC）
从自体骨髓获得，去除大部分红细胞，剩
FACS检测干细胞的免疫表型
15
16
不同来源MSC生物特性比较
MSC来源
取材操作
细胞含量
增殖分化能力
免疫原 伦理争议 性 较高 较高 低 低 存在 存在 无 无
骨髓 脂肪 脐血 脐带组织
有创，痛苦 有创 无创 无创
较低 较高 极低 丰富
较低，受年龄影响 较强，受年龄影响 较强，无年龄影响 较强，无年龄影响
免疫调控机制（诱导免疫耐受和免疫调节）
促进细胞间电能力、电传导的恢复（分泌连接蛋白帮助细胞间连接、 促进离子通道的开放等）
MSC的适应症
自身免疫性疾病 神经系统疾病 消化系统疾病 骨骼及运动系统 疾病 股骨头缺血性坏 死、关节软骨病 变、骨折不愈合 及延迟愈合 系统性红斑狼疮、 共济失调、帕金 肝硬化、溃疡性 类风湿关节炎、 森、脊髓损伤、 结肠炎、克隆氏 系统性硬化病 脑萎缩、老年痴 病 呆、运动神经元 病、多发性硬化、 脑中风、脑瘫 心脑血管疾病 心肌梗塞、脑梗 塞、冠心病、缺 血缺氧性脑病 呼吸系统疾病 肺动脉高压、肺 纤维化 泌尿系统疾病 慢性肾小球炎、 肾病综合征、高 血压肾病、糖尿 病肾病及所致的 急慢性肾衰竭 亚健康
脂肪来源MSC的抗皱效果
Evaluation of wrinkles by replica analysis after ADSC injection. Control (A), 1 *103 cells (B), 1*104 cells (C), and 1*105 cells (D).
Representative clinical photography of fractional carbon dioxide laser-treated sites. The ADSC-CMtreated side shows less erythema and hyperpigmentation. FxCR 8 mJ with ADSC-CM (T1), FxCR 8 mJ with DMEM medium (C1), FxCR 16 mJ with ADSC-CM (T2), and FxCR 16 mJ with DMEM
内分泌系统疾病 糖尿病、下肢血 管性疾病、糖尿 病足
眼科疾病 视神经萎缩、黄 斑病变
美容
军事医学科学院307医院血液科陈虎主任
供者MSC联合HSC移植明显降低了 GVHD的发生率
临床结果 急性GVHD Grade II-IV 慢性GVHD MSC n=10 11.1% (1/9) 14.3% (1/7) Non-MSC n=15 53.3% (8/15) 28.6% (4/14)