第二章气相色谱-第三章高效液相色谱详解
高效液相色谱法
第三节 高效液相色谱的固定相 和流动相
粒很细（5~10m），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高 效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。
二、流动相
由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力， 并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影 响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是： （1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选
酸镁、分子筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的是活性炭。 极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸
性吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化
第四节 液—固色谱法
镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。 碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧和吡咯衍生物等。
各种吸附剂中，最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝。
级，存在一些分散的具有表面活性的 吸附中心 。因此，液
固色谱法是根据各组分在固定相上的吸附能力的差异进行分 离，故也称为液固吸附色谱。
吸附剂吸附试样的能力，主要取决于吸附剂的比表面积 和理化性质，试样的组成和结构以及洗脱液的性质等。组分 与吸附剂的性质相似时，易被吸附，呈现高的保留值；当组 分分子结构与吸附剂表面活性中心的刚性几何结构相适应时，
硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙 烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。固 定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相
第三节 高效液相色谱的固定相 和流动相
两类。 1. 表面多孔型固定相
它的基体是实心玻璃球，在玻璃球外面覆盖一层多孔活 性材料，如硅胶、氧化硅、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。 这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅 速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗 时能迅速达到平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄， 最大允许量受到限制。 2. 全多孔型固定相
高效液相色谱法简介
高效液相色谱的特点
高压——压力可达150～300 kg/cm2。色谱
柱每米降压为75 kg/cm2以上。
高速——流速为0.1～10.0 mL/min。 高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中
同时分离成份可达100种。
高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。
同时消耗样品少。
第二节
塑料块 Teflon
1 cm
工作电极 (Pt, Au, 碳糊)
e.电导检测器
电导检测器主要用于离子色谱的检测。 原理： 根据待测物在一些介质中电离后所产 生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质 的含量。 电导检测器的主要部件是电导池。其响应 受温度影响较大，因此需要将电导池置于恒温 箱中。另外，当 pH>7时，该检测器不够灵敏。 电导检测器不能用于梯度洗脱。
◆恒流泵
注射型泵------输出精确，无脉动，需更换溶剂而中断工作。
往复型泵------造价低廉，溶剂更换方便，但存在脉动。 （使用较多） 对流量变化敏感的检测器会有噪声 干扰，此时可连接一脉动阻尼器。
◆恒压泵--------压力恒定，但流量不恒定（现在已经较少使用）。
输液泵操作注意事项：
防止固体微粒进入泵体 流动相不应含有腐蚀性物质 防止溶剂瓶内的流动相被用完 不超过规定的最高压力 流动相一般应该先脱气
F=2.3QKI0εCl
Q为量子产率，K为荧光效率，ε为摩尔吸光系 数，l为光径长度。
F=KC
特点：选择性好，
专属型检测器，灵敏 度比紫外检测器高 （检测限10-10 g/ml） 对多环芳烃，维 生素 B 、黄曲霉素、 卟啉类化合物、农药 、药物、氨基酸、甾 类化合物等有响应；
c. 示差折光检测器
《仪器分析》作业题解答 2..
第二章气相色谱法1.简要说明气相色谱分析的基本原理借在两相间分配原理而使混合物中各组分分离。
气相色谱就是根据组分与固定相与流动相的亲和力不同而实现分离。
组分在固定相与流动相之间不断进行溶解、挥发（气液色谱），或吸附、解吸过程而相互分离，然后进入检测器进行检测。
2.气相色谱仪的基本设备包括哪几部分?各有什么作用?气路系统．进样系统、分离系统、温控系统以及检测和记录系统．气相色谱仪具有一个让载气连续运行管路密闭的气路系统．进样系统包括进样装置和气化室．其作用是将液体或固体试样，在进入色谱柱前瞬间气化，然后快速定量地转入到色谱柱中．19.有哪些常用的色谱定量方法?试比较它们的优缺点和使用范围?（1）．外标法：外标法是色谱定量分析中较简易的方法．该法是将欲测组份的纯物质配制成不同浓度的标准溶液。
使浓度与待测组份相近。
然后取固定量的上述溶液进行色谱分析．得到标准样品的对应色谱图，以峰高或峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标作峰高或峰面积对浓度的标准曲线．该曲线为一通过原点的直线．分析样品时，在上述完全相同的色谱条件下，取制作标准曲线时同样量的试样分析、测得该试样的响应讯号后．由标谁曲线即可查出其百分含量．此法的优点是操作简单，因而适用于工厂控制分析和自动分析；但结果的准确度取决于进样量的重现性和操作条件的稳定性．（2）．内标法：当只需测定试样中某几个组份．或试样中所有组份不可能全部出峰时，可采用内标法．具体做法是：准确称取样品，加入一定量某种纯物质作为内标物，然后进行色谱分析．根据被测物和内标物在色谱图上相应的峰面积(或峰高)]和相对校正因子．求出某组分的含量．内标法是通过测量内标物与欲测组份的峰面积的相对值来进行计算的，因而可以在—定程度上消除操作条件等的变化所引起的误差．内标法的要求是：内标物必须是待测试样中不存在的；内标峰应与试样峰分开，并尽量接近欲分析的组份．内标法的缺点是在试样中增加了一个内标物，常常会对分离造成一定的困难。
气相色谱与液相色谱
.一、分别原理：1.气相：气相色谱是一种物理的分别方法。
利用被测物质各组分在不一样两相间分派系数（溶解度）的渺小差异，当两相作相对运动时，这些物质在两相间进行频频多次的分派，使本来只有渺小的性质差异产生很大的成效，而使不一样组分获取分别。
2.液相：高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达′107Pa）;色谱柱是以特别的方法用小粒径的填料填补而成，进而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高敏捷度的检测器，可对流出物进行连续检测。
二、应用范围：1.气相：气相色谱法拥有分别能力好，敏捷度高，剖析速度快，操作方便等优点，可是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳固性差的物质都难于应用气相色谱法进行剖析。
一般对500℃以下不易挥发或受热易分解的物质部分可采纳衍生化法或裂解法。
2.液相：高效液相色谱法，只需求试样能制成溶液，而不需要气化，所以不受试样挥发性的限制。
关于高沸点、热稳固性差、相对分子量大（大于400以上）的有机物（些物质几乎据有机物总数的75%～80%）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分别、剖析。
据统计，在已知化合物中，能用气相色谱剖析的约占20%，而能用液相色谱剖析的约占70～80%。
三、仪器结构：1.气相：由载气源、进样部分、色谱柱、柱温箱、检测器和数据办理系统构成。
进样部分、色谱柱和检测器的温度均在控制状态。
柱箱：色谱柱是气相色谱仪的心脏，样品中的各个组份在色谱柱中经过频频多次分派后获取分别，进而达到剖析的目的，柱箱的作用就是安装色谱柱。
因为色谱柱的两头分别连结进样器和检测器，所以进样器和检测器的下端（接头）均插入柱箱。
柱箱能够安装各样填补柱和毛细管柱，并且操作方便。
色谱柱（样品）需要在必定的温度条件下工作，所以采纳微机对柱箱进行温度控制。
并且因为设计合理，柱箱内的梯度很小。
关于一些成份复杂、沸程较宽的样品，柱箱还可进行三阶程序升温控制。
高效液相色谱法教学【全】精选全文
例: 流动相极性变化对组分k’的影响
②更换色谱柱（改变N）
措施： a.选择长柱子(N=L/H) b.填料颗粒尽量小 c.低流速(溶质传质阻力小，峰扩展小) d.低的溶剂粘度(提高柱效)
高效液相色谱法
High Performance Liquid
Chromatography （HPLC）
前言:
HPLC是70年代以后发展最 快的一个分析化学分支，现 已成为生化、医学、药物、 化学化工、食品卫生、环保 检测等领域最常用的分离分 析手段。
我国：
开始仅为少数研究实验室拥有， 现很多的生产、研究、质检部门都拥有。 广泛应用于： 质量控制、分析化验、制备分离。 讲课目的：入门 教材：《实用色谱法》（詹益兴 编著） 学习要求：记好笔记，
ⅰ大分子，扩散系数小 ⅱ小分子，扩散系数大
5. 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液
相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略 不计，即 H = A + C u
• 降低传质阻力是提高 柱效主要途径。 •气相和液相Ｈ－ｕ区别
§１－４ 分离度 (Rs)
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
混合物最有效的分离、分析方法。 是一种分离技术。 混合物分离过程：试样中各组分在 固液两相间不断进行着的分配。 一相固定不动，称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定 相的液体，称为流动相。
液相色谱仪
高效液相色谱仪流程图
(1) 存在着浓度差，产生纵向扩散;
(2) 扩散导致色谱峰变宽，H↑(Ｎ↓)，分离变差; (3) B/u与流速有关：流速↓→ 滞留时间↑→ 扩散↑
高效液相色谱原理和操作详解
高效液相色谱我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表：鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。
I．概论 (2)一、液相色谱理论发展简况 (2)二、HPLC的特点和优点 (2)三、色谱法分类 (3)四、色谱分离原理 (3)II．基本概念和理论 (5)一、基本概念和术语 (5)二、塔板理论 (8)三、速率理论（又称随机模型理论） (9)III．HPLC系统 (10)一、输液泵 (11)二、进样器 (13)三、色谱柱 (14)四、检测器 (17)五、数据处理和计算机控制系统 (20)六、恒温装置 (20)IV．固定相和流动相 (20)一、基质（担体） (20)二、化学键合固定相 (22)三、流动相 (23)1．流动相的性质要求 (23)2．流动相的选择 (24)3．流动相的pH值 (24)4．流动相的脱气 (25)5．流动相的滤过 (25)6．流动相的贮存 (26)7．卤代有机溶剂应特别注意的问题 (26)8．HPLC用水 (26)V．HPLC应用 (27)一、样品测定 (27)二、方法研究 (27)附件：高效液相色谱法（HPLC）复核细则 (28)一、对起草单位的要求： (28)二、对复核单位的要求： (28)I．概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。
3--第二章色谱分析理论基础
当待分离组分随着载气进入色谱柱，组分就开始在两相间进行 分配，平衡后，再随着载气进入下一个塔板进行分配，平衡后 再进入下一个塔板。以此类推，从而不断达到分配平衡。
1.塔板理论基本假设
（1）在色谱柱中的每一小段长度H内，组分迅速达到分 配平衡，这一小段色谱柱称为理论塔板，其长度称为理论 塔板高度，简称板高，记为H； （2）载气不是连续通过色谱柱，而是脉冲式，每次进气 量为一个板体积； （3）试样开始时都加在0号塔板上，且试样沿柱纵向扩 散忽略不计； （4）分配系数在各塔板上是常数； （5）塔板与塔板之间不连续。
结论： 分配系数K是色谱分离中的一个重要参数。 两组分分配系数K相差越大，两峰分离的就越好。 不同物质的分配系数K相同时，组分不能分离。因此是色 谱分离依据。
3.分配比k
又叫容量比、容量因子。
在一定温度、压力下，在两相间达到分配平衡时，组分在 两相之间的质量比值，以k表示。
组分在固定相中的质量
k＝
分子扩散大。
3.传质阻力项C
组分在气相和液相两相间进行反复分配时，遇到阻力。传质阻 力C包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL 。液相传质阻力 大于气相传质阻力。
C =（Cg + CL）
气相传质过程是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程。
这一过程中试样组分将在两相间进 行质量交换，即进行浓度分配。有 的分子还来不及进入两相界面，就 被气相带走；有的则在进入两相界 面后又来不及返回气相。这样，使 得试样在两相界面上不能瞬间达到 分配平衡，引起滞后现象，从而使 色谱峰变宽。
（3）对于某确定的色谱分配体系，组分的分离最终决定于 组分在每相中的相对量，而不是决定于组分在每相中的相对 浓度，因此分配比是衡量色谱柱对组分保留能力的重要参数。 k越大，组分保留时间越长，k=0，组分的保留时间为死时间。
化验基础知识
第二章 有效数字的处理
• 三、有效数字运算法则
• 1.在加减法运算中，每数与它们的和或差的有 效数字的保留，以小数点后面有效数字位数最少 的为标准。在加减法中，因是各数值绝对误差的 传递，所以结果的绝对误差必须与各数中绝对误 差最大的那个相当。
• 例如：2.0375＋0.0745＋39.54 = ？
第三章 高效液相色谱法
• 注意事项 • 1.虽然泵能耐压6000PSI的压力，但不要使泵
处于4000PSI以上的压力为宜。 • 2.安装与拆卸色谱柱时应注意柱的连接方向，
千万不能接反。否则可能导致柱效降低，甚至损 坏色谱柱。 • 3.严禁开空泵。在无流动相通过时不要扳动进 样阀的操作杆，使用时要注意尽可能少扳动，以 免磨损内部的密封垫圈。 • 4.为了延长检测器灯源的使用寿命，在色谱泵 稳定后再打开检测器电源开关，分析结束后立即 关闭检测器。 • 5.应使用高纯度、高质量的溶剂和试剂。
第三部分 仪器分析法
• 第一章 比色法 • 一、原理与适用范围 • 在可见光区，除某些物质有吸收外，很
多物质本身并没有吸收，但可在一定条件 下加入显色试剂或经过处理使其显色后， 根据颜色深浅与浓度成正比关系，则可用 比色法测定含量。
第一章 比色法
• 二、仪器 • 可见分光光度计（或比色计）其应用波
三、注意事项
• 1.沉淀法测定，取供试品应适量。取样量多，生 成沉淀量亦较多，致使过滤洗涤困难，带来误差； 取样量教少，称量与各操作步骤产生的误差较大， 使分析的准确度较低。
• 2.不具挥发性的沉淀剂，用量不宜过量太多， 以过量20～30%为宜。过量太多，生成络合物， 产生盐效应，增大沉淀的溶解度。
挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合 物以与离子型化合物等的定性、定量分析。中国 药典主要用于药品的含量测定、有关物质检查、 杂质限度检查和鉴别等。 • 三、仪器 • 高效液相色谱仪主要由输液泵系统、进样器系 统、色谱柱、检测器、记录器、显示器与数据处 理机（或兼有组分收集系统）等组成。使用时应 按仪器的说明书进行操作。
色谱概论1-3章
气相色谱图
二、色谱流出曲线的意义： 从色谱图上可获得的信息有： 色谱峰的个数，可判断样品中所含组份的最少个数； 色谱峰的保留值，可进行定性分析； 色谱峰的峰高或峰面积，可进行定量分析；
色谱的保留值或区域宽度，是评价色谱柱分离性能的
色谱峰间距是固定相或流动相选择是否合适的依据。
依据；
a.死时间(tM) ：不与固定相作用的物质从进样到出现 峰极大值时的时间，它与色谱柱的空隙体积成正比。 由于该物质不与固定相作用，因此，其流速与流动相的 流速相近。如用热导池检测器时，从注射空气样品到空气峰 顶出现时的时间。 b.保留时间（tR）：试样从进样到出现峰极大值时的时
间。它包括组份随流动相通过柱子的时间tM和组份在固定相
第三节 色谱法的定义与分类
一、色谱法的定义
色谱法或色谱分析也称之为层析法，是一种物理化学的分 析方法，它利用混合物中各组分在两相间分配系数的差别，当 溶质在两相间做相对移动时，各物质在两相间进行多次分配， 从而使各组分得到分离。分离的仪器即色谱仪。
二、色谱法的分类
色谱法可按两相的状态及应用领域的不同分为两大类。 （一）按流动相与固定相的状态分类 1 ．气相色谱 气相色谱又可分为气固色谱和气液色谱，前者是以气体为 流动相，以固体为固定相的色谱，后者是以气体为流动相，以 液体为固定相的色谱。 2 ．液相色谱 液相色谱又可分为液固色谱和液液色谱，前者是以液体为 流动相，以固体为固定相的色谱；后者是以一种液体为流动相， 以另一种液体为固定向的色谱。
色谱分析
概论
第一章 绪论
第二章 色谱法的原理
第三章 色谱仪
第一章 绪论
1
色谱法的发展简史 色谱法与其他方法的比较和配合
第3章高效液相色谱分析
第3章高效液相色谱法一、判断题1、高效液相色谱适用于大分子，热不稳定及生物试样的分析。
（）2、高效液相色谱中通常采用调节分离温度和流动相流速来改善分离效果。
( )3、高效液相色谱中通用型检测器是荧光检测器。
( )4、液相色谱中常采用改变流动相的种类和配比的方法来提高柱的选择性。
( )5、在液相色谱中，速率方程中的涡流扩散项可以忽略不计。
( )二、选择题1、液相色谱的H-u曲线( )A、与气相色谱的H-u曲线一样，存在着H minB、H随流动相的流速增加而逐渐增加C、H随流动相的流速增加而下降D、H受u影响很小2、提高液相色谱分离效率的主要途径或措施是( )A、增加柱长，保持低温B、采用相对分子量较大的流动相，减少分子扩散C、采用相对低流速，有利于两相间的质传递D、采用细粒度键合固定相3、高效液相色谱仪与气相色谱仪比较，前者没有A、贮液器B、高压泵C、程序升温D、梯度淋洗装置4、在液相色谱中，最普遍使用的检测器是A、紫外光度检测器:B、荧光检测器C、差示折光检测器D、电导检测器5、有下列四种液相色谱类型，样品峰全部在溶剂峰之前流出的是( )A、液-液色谱法B、液-固色谱法C、离子排斥色谱法D、空间排阻色谱法6、液相色谱中，影响色谱峰展宽的主要因素是( )A、纵向扩散B、涡流扩散C、传质阻力D、柱前展宽7、对于能迅速溶于水的试样，宜选用的液相色谱是A、正相液液色谱B、反相液液色谱C、液固吸附色谱D、空间排阻色谱8、对溶于水或非水溶剂，分子大小有差别的试样，宜选用的液相色谱是A、液液色谱B、液固色谱C、空间排阻色谱D、离子交换色谱9、对于能溶于酸性或碱性水溶液的试样，宜选用的液相色谱是A、液液色谱B、液固色谱C、空间排阻色谱D、离子交换色谱10、在气相色谱法中可以忽略，而在高效液相色谱中则必须加以考虑的速率方程中的项是A、流动相传质项B、涡流扩散相C、固定相传质项D、分子扩散相。
高效液相色谱分类及工作原理
阳离子交换： 阳离子交换：
R
SO3 H
- +
+
M
+
R
SO3-M+
+ H+
阴离子交换：
R
NR3+Cl-
+
X
-
R
NR3+X-
+ Cl-
一般形式：
R一A＋B ＝ R－B＋A
达平衡时，以浓度表示的平衡常数（ 达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应 的选择系数）： 的选择系数）：
KB / A
[B]r [ A] = [B][ A]r
X + nSad = Xad + nS
达平衡时,有 达平衡时 有
Kad
[ X ad ][S] = n [ X ][Sad ]
n
其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂 为吸附平衡常数， 其中 为吸附平衡常数 上保留强，难于洗脱。 值小,则保留值弱 上保留强，难于洗脱。Kad值小 则保留值弱，易 值小 则保留值弱， 于洗脱。试样中各组分据此得以分离。 于洗脱。试样中各组分据此得以分离。Kad值可通 值可通 过吸附等温线数据求出。 过吸附等温线数据求出。
这类固定相的多孔层厚度小、孔浅， 这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相 对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大， 对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大， 渗透性好，装柱容易， 渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平 较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄， 衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄， 最大允许量受限制。 最大允许量受限制。
柱之内径
长度
填充材料粒度
使用压力
分离时间
㈡与气相色谱法比较，HPLC的优点 与气相色谱法比较， 的优点
第二章气相色谱分析
流出曲线方程
• C0为进样浓度；tR为保留时间； σ为标准偏差， C为时间t时在柱出口的浓度。
色谱柱长：L，
虚拟的塔板间距离：H， 色谱柱的理论塔板数：n， 则三者的关系为： n=L/H 理论塔板数与色谱参数之间的关系为：
保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配!
有效塔板数和有效塔板高度
• 单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。 • 用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。 • 组分在 tM 时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数 和有效塔板高度：
Cg 0.01k (1 k )
2
dp
2
Dg
液相传质阻力系数Cl为
由上式看出，固定相的液膜厚度df薄，组分在液相的 扩散系数D1大，则液相传质阻力就小。降低固定液的 含量，可以降低液膜厚度，但k值随之变小，又会使 C1增大。当固定液含量一定时，液膜厚度随载体的比 表面积增加而降低，因此，一般采用比表面积较大的 载体来降低液膜厚度，但比表面太大，由于吸附造成 拖尾峰，也不利分离。虽然提高柱温可增大Dl，但会 使k值减小，为了保持适当的Cl值，应控制适宜的柱 温。
2 色谱流出曲线及有关术语
1)．流出曲线和色谱峰
2)、基线
是柱中仅有流动相通过时，检测器响 应讯号的记录值，稳定的基线应该是一条 水平直线。
3)、峰高
色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h 表示。
4)、保留值
（1）时间表示的保留值
保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极 大值时所需的时间； 死时间（tM）：不与固定相作用的气体（如空气 ）从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时 间; 调整保留时间（tR ＇）：tR＇= tR－tM
滞留因子（retardation factor）：
仪器分析笔记 《高效液相色谱分析》
第二章高效液相色谱分析§2.1 高效液相色谱法概述（掌握）2.1.1 高效液相色谱法的特点1、与经典液相色谱法比较2、与气相色谱法比较3、高效液相色谱法的发展A、固定相的变化填料粒度减小，粒型规整；键合型固定相；整体结构固定相；亲和固定相。
目前，出现使用1.0µm填料的超高压液相色谱。
B 、流动相变化目前，出现120～220℃超热水为流动相、FID 和FPD 检测器的HPLC 。
C 、全新方法剪切流路液相色谱；不同分离机制组合的多维液相色谱以及HPLC 与MS 、NMR 、IR 联用的多维液相色谱法。
4、高效液相色谱法的特点①高压 ：采用高压输液设备，（150~350）× 105 Pa ②高速：分析速度快； ③高效：柱效很高。
（n>30000），可以在数分钟内完成数百种物质的分离；④高灵敏度：10—9g （UV ）；10—11g （荧光检测）。
5、高效液相色谱法的局限①溶剂用量太大；②缺乏诸如气相色谱使用的TCD 、FID 通用型检测器； ③不能替代气相色谱法，难分离化合物(柱效10万以上)，必须使用毛细管气相色谱法进行分离； ④不能替代中、低压柱色谱法，一些生物活性化合物不能承受200kPa ～1MPa 压力。
§2.2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素（了解）2.2.1 影响色谱峰的扩展的因素高效液相色谱法的基本概念及理论基础，与气相色谱法是基本一致的，其区别主要在于流动相的不同。
现根据速率理论及色谱峰扩展及色谱分离的影响讨论如下：高效液相色谱的范氏方程：2222m p sm p s fd m p mm s C d C d C d C D H d u u u D D D λ⎛⎫=++++ ⎪ ⎪⎝⎭ 若将上式简化，可写作：BH A Cu u=++这与气相色谱的速率方程形式是基本一致的，主要区别在于纵向扩散项可以忽略不计，影响柱效的主要因素是传质项。
色谱分析课件
通用显色剂
定性分析
1. 与标准对照品在三种不同的展开剂中展开 (加熔点)；
2. 制备TLC，将待定性化合物分离后，刮下、 洗脱，再波谱分析；
3. TLC与其它技术联用
定量分析
1. 间接定量（洗脱测定法）； 2. 直接定量（薄层扫描法）
薄层扫描法：以一定波长的光照射展开后 的薄层色谱板上被分离组分的斑点，测定 斑点对光的吸收强度或所发出的荧光强度， 进行定量分析的方法。 薄层吸收扫描法 薄层荧光扫描法
色谱法的特点
（1）分离效率高 复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。
（2） 灵敏度高 可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。
（3） 分析速度快 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。
（4） 应用范围广 气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。 液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。
GC的特点
1. 分离效率高（填充柱上千块塔板；开管柱 106块塔板）
2. 分析速度快 3. 样品用量少（检测限低，高灵敏检测器） 4. 缺点：（约20%样品适用） A. 样品须能气化（350度下有一定的挥发性） B. 热稳定性要好 C. 定性困难
第二节 气相色谱术语、理论
1. 气相色谱流出曲线 2. 分配系数与容量因子 3. 塔板理论 4. 速率理论 5. 分离度 6. 基本分离方程
• 添加剂
荧光指示剂
硝酸银溶液
制板、活化
点样
1.溶剂对样品的溶解度适中； 2.溶剂沸点适中； 3.样品浓度适中； 4.原点位置应在展开剂液面上； 5.定性分析:内径0.5mm管口平整的毛细管
第3章+高效液相色谱分析
不同待测离子与反离子形成离子对的能力不同， 分配系数存在差异，导致在固定相中滞留时间不同， 从而实现色谱分离。
离子对的容量因子k可表示为：
VS 1 k DX K XY [Y ]水相 VM
则组分的保留时间：
L 1 t R (1 K XY [Y ]水相 ） u
分析实例：
§3-4 液相色谱的流动相
当固定相选定时，流动 相的种类、配比能显著地影 响分离效果，因此流动相的 选择很重要。
1.选择流动相时应注意的几个问题
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相（防止微量杂质长 期累积，损坏色谱柱和使检测器噪声增加) 。 （2）避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂。 （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度。 （4）溶剂的黏度小些为好。 （5）流动相同时还应满足检测器的要求。比如当使用 紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。
子或反离子)，加到流动相中与溶质离子结合形成疏
水性离子对，从而控制溶质离子的保留行为。 阴离子分离：对离子常用烷基铵类，如氢氧化十 六烷基三甲铵。 阳离子分离：对离子常用烷基磺酸(己烷磺酸钠)。 反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C18 柱)， 含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样
离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-。
固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原理：按分子大小分离。小分子 可以扩散到凝胶空隙中通过，出 峰最慢；中等分子只能通过部分 凝胶空隙，中速通过；而大分子 被排斥在外，出峰最快；溶剂分 子小，故在最后出峰。 相对分子质量在100～105范围 内的化合物按质量分离。
空间排阻色谱固定相
（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构。 水为流动相。适用于常压排阻分离。 （2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶。 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性 溶剂 （3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等；如可控孔径玻璃微球，具有 恒定孔径和窄粒度分布。 化学稳定性，热稳定性好，机械强度大，流动相性质 影响小，可在较高流速下使用。
高效液相色谱分析
2. 流动相类别
按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：底剂和淋洗剂。 常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 3.常用溶剂的极性顺序：
水(最大) > 甲酰胺> 乙腈> 甲醇> 乙醇> 丙醇> 丙酮> 二氧六环> 四氢呋喃> 甲乙酮> 正丁醇> 乙酸乙酯> 乙醚> 异丙醚> 二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环 己烷>己烷>煤油(最小)
机理： 由于键合固定相不能全部覆盖具有吸附能力的载体，所以既不是典型的液液分配过程，也不是全部吸附过程，而是 双重机理兼而有之。
第八页，共29页。
四、 离子交换色谱 固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；
流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用 碱性水溶液； 基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离 子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；
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3. 选择流动相时应注意的几个问题 （1）流动相纯度 尽量使用高纯度试剂作流动相。 （2）应避免使用会引起柱效损失或者保留特性变化的溶剂。
（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度。
（4）流动相同时还应满足检测器的要求。 （5）溶剂的粘度小些为好，否则降低组分的扩散系数，柱效下降。
第二十四页，共29页。
梯度淋洗装置
外梯度:
利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶 剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色 谱柱。
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3. 保留值
1)死时间(tM) ：不与固定相作用的物质 （空气）从进样到出现峰极大值时的时间 ，它与色谱柱的空隙体积成正比。
2)保留时间tR：试样从进样到出现峰极大值 时的时间。它包括组份随流动相通过柱子的 时间tM和组份在固定相中滞留的时间。
温度控制
温度是色谱分离条件的重要选择参数；
气化室、分离室、检测器三部分在色谱仪 操作时均需控制温度；
气化室：保证液体试样瞬间气化而不分解 （一般比柱温高10-50 C）；
检测器：保证被分离后的组分通过时不在 此冷凝，而且温度影响检测器灵敏度和稳定 性，一般控温精度要求由于＋0.1 C
分离室：准确控制分离需要的温度。当试样为 沸点范围很宽的混合物时，分离室温度需要按一定 程序控制温度变化（程序升温），各组分在最佳温 度下分离，从而改善分离效果，缩短分析时间。
液-固色谱法
液相色谱法
液-液色谱法
2.按固定相的状态分类： 柱色谱：固定相装在色谱柱中； 纸色谱：利用滤纸作载体，吸附在纸上 的水作固定相； 薄层色谱：将固体吸附剂在玻璃板或塑
料板上制成薄层作固定相。
3.按分离原理分类：
1)吸附色谱法：利用吸附剂（固定相一 般是固体）表面对不同组分吸附能力的差别 进行分离的方法；
3)调整保留时间tR'：某组份的保留时间扣除 死时间后的保留时间，它是组份在固定相中 的滞留时间。即
tR' tR tM
4)死体积VM：色谱柱管内固定相颗粒间空隙 、色谱仪管路和连接头间空隙和检测器间隙 的总和。忽略后两项可得到
VM tM qv,0 qv,0 载气体积流量
tM — 死时间
5) 保留体积VR：指从进样到待测物在柱后 出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。
Column
Detector
Injection valve and gasifying
W
Data station (Recorder)
载气系统 进样系统
色谱柱
检测系统
温度控制 记录处理系统
1. 气路系统
包括气源、净化干燥管和载气流速控制；
1-载气钢瓶； 2-减压阀； 3-净化干燥管； 4-针形阀； 5-流量计; 6-压力表；
三.色谱分类
色谱分析法有很多种类，从不同的 角度出发可以有不同的分类方法。
1.从两相的状态分类： 色谱法中，流动相可以是气体，也可
以是液体，由此可分为气相色谱法（GC）和 液相色谱法（LC）。固定相既可以是固体， 也可以是涂在固体上的液体，分类情况如下 ：
气-液色谱法
气相色谱法
色
气-固色谱法
谱
法
4. 检测系统
色谱仪的眼睛，
通常由检测元件、放大器、显示记录三部分组成；被 如热导检测器)或质量(质量型，如氢火焰离子化检测器)随
时间的变化，转化成相应电信号，经放大后记录和显示， 给出色谱图；
广普型——对所有物质均有响应；热导检测器；
专属型——对特定物质有高灵敏响应；电子俘获检测器；
5. 记录和数据处理系统
色谱工作站
五、色谱流出曲线
从载气带着组分进入色谱柱起就用检测 器检测流出柱后的气体，并记录信号随时间 变化的曲线，此曲线就叫色谱流出曲线。
六、色谱术语
1. 基线：在实验条件下，色谱柱后仅有纯流动 相进入检测器时的流出曲线称为基线。基线在稳 定的条件下应是一条水平的直线。它的平直与否 可反应出实验条件的稳定情况。
2)分配色谱法：利用不同组分在两相 间的分配系数的差别进行分离的方法。
3) 离子交换色谱：利用溶液中不同离子 与离子交换剂间的交换能力的不同而进行分 离的方法。
4)空间排斥（阻）色谱法：利用多孔性物 质对不同大小的分子的排阻作用进行分离的 方法。
四、气相色谱仪的工作过程
气相色谱流程图
Flow or pressure controller
第二章 气相色谱分析
Chapter two
Gas Chromatography (GC)
§2－1 气相色谱法概述
一.概述
分离、分析混合 物的最有效方法。
俄国植物学家茨 维特在1906年使用 的装置是色谱原型 装置，如右图。
现在的色谱法早已不局限于色素的分 离，其方法也早已得到了极大的发展，但 其分离的原理仍然是一样的，仍然称它为 色谱分析。
色谱法是一种分离技术，试样混合物的分离过程 也就是试样中各组分在色谱分离柱中两相间不断进行 着的分配过程。其中的一相固定不动，称为固定相； 另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体 或液体），称为流动相。
与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分 的高效分离与灵敏检测。
两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础。分离 的动力为各组分在性质和结构上的差异导致其与固定相 之间作用力有强弱。
VR tRqv，0
tR— 保留时间
6)调整保留体积VR'：某组份的保留体积扣 除死体积后的体积。
VR'
VR
VM
t
' R
q
v,0
tR— 调整保留时间
7)相对保留值r2,1（选择因子）：组份2的 调整保留值与组份1的调整保留值之比。
气路系统将样品载入色谱柱分离后进入检测 器测定；
气路系统要求气密性好、载气流量稳定和测 量流量准确；
气相色谱常用的载气为氮气、氢气和氦气等。 载气的选择主要由检测器性质及分离要求所 决定；
载气在进入色谱仪前必须经过净化处理；去 除载气中的水、有机物等杂质（依次通过分 子筛、活性炭等）；
载气流量由稳压阀或稳流阀调节控制。
2、进样系统
进样装置：进样器+气化室；
进样器：液体样品的进样通常采用微量注射器，气 体样品的进样通常采用医用注射器或六通阀。 气化室：
气化室的作用是将液体或固体样品瞬间气化而不 分解,后进柱分离
要求: 热容量较大, 死体积较小,无催化效应
3. 分离系统
色谱柱：色谱仪的核心部件。 柱材质：不锈钢管或玻璃管，内径3-6毫米。长度 可根据需要确定。 柱填料：粒度为60-80或80-100目的色谱固定相。 液-固色谱：固体吸附剂；液-液色谱：担体+固定液 柱制备对柱效有较大影响，填料装填太紧，柱前压 力大，流速慢或将柱堵死，反之空隙体积大，柱效低。