微核检测技术郭共23页
微核试验——精选推荐
微核试验⼩⿏⾻髓中嗜多染红细胞（PCE）微核实验简介微核（micronucleus），与染⾊体损伤有关，是染⾊体或染⾊单体的⽆着丝点断⽚或纺锤丝受损⽽丢失的整个染⾊体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成⼀个或⼏个规则的次核，包含在⼦细胞的胞质中，⽐主核⼩，故称微核。
故微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产⽣的染⾊体完整性改变和染⾊体分离改变这两种遗传学终点。
实验⽬的1.学习和掌握⼩⿏⾻髓嗜多染红细胞（PCE）微核测定⽅法2.了解细胞染⾊体损伤情况，掌握检测断裂剂和部分⾮整倍体致突变剂的测定⽅法3.进⼀步熟练制⽚和镜检操作器材与试剂1.器材⼿术剪、⽆齿镊、⼩型弯⽌⾎钳、载玻⽚、玻璃染⾊缸、定时钟、晾⽚架、显微镜（带油镜）、注射器及针头、⼲净纱布、乳头吸管、玻璃铅笔、电吹风机2.试剂甲醇、Giemsa储备液、磷酸盐缓冲液（PH6.8）环磷酰胺操作步骤1.试验动物及处理（1）动物选择：⼀般选⽤⼤⼩⿏，⼩⿏最常⽤，18-20g，每组10只，雌雄各半。
（2）染毒途径：根据研究⽬的或受试物性质不同，原则上可尽量采⽤⼈类接触受试物的途径：通常采⽤灌胃法和腹腔注射。
（3）染毒次数：多次染毒法（每天染毒⼀次，连续4天，第五天取样）或两次染毒法（处死前30h+处死前6h）（4）剂量及对照选择据受试物的LD50，以1/2LD50为最⾼剂量组，下设3-4个剂量组。
同时设⽴阳性（环磷酰胺）和阴性对照（溶剂组）2.⾻髓细胞制⽚和涂⽚：最后⼀次染毒后，在确定时间脱颈椎处死动物，迅速剪取其胸⾻，剔去肌⾁，⽤⼲净纱布擦拭，剪去每节⾻骺端，⽤⼩型弯⽌⾎钳挤出⾻髓液，点在载玻⽚⼀端预先滴好的⼀滴⼩⽜⾎清中。
混匀后推⽚。
长度为2-3cm。
3.固定：将推好晾⼲的⾻髓⽚放⼊染⾊缸中，⽤甲醇固定15min,取出晾⼲。
4.染⾊：Giemsa应⽤液染⾊15min.冲洗染⾊液，晾⼲。
5.观察计数：先以低倍镜、⾼倍镜粗检，选择细胞分布均匀、疏密适度、形态完整、染⾊良好的区域，再在油镜下按⼀定顺序进⾏PCE和微核计数。
微核测试实验报告
微核测试实验报告1. 引言微核测试是计算机科学中一项非常重要的实验之一。
作为操作系统的核心组件，微核系统承担着管理系统资源、实现进程调度等关键任务，因此对微核系统进行充分的测试和验证至关重要。
本实验旨在通过对微核系统的功能进行测试，对微核系统的性能和稳定性进行评估。
2. 实验环境- 硬件环境：Intel Core i5处理器、8GB内存、256GB固态硬盘- 软件环境：Ubuntu 18.04操作系统、微核系统版本1.03. 实验目标通过对微核系统进行一系列的功能测试和性能测试，验证其在不同场景下的表现，并分析系统的稳定性。
具体的实验目标如下：1. 验证微核系统的基本功能是否正常，包括进程管理、内存管理、文件系统等；2. 分析系统在多任务调度的情况下的性能表现，包括任务切换速度、资源利用率等；3. 测试微核系统在面对异常情况（如内存溢出、文件系统错误等）时的处理能力；4. 比较微核系统与其他核心组件的性能差异，分析其优缺点。
4. 实验步骤4.1 功能测试首先，我们对微核系统的基本功能进行了全面的测试。
通过编写一系列的测试用例，包括创建、删除进程，读取、写入文件，分配和回收内存等，对系统进行了功能上的验证。
测试结果显示，微核系统在这些基本功能上表现出色，所有功能均正常工作。
4.2 性能测试为了对微核系统的性能进行测试，我们设计了一组多任务调度的测试用例。
测试用例包括创建多个任务，设置不同的执行时间和优先级，并通过观察系统的响应时间和任务切换速度来评估系统的性能。
实验结果表明，微核系统在多任务调度的情况下表现出较高的性能，并能有效利用系统资源。
4.3 异常情况测试为了测试微核系统在面对异常情况时的处理能力，我们模拟了一些可能的异常场景，如内存溢出、文件系统错误等。
通过观察系统的反应和错误处理机制，我们评估了系统在面对这些异常情况时的稳定性和可靠性。
实验结果显示，微核系统能够及时检测到这些异常情况，并采取相应的措施进行处理，不会对整个系统造成严重影响。
微核试验的原理
微核试验的原理随着科技的发展，人类对于原子核的研究也越来越深入。
微核试验就是其中的一种方法。
所谓微核试验，就是通过加速器将高能粒子轰击目标核，使其发生裂变或者反应，进而研究原子核的性质和行为。
本文将从微核试验的基本原理、实验装置、数据分析以及应用领域等方面进行介绍。
一、微核试验的基本原理微核试验的基本原理是利用高能粒子与目标核的相互作用，研究原子核的性质和行为。
高能粒子可以通过加速器进行加速，使其具有足够的能量与目标核发生相互作用。
目标核可以是稳定核或者放射性核，也可以是天然存在的核素或者是通过合成得到的核素。
高能粒子与目标核的相互作用包括以下几种：1.弹性散射当高能粒子与目标核发生弹性散射时，粒子的能量和动量不变。
这种相互作用可以用来研究原子核的大小和形状。
2.非弹性散射当高能粒子与目标核发生非弹性散射时，粒子的能量和动量会发生变化。
这种相互作用可以用来研究原子核的激发态和衰变行为。
3.核反应当高能粒子与目标核发生核反应时，会产生新的核素和粒子。
这种相互作用可以用来研究原子核的结构和核反应过程。
二、微核试验的实验装置微核试验的实验装置主要包括加速器、目标核、探测器和数据采集系统等。
1.加速器加速器是微核试验的核心设备，用于将粒子加速到足够高的能量。
常用的加速器包括静电加速器、电子直线加速器、质子循环加速器等。
2.目标核目标核是微核试验的实验对象，可以是稳定核或者放射性核，也可以是天然存在的核素或者是通过合成得到的核素。
目标核的选择与实验目的密切相关。
3.探测器探测器用于探测高能粒子与目标核的相互作用产生的粒子和辐射。
常用的探测器包括闪烁体探测器、半导体探测器、气体探测器等。
4.数据采集系统数据采集系统用于采集探测器探测到的信号，并将其转化为数字信号进行处理。
数据采集系统的设计和构建对于实验结果的准确性和可靠性有着至关重要的作用。
三、数据分析微核试验的数据分析主要包括对探测器探测到的信号进行处理和分析。
微核试验讲义
石河子大学教案续页（内容与进程）
溶解并定容至1000m1。
(3)pH6.8的磷酸盐缓冲液：取l/15mol/L的磷酸二氢钾溶液50.40ml和l/
15mol/L的磷酸氢二钠溶液49.60m1，两者混合均匀即成。
3。阳性对照物环磷酰胺或丝裂霉素C。
(五)操作步骤
1.试验动物及处理
(1)动物选择：一般常用的试验动物为大、小鼠。以小鼠使用最为广泛，要求体重18～20g，7～12周龄。每组小鼠数量10只，雌雄各半。
2.试剂
甲醇(分析纯)、甘油(分析纯)、小牛血清、生理盐水、Giemsa储备液(取Giemsa染料1g，甘油66m1，甲醇60m1。先将染料置于研钵内，加入少量甘油混合研细，再分次倾人剩余的甘油继续研磨，然后转移至烧杯内，盖上玻璃表面皿，置，60℃水浴2h，取出待冷却后加入甲醇，混合静置2周后，过滤于棕色瓶内，存放阴凉处。该储备液存放的时间越长，染色效果越好。临用时用pH6.8的磷酸盐缓冲液配制为10％的应用液)、pH 6.8的磷酸盐缓冲液。
通过本次实验，学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞(PCE)微核测定方法。
（二）原理
微核试验是用于染色体损伤和干扰细胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。微核是指存在于细胞中主核之外的一种颗粒，大小相当于细胞直径的1／20—1／5，呈圆形或杏仁状，其染色与细胞核一致，在间期细胞中可以出现一个或多个。一般认为微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。所以，微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。
实验八 植物微核检测技术23页PPT文档
以染色体为指标的“三致效应”的检测方 法：
1. 经典的染色体畸变分析方法； 2. 姐妹染色单体互换测试法； 3. 微核测试法。
（1）断片 （2）双着丝点 （3）环
微核率与用药剂量或辐射积累效应呈正相关。
实验材料：
毛葱（Allium fistulosum）根尖。
实验器材：
显微镜，冰箱，水浴锅，分析天平，剪刀，镊子， 刀片，载玻片，盖玻片，滤纸，量筒，滴瓶，酒精 灯，指管等。
试剂
1. 环磷酰胺（CP） 2. 卡诺氏（Carnoy‘s）固定液 3. 希夫（Schiff‘s）试剂 4. 45%醋酸 5. 1 mol/L盐酸
微核检测记录表
细胞数
微核数
微核千分率
作业和思考题：
1. 叙述微核形成原理。 2. 统计微核细胞数，计算微核细胞千分率。 3. 画出具有微核的细胞示意图。
注意事项：
1. 处在分裂过程中的细胞对不同理化因素的 敏感时期和敏感剂量是不同的，需要进行 试验摸索。
2. 观察与识别微核要准确，统计细胞数至少 1000个/3张片。
4. 镜检及观察，检查400个细胞/片。
结果及分析：
1. 细胞学观察：
在细胞分裂间期，微核 呈圆形或椭圆形，游离 于主核之外，大小在主 核的1/3以下，折光率 及细胞化学反应性质和 主核一样。
毛葱根尖微核
2. 微核率计算
微核率（MCN%o）=
微核数 细胞数
×1000%o
片号 第1片 第2片 第3片 总计
环境因素造成的遗传毒理效应： “三致效应”
诱变物质的微核检测技术
姓名系年级学号日期科目遗传学实验题目诱变物质的微核检测技术同组者诱变物质的微核检测技术摘要：微核是间期细胞的细胞质中一个或多个圆形或杏仁状结构。
核仁的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具有合成DNA的能力。
微核（micronucleus），与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质中，比主核小，故称微核。
微核是染色体畸变的另一种表现方式。
本次试验意在了解微核检测的方法和意义，通过检测评价环境中常见物质的诱变情况。
影响微核产生的因素：遗传毒物①断裂剂——可诱发染色体断裂。
②非整倍剂——可使染色体和纺锤体联结发生障碍或纺锤体功能受损。
引起染色体断裂的因素分为物理因素和化学因素。
本次实验所用的诱变剂为叠氮化钠NaN3，不同浓度NaN3处理对大蒜生长的影响随NaN3浓度增加，微核发生率增加。
微核发生率同作用因子的剂量呈正相关。
可用简单的微核技术来反应诱变物质对生物的遗传危害。
引言19世纪末，Howell与Jolly分别在猫和大鼠外周血中发现一种小体，命名为Howell-Jolly小体，并且发现这种小体也存在于恶性贫血患者外周血中。
这一小体便是今日被称之为微核的小体。
1959年，Evans等将蚕豆根端细胞暴露在电离辐射下，观察到辐射诱导微核形成效应，并据此间接推断微核来源于辐射诱导的染色体异常。
1970，年Boiler和Sehmid以中国金黄地鼠为材料，观察了抗肿瘤药三亚胺给予后，骨髓与外周血细胞学的变化，并且提出用本来无核的外周血嗜多染红细胞中的微核发生率来作为微核试验的基本指标，并正式命名为微核实验。
70年代初，Matter和Schmid首先用啮齿类动物骨髓细胞微核率来测定疑似有诱变活力的化合物，建立了微核测定法。
此后至70年代中期，Sehmid以及Heddle研究小组的工作，全面奠定了微核实验的理论及应用基础。
微核检测试验
诱变物质的微核检测摘要微核（micronucleus, 简称MCN），也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。
在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。
一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的。
微核往往是各种理化因子，如辐射、化学药剂对分裂细胞作用而产生的，而且与细胞所受到的不良刺激成正相关，因此可以通过观察植物组织中细胞的微核发生率来确定细胞所受到的污染情况。
1.引言微核（micronucleus, 简称MCN），也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。
微核往往是各种理化因子，如辐射、化学药剂对分裂细胞作用而产生的。
在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。
微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。
一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的。
有实验证明，整条染色体或几条染色体也能形成微核。
这些断片或染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。
当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即形成了微核。
已经证实，微核率的大小是和作用因子的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点与染色体畸变的情况一样。
所以许多人认为可用简易的周期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。
含有微核的细胞数占观察细胞总数的比率称为微核细胞率（千分率），简称微核率。
①微核细胞率可以用来反映遗传物质受损伤的程度；②在一定的剂贝范困内，微核率与环坡因子的剂量呈正相关③人们常用微核率来反映环境有害毒物的污染程度：一般认为，微核率在10‰以下时无污染；10-18‰时，有轻度污染；18-30‰时，有中度污染；>30‰，有中度污染。
微核检测技术灵敏度高，技术简单，在辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、食品添加剂的安全评价，以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面都有所应用。
《微核检测技术郭》PPT课件
哈尔滨师范大学 生命科学与技术学院 遗传教研室 2010年3月
精选ppt
1
背景知识——毒理遗传学：
或称遗传毒理学，用遗传学方法研究环境因素 对遗传物质的损害及其毒理效应的遗传学分支 学科，提供了许多迅速、准确、简便的方法来检
测各种环境因素对遗传结构的危害，以便采取措 施，减少这些因素对人类的危害。
3. 空间诱变：宇宙系列生物卫星、科学返回卫星、空 间站及航天飞机等空间飞行器进行搭载。
4. 复合诱变：两种或多种诱变剂的先后使用。
精选ppt
3
环境因素造成的遗传毒理效应： “三致效应”
1. 突变形成：环境因素诱发生殖细胞的基因突变（点 突变）和染色体畸变，从而造成子代遗传性疾病发 生频率的增加，
2. 动物细胞：小鼠骨髓细胞、外周血淋巴细胞等。
3. 应用多种人类细胞：口腔粘膜细胞、鼻腔粘膜细胞、 头皮毛囊细胞、痰液细胞等检测微核、染色体畸变、 姐妹染色单体互换率等指标，对人类接触遗传毒物 的剂量及效应进行评价。
精选ppt
8
微核测试法： （micronucleus test, MNT）
20世纪70年代初期由Matter和Schmid 首先建立了一种简便、快速、评价客观地检 测来自环境中的各种理化及生物因子对机体 产生潜在的遗传损伤方法，即用哺乳动物骨 髓嗜多染红细胞微核（polychromatic erythrocyte, PCE）出现率的实验方法。
2. 癌形成：环境因素诱发体细胞基因突变或在亲代遗 传的突变形成的背景上诱发体细胞突变，引起的体 细胞恶性转化为癌细胞的作用；
3. 致畸效应：环境因素作用于发育中的胚胎细胞干扰 了基因的正常作用，从而影响到胚胎细胞分化和器 官系统的发育而导致畸胎的发生，也包括环境因素 诱发亲代生殖细胞的基因突变或染色体畸变引起畸 胎的作用。
微核检测技术
微核检测技术一、目的1. 了解微核测试原理和毒理遗传学意义。
2. 学习小鼠骨髓细胞和蚕豆根尖的微核测试技术。
二、原理微核（micronucleus, 简称MCN），也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。
微核往往是各种理化因子，如辐射、化学药剂对分裂细胞作用而产生的。
在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。
微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。
一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的。
有实验证明，整条染色体或几条染色体也能形成微核。
这些断片或染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。
当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即形成了微核。
已经证实，微核率的大小是和作用因子的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点与染色体畸变的情况一样。
所以许多人认为可用简易的周期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。
由于大量新的化合物的合成，原子能的应用，各种各样工业废物的排出等都存在污染环境的可能性，欲了解这些因素对机体潜在的遗传危害，需要有一套高度灵敏，技术简单易行的测试系统来监测环境的变化。
只有真核类的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害，在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。
目前国内外不少部门已把微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、食品添加剂的安全评价，以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面。
70年代初，Matter和Schmid首先用啮齿类动物骨髓细胞微核率来测定疑有诱变活力的化合物，建立了微核测定法。
此后，微核测定逐渐从动物、人扩展到植物领域。
人和动物的微核测试多用骨髓和外周血细胞，这需要一定的培养条件与时间，细胞同步化困难，微核率低，一般只在0.2%左右。
而植物系统则更直接、更简便。
如采用高等植物花粉孢子利用其天然的同步性作微核测试材料，取得较好效果，其中70年代末Te-Hsiu Ma用一种原产于美洲的鸭跖草（Tradescantia paludosa），建立的四分孢子期微核率计数（MCN-in-tetrad）的测试系统是较好的系统之一。
微核试验
一、意义和目的•学习小鼠骨髓多染红细胞（PCE）微核测定方法，了解环磷酰胺对骨髓细胞染色体的损伤作用。
二、原理•基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学毒物的致突变性,是评价化学毒物致突变性唯一可靠的方法。
还有许多试验所观察到的现象并不反映基因突变,染色体畸变和染色体分离异常，而仅反映致突变过程中发生的其他事件。
因此，将试验观察到的现象所反映的各种事件统称为遗传学终点(genetic endpoint )。
• 国际环境致突变物致癌物防护委员会(ICPEMC)于1983年提出致突变试验的遗传学终点分为5类:①DNA完整性的改变(形成加合物、断裂、交联)；②DNA重排或交换；③DNA碱基序列改变；④染色体完整性改变；⑤染色体分离改变。
其中③实际上指基因突变；④指染色体畸变。
•微核试验是用于染色体损伤和干扰细胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。
微核是指存在于细胞中主核之外的一种颗粒，其染色与细胞核一致，大小相当于细胞直径的l／20～l ／5，呈圆形或杏仁状，在间期细胞中可以出现一个或多个。
• 一般认为微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质(染色体断片或迟滞的染色体)。
所以，微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点，用于检测断裂剂及非整倍体诱发剂。
微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物相区别，故常计数PCE细胞中的微核，因为当成红细胞发展为红细胞时，主核排出，成为PCE，这些细胞保持其嗜碱性约24小时，然后成为正染红细胞（NCE），并进入外周血。
在主核排出时，但微核仍保留于PCE细胞中。
操作步骤• 动物选择首选物种是小鼠和大鼠。
以小鼠使用最为广泛，要求体重18～20g，7～12周龄。
每组小鼠数量10只，雌雄各半。
无首选品系，通常用实验室品系。
• 染毒途径根据研究目的或受试化学毒物性质的不同，可分别选用经口、经皮、经呼吸道及注射等染毒途径。
微核实验在环境健康综合监测中的应用郭辰
收稿日期 Received: 2015-01-07 接受日期 Accepted: 2015-03-12 *国家自然科学基金项目（20907047）、国家重点基础研究发展计划（973计划）项目（2012CB525005）、国家环保公益性行业科研专项（201309045、201409079）和中国环境科学研究院中央级公益性科研院所基本科研业务专项基金（2008KYYW05）资助 Supported by the National Natural Science Foundation of China (20907047), the National Basic Research Program of China (973 Program, 2012CB525005), the National Environmental Protection Public Welfare Science and Technology Research Program of China ( 201309045, 201409079), and the National Nonprofit Institute Research Grant of CRAES ( 2008KYYW05)**通讯作者 Corresponding author (E-mail: xlwang@)微核实验在环境健康综合监测中的应用*郭 辰1 吕占禄1 钱 岩1 王先良1** 吴家兵2 梁 豹2 王菲菲1 潘丽波1 马 瑾1 魏永杰1张金良11中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室 北京 1000122安徽医科大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生系 合肥 230032要 环境健康综合监测是我国环境健康工作未来的重要发展方向之一，但现有工作只重点关注污染物成分组成，缺乏健康效应信息，微核实验作为遗传毒性检测的标准化实验，具有准确性高、操作简单等特点，适合用于环境健康监测工作中. 本文综述了微核实验，包括植物微核实验，动物体内、体外细胞微核实验的特点及其在环境污染物遗传毒性监测中的应用；同时对微核实验的发展和应用进行了综述，胞质分裂阻滞法（CBMNT ）弥补了传统微核实验的不足，微核实验与荧光原位杂交技术（FISH ）、抗着丝粒抗体染色方法（CREST ）等检测技术的联用还可以揭示微核形成的机制，自动化检测技术的发展使微核实验结果更加快速、直观. 因此，微核实验作为体外毒理学指标之一，可在明确受污染环境主要污染物组成的基础上补充污染物的健康效应等基础数据，在环境健康综合监测工作中可被广泛应用，以进一步完善该体系. 参55关键词 环境健康综合监测；植物微核；体外微核；自动化；高内涵筛选CLC R994.6Micronucleus test and its application in environmental health monitoring *GUO Chen 1, LÜ Zhanlu 1, QIAN Yan 1, WANG Xianliang 1**, WU Jiabing 2, LIANG Bao 2, WANG Feifei 1, PAN Libo 1, MA Jin 1, WEI Yongjie 1 & ZHANG Jinliang 11State Key Laboratory of Environmental Criteria and Risk Assessment , Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China 2School of Public Health, Anhui Medical University , Hefei 230032, ChinaEnvironmental health monitoring is the future f ocus of environmental health research in China. Current work is mainly focused on the composition of contaminants, lacking information of health effects. Micronucleus test (MNT) is one of the standard methods to detect genetic toxicity. MNT is simple and accurate and suitable for environmental health monitoring. This paper reviewed the application of MNT in genetic toxicity monitoring of environmental contaminant including plant MNT, in vitro MNT and in vivo MNT. It also reviewed the application and adva ncement of MNT. CBMNT is proved to be more accurate than traditional MNT; CBMNT combined with other techniques including FISH and CREST can reveal mechanisms of micronucleus formation. The development of automation detection methods makes MNT more ef fi cient and visualized. As an in vitro toxicity test, MNT can provide information of health effects of pollutants whose composition is known. Thus MNT can be broadly used in environmental health monitoring and improve this system.Keywords environmental health monitoring; plant micronuclei; in vitro micronuclei; automation; high content screening环境污染对人群健康的影响是许多国家在经济发展中面临的重大问题，世界卫生组织调查显示，全球接近1/4的疾病负担是由暴露于不良环境所引起的，通过改善环境质量每年可减少约1 300万人的死亡[1]. 我国环境健康工作起步较晚，目前我国环境监测和疾病监测系统各自独立建设，卫生系统在疾病的监测过程中并未将地理因素、环境因素等信息进行统计；环境监测工作主要关注COD 等常规污染物，一些对人体健康危害较大的重金属、有机物等并未列入监测范围. 此外，与人体健康相关的一些体内、体外毒理学检测指标也未列入到常规监测中. 但随着环境对人群健康可产生重要影响的认识的不断深入，环境健康工作得到了广泛重视，国务院先后出台了《国家环境与健康行动计划》（2007-2015）和《国家环境保护“十二五”环境与健康工作规划》，提出了开展建立重点地区环境与健康综合监测网络的规划. 环境59121卷 郭 辰等/ Chin J Appl Environ Biol 应用与环境生物学报健康综合监测是合理利用环境系统和卫生系统的现有监测网络，在日常监测工作中相互配合，不断充实和优化监测内容[2-4]. 在监测指标的选择上，在传统的COD 、VOC 等指标的基础，还应增加对人体 危害较大的重金属、化合物等物质的检测. 在上述理化指标检测之外，还应增加生物毒性、遗传毒性等检测指标. 将检测结果与疾病监测结果相结合，建立完善的环境健康风险管理制度.微核试验（Micronucleus Test ，MNT ）是检测受试物引起的染色体或有丝分裂器损伤的一种遗传毒性试验方法. 微核的形成是由于细胞在诱变因子的作用下使染色体受到损伤，形成无着丝粒的染色体片段，或纺锤体受损的整个染色体，其在有丝分裂后期无法迁移至细胞两极，以游离的方式存在于细胞质中成为微核[5-6]. 微核试验具有操作简单、试验周期短、重复性好、可信度高等特点，在毒理学、医学、食品和环境等诸多领域有着广泛的应用，是许多国家和组织规定的药品、食品添加剂、化妆品等化学物质进行遗传毒性检测的必不可少的实验之一[7-8]. 因此，微核实验可以作为综合监测网络中的毒理学指标之一. 本文综述了微核实验的最新研究进展，包括自动化微核技术的应用，可为其作为遗传毒性检测指标在综合监测中的应用提供新思路.1 微核实验微核技术最早由Boller 和Matter 等于20世纪70年代初建立，所用的对象为啮齿类动物骨髓细胞[9]；1985年，Fenech 等在此基础上建立了胞质分裂阻滞法（CBMNT ）微核技术，有效提高了微核试验的准确率[10-11]. 随着微核技术的不断发展，其应用不再局限于在体外哺乳类动物细胞的应用，并逐渐发展到植物领域，按照实验对象分类，现已建立了植物细胞、哺乳动物类细胞以及非哺乳动物类细胞微核试验方法.1.1 植物微核实验植物微核试验较常用的材料有植物花粉母细胞或根尖、茎尖细胞等，主要用于环境监测中. 其中蚕豆细胞DNA 含量多，染色体数目少且体积大，其根尖分生区细胞多，对环境诱变物引起的损伤较为敏感，操作方法简便、快速，灵敏度高[12]，可同时检测染色体完整性改变和染色体分离改变. 该方法在国内使用已较为成熟，已被列入《生物监测技术规范（水环境部分）》，在水体、空气污染等领域应用广泛[13]. 在对浊漳河、昆明周边生活区水体遗传毒性检测中均有应用，发现检测水体的遗传毒性较大，提示接触该水可能会对人群健康产生危害[14-15]. 国外也有研究人员用大豆根尖对橄榄油加工厂排放的废水进行微核检测，结果显示10%稀释浓度的废水具有遗传毒性[16].另外，上世纪70年代末建立的紫露草四分孢子期微核率计数方法也是植物微核检测中较为常用的方法，常被用于环境监测. 一篇报道对使用紫露草监测空气污染致遗传毒性的作用进行研究，发现某地1997-2000年间污染区紫露草细胞微核率明显高于对照区，但2003-2005间的结果则显示两个地区的紫露草细胞微核率无显著性差异，说明空气质量得到改善[17]. 另外一篇文章对电厂周围可能被重金属、SO 2污染的土壤的遗传毒性进行研究，并与体外细胞Comet 实验、Ames 实验相比较，发现部分土壤样品微核率显著高于对照组，且微核实验方法灵敏度较高、操作便捷[18].其它植物细胞，如洋葱也可用于微核检测[19]. 综上所述，植物微核技术在大气污染、水污染、土壤污染以及重金属污染等引起的遗传损伤方面也具有较高的预警作用，且实际操作简单、花费低. 但其不能反映出诱变剂在哺乳动物细胞内的靶分子作用方式和机制，有研究表明，动植物细胞微核检测系统对不同化合物的反应不同，这可能是由于代谢系统不同，以及对有丝分裂纺锤体破坏反应的不同[20]. 因此，植物微核检测系统可以作为环境污染物遗传毒性的预警系统，与体外微核实验、动物实验相互配合，在环境保护等方面发挥作用.1.2 动物微核实验动物体外细胞微核试验可使用的细胞较为广泛，如骨髓细胞、肝细胞、淋巴细胞等细胞均可被使用. 经济合作与发展组织在其487号指南中，对化合物的体外哺乳细胞微核试验进行了规范，除可使用原代人体外周血淋巴细胞外，许多啮齿动物细胞系例如中 国仓鼠卵巢细胞CHO 、中国仓鼠肺细胞CHL 、中国仓鼠成纤维细胞V79及L5178Y 小鼠淋巴瘤细胞等，以及人类细胞系如TK6人淋巴母细胞等 也均被大量实验证实其有效性[21].使用较为成熟的方法目前有啮齿类动物或人类 外周血淋巴细胞微核试验、骨髓嗜多染红细胞微核试验. 人外周血淋巴细胞（PBL ）微核率检测近年来作为癌症早期诊断的生物标志物的相关研究成为热点. 癌症的早期检出对患者的预后治疗具有重要意义，而基因组失稳可能是癌症早期形成的分子病理学步骤. Maffei 等对PBL 微核率与肠癌之间的关 系进行了研究，结果发现其中肠癌患者PBL 微核率显著高于肠息肉患者和对照组人群，综合其他结果，认为微核检测可以作为肠癌早期检测的生物标志物之一[22].骨髓嗜多染红细胞（PCE ）微核试验在化合物遗传毒性体内检测中应用较广. Wilmer 等用该方法研究了三氯乙烯（TCE ）蒸汽对于CD 大鼠遗传毒性的影响，在5 × 10-3 TCE 暴露条件下，3只大鼠在未达到暴露时间前即死亡，其余大鼠在暴露6 h 后检测了PCE 微核率，但并未发现显著变化[23]. α-鹅膏蕈碱（α-amanitin ）是蘑菇中主要的有毒物质，Marciniak 等通过动物实验检测了其毒性，其中PCE 微核结果显示在受试剂量下微核率显著增加，证实α-鹅膏蕈碱具有遗传毒性[24].除了哺乳动物细胞外，鱼类外周血红细胞也被用于微核实验. 鱼类血细胞是有核细胞，在环境监测中应用较多，尤其是水体遗传毒性监测中. 但对于不同鱼样本，微核率相差较大[25]. 用池塘鳢鱼（Channa punctatus ）和金鱼（Carassius auratus ）对砷在水中的遗传毒性进行研究，发现在饮用水标准中规定的砷浓度下，两种鱼类血细胞微核率显著增加，显示出一定的遗传毒性，但微核率检测敏感度在鱼类中具有个体特异性[26]. 与哺乳动物不同，鱼类是变温动物，其细胞分裂的周期并不固定，而是随温度的变化而变化，因此，鱼类应用于微核研究仍有一些不确定因素[27].综上所述，动物细胞、植物细胞微核实验在环境遗传毒性检测，化合物、药物毒理学研究，肿瘤研究等方面具有实际的应用，已逐渐成为遗传毒性检测不可替代的实验方法.592应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol /微核实验在环境健康综合监测中的应用 4期应用随着微核技术的广泛应用，其检测方法也不断发展，传统微核实验无法分辨分裂细胞与未分裂细胞，无法解决不同细胞在不同培养环境下其分裂周期不同造成的实验误差. 细胞分裂阻滞微核分析法（CBMNT ）是在传统微核实验的基础上建立的，解决了不同细胞分裂不同步的问题，使微核实验结果灵敏度更高，并实现了微核实验标准化流程的建立[28]；同时，分子生物学的发展为微核技术的发展提供了新的平台，与荧光原位杂交试验（FISH ）方法、DNA 探针与抗着丝粒抗体染色（CREST ）方法以及高通量自动化检测技术等方法的联合使用，使得微核实验可以进一步明确其损伤机理、微核来源，并极大地提高检测效率.2.1 细胞分裂阻滞法微核实验（CBMNT ）在哺乳动物细胞中，微核的形成需要细胞经过有丝分裂过程，CBMNT 是利用细胞松弛素B （Cyto-B ）不影响细胞核分裂，但会阻断胞质分裂的作用. 加入cyto-B 可使经有丝分裂的细胞变为双核细胞，该方法可同时获得受试物诱导的双核细胞率和双核细胞微核率，说明受试物对细胞周期和遗传毒性的影响[29]. 如今CBMNT 法依然是检测微核的经典方法，其准确性和重复性得到了一致认可，并发展成为能够同时检测微核、核质桥、核芽突、单核/双核细胞比例、凋亡细胞、坏死细胞等一系列指标的技术[30]. 近几年，CBMNT 法在环境污染对人体遗传毒性的检测中使用较多. Chinde 等通过comet 实验、微核试验等研究了200位铅酸蓄电池回收和制造业工人PBL 微核率、口腔上皮细胞（BECs ）的微核率，并与200位空白对照人员进行对比，发现实验组人员PBL 和BECs 中微核率均显著高于对照组，说明污染环境对人群遗传毒性的影响值得注意[31]. 另外一项研究调查了空气中的甲醛对人体健康的危害，41名身体健康的志愿者每天暴露于随机变化浓度的甲醛中4 h ，共5 d ；并需进行共4次，每次15 min 的自行车练习. 微核实验检测了实验组外周血细胞和脱落鼻腔黏膜细胞（取自暴露结束数周之后），但检测结果未发现可吸入甲醛会造成人体遗传毒性[32].2.2 荧光原位杂交技术（FISH ）荧光原位杂交技术（FISH ）于20世纪80年代诞生，其基本原理是用已知标记的单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸，通过该方法可以判断微核来源. 在完成微核实验的制片染色等过程之后，可继续进行FISH 实验，将待测样品与标记了荧光信号的DNA 探针进行原位杂交，判断出微核成型原因：染色体断裂或整条染色体丢失. 一般常用的探针有3种：染色体特异重复序列探针；全染色体或染色体区域特异性探针；特异性位置探针[33-35]. Balajee 等使用多彩FISH 技术研究了电离辐射对人淋巴细胞微核形成的影响，结果显示随着γ射线辐射剂量的增加，细胞微核率增加[36]. 实验中使用了多种荧光的染色体探针，获得了6个不同的荧光图像，说明电离辐射引起的微核来自于多条染色体碎片；且某些探针的检出率明显更高，对于进一步深入理解电离辐射对染色体的损伤作用机制有所启示. FISH 法虽然结果可靠、灵敏度高，但其花费也较高，不适宜用于广泛筛查.2.3 抗着丝粒抗体染色方法（CREST ）抗着丝粒抗体可与染色体着丝粒蛋白特异性结合，与微核实验相结合，可特异性标记有着丝粒的微核，从而鉴别非整倍体毒性. 早期CREST 法在微核检测中的应用较多，如有机磷、有机氯农药的遗传毒性及损伤机制研究[37]；以CREST 法检测微核率作为环境污染对啮齿类动物遗传毒性检测的生物标志物[38]以及电离辐射对细胞损伤作用的影响等[39]. CREST 法的优势在于可以在一定程度上阐明染色体断裂机制，但只能检测染色体丢失形成的非整倍体，使其应用受到了限制；但与FISH 法相比，CREST 染色法更加简便和经济. 2.4 自动化检测方法微核实验虽然简单、准确且易操作，但实验结果仍需要人工阅片计算微核数，工作量较大且容易出现人为误差. 微核技术在很多领域已被列为常规实验，环境健康综合监测要以微核为常规检测指标之一，其工作量较大. 因此研究自动化高通量的微核检测方法成为研究人员的亟待解决的技术关键. 现有的自动化检测方法包括利用流式细胞术、激光扫描仪以及计算机图像分析系统等.2.4.1 流式细胞术（FCM ） FCM 应用于微核检测时，需对细胞内核物质进行荧光染色，但由于微核与主核其组成相同仅大小不同，荧光染色并不能将二者区分开，因此早期FCM 在微核中的应用受到限制，仅用于检测无核细胞的微核率. 随着FCM 的不断发展，其开始用于有核细胞的微核检验，利用的是微核是主核大小1/3-1/16的特点将其进行区分. 但直接对整个细胞进行染色之后利用该方法进行检测往往准确性较差，故现在常用的方法是用物理或化学方法裂解细胞，使细胞核、微核释放出来，之后再进行流式细胞术检测. 但该方法仍然存在一定的弊端：凋亡小体中含有DNA ，因而容易在实验中检测到假阳性信号；另外，FCM 对实验操作的要求较高，要求过程中尽量避免由于外力导致的机械损伤等. 最后，该方法所的到的结果是相对于细胞核数量的微核率，不能将微核率与实际细胞相关联[40-41]. Cammerer 等报道了用流式细胞术检测了非整倍体诱发剂（秋水仙碱、长春花碱、长春新碱）和染色体断裂剂（环磷酰胺）对小鼠网织红细胞微核率的影响，结果显示几种非整倍体诱发剂致小鼠 微核增加，且呈现出非线性的剂量效应关系，而环磷酰胺作用后微核增加与剂量之间显示出线性剂量关系；同时该实验还同时使用了FISH 技术与流式细胞术相结合，探究3种非整倍体诱发剂诱导的微核来源[42].2.4.2 激光细胞仪方法（LSC ） 激光细胞仪（LSC ）是一种基于显微镜技术的细胞荧光测量仪，LSC 法可弥补FCM 的一些不足，其工作原理同样是给细胞进行荧光染色，然后上机进行荧光扫描，不仅可获得DNA 含量等参数，同时还可获得图像，进行肉眼验证. 对于贴壁细胞，进行LSC 检测无需对细胞进行消化等前处理，可直接进行染色. 另外，配备了多波长激光发射器、高动态范围荧光接收装备的LSC 可以实现对细胞内或细胞核内多参数的同时测定，如细胞质面积、核面积、细胞核DNA 含量、微核密度甚至蛋白含量等，在微核实验中，多荧光有利于区分双核细胞，得到精确地双核细胞59321卷 郭 辰等/ Chin J Appl Environ Biol 应用与环境生物学报微核含量；此外，LSC 法检测速度较快，一般10 min 即可检查5 000个细胞，已成为常规微核实验方法[43-44]. LSC 既可用于致癌物致的小鼠体外红细胞、人口腔上皮细胞微核检测中，也可用于多种体外培养肿瘤细胞，如乳腺癌细胞MCF-7、早幼粒白血病细胞HL-60和淋巴瘤细胞U-937等细胞的微核检测中，且与传统镜检方法比较具有较好的一致性[45-46].2.4.3 高内涵筛选系统（HCS ） HCS 具有强大的图像分析功能，通过自带的内置软件分析系统，可以对不同荧光染色的图像进行分析从而得到有效数据，其在药物筛选、毒性测定等方面应用广泛. 在体外微核实验中，HCS 系统能自动分辨双核细胞和微核，并进行统计，可极大地节省工作量，并且减少人工阅片的误差[47].Cellomics ArrayScan 高内涵筛选系统是由Thermo Fisher 公司研发的活细胞成像系统，可实现对微核实验、彗星实验等细胞毒性检测[48]. 研究人员应用Cellomics 设备对46种化合物进行了微核测试，包括8种非整倍体诱发剂、25种染色体断裂剂和13种无遗传毒性的化合物. 检测结果显示，该自动化检测方法与传统镜检结果相比，敏感性为88%，特异性达到100%，阳性预测率100%，阴性预测率76%，说明该系统准确度较高，可以应用于微核常规研究中[49]. Sun 等研究了槲皮素和姜黄素的遗传毒性，并使用Cellomics ArrayScan 系统对其微核诱导率进行分析，结果显示3-6 μmol/L 的姜黄素可明显增加微核率，而槲皮素对微核的形成影响较小[50]. 国内也有研究发现，用该系统测试了8种阳性诱变剂对CHO 细胞微核的影响，其中7种诱变剂显示出阳性结果，说明该系统在用于微核试验中精确度较高，且操作简单，结果由系统自动判断，耗时短[51].In Cell Analyzer 是由GE 公司研发的HCS 系统，它具有高质量激光光源，可以实现细胞3D 结构成像、低丰度内源生物分子成像、蛋白共定位等. 自带的数据分析软件具有微核分析等诸多功能. Shibai-Ogata 等对 IN Cell Analyzer 在微核检测中的可信性进行了验证，测试了包括染色体断裂剂等阳性物在内的30种化合物对中国仓鼠肺细胞CHL/IU 微核率的影响，并与相同条件下的镜检结果进行对比，证实该系统得到的结果与传统实验方法相比具有较高的一致性[52]. 随后，在其最新研究中，Shibai-Ogata 等对经丝裂霉素C 处理后的PBL 和PCE 的微核率进行IN Cell Analyzer 自动化分析，并与镜检结果进行多次对比，结果显示自动化计数与人工计数的重复性相当，但人工计数的结果受人为因素影响，而自动化分析方法在分析速度以及客观性方面具有优势[53].Opera 和Operetta 是PerkinElmer 开发的共聚焦微孔板成像阅读装置，与其他几种HCS 产品相比较，Opera 最显著的应用领域是在亚细胞分辨率水平上的细胞筛选和基于微珠的各种筛选应用，使其在药物筛选方面有着独特的优势，此外，Opera 还可检测毒性和活性、细胞信号传导和通路筛选、基因表达，以及基于微珠的均相抗原-抗体作用进行免疫化学检测. 但其在微核分析中的应用见报道[54]. 2.4.4 其 它 除了对微核分析实现自动化外，Transgenomic 公司专门针对微核实验前处理工作设计了一台能从培养、收获，直至制片等实现完全自动化的HANABI Harvester 系列仪器，其可模拟人工操作流程，实现自动离心、分离上清、低渗处理、固定等微核前处理步骤，且能按照试验要求进行液体预热和预冷等精确流程，实现微核全过程的自动化操作，使实验结果更加客观真实，重复性高，避免了人为误差，同时减少劳动力. 实验材料方面，外周血、脐带血、骨髓等培养细胞均可用该仪器进行微核制片[55].上述高通量高内涵的检测方法耗时短，一般数小时即可完成微核的拍照、计数和分析，实验一般使用微板，所需受试物少，用于环境健康综合监测中环境样品遗传毒性检测时可以节约大量人力物力. 但上述仪器往往成本较高，一般实验室并不能配备，制约了其应用范围. 另外，各个仪器无法与其他拍摄仪器所获得的图片兼容，如荧光显微镜或激光共聚焦显微镜拍摄到的图片无法导入其预置软件进行自动分析. 若可以实现将外来图片导入，利用上述设备功能强大的分析软件进行自动化分析，将会极大缩短微核试验周期，节约成本，降低实验人为误差.3 展 望遗传毒性检测在环境健康综合监测中具有重要意义. 仅知道环境样品中各个污染物的含量已不能满足当前环境健康工作的需求，环境中污染物究竟能引起多大程度的健康损害，不仅是群众关心的问题，也同时是环保部门迫切需要了解的指标. 实际环境健康工作中实现多学科分工合作，在测定污染物浓度等理化指标的基础上，加入遗传毒性、综合毒性等指标，对检测结果中毒性较大的样品还可进行某些污染物浓度的复测，这样既能确定检测区域存在的主要污染物，同时还能得到相关的毒性指标，对其引起的健康危害进行初步的评价. 微核实验作为体外遗传毒性检测的经典方法之一，其准确度高、操作难度低、成本低；体外微 核试验在环境样品检测中的应用条件也已经较为成熟，能够实现较大批量样品的测定，如水样经过富集等前处理后可良好的应用于体外微核实验检测其遗传毒性大小，若配合自动化检测方法，微核实验的检测效率及准确度将会极大提高，完全可以作为环境健康综合监测体系中的常规检测指标之一. 同时，结合其他遗传毒性检测方法，如SOS/umu 实验、彗星实验等方法，还可以探讨不同作用机制下遗传毒性的大小. 在环境健康综合监测体系中加入微核实验等遗传毒性检测指标，将单一的环境污染物检测问题转变成为环境污染情况对人群健康的潜在影响，可以更好地阐释环境健康综合监测工作的意义和重要性. 参考文献 [References]1WHO. 10 Facts on preventing disease through healthy environments [EB/OL]. 2010 [2014.11.19]. http://www.who.int/features/factfiles/environmental_health/en/2邓爱萍. 环境与健康综合监测工作中相关问题探讨[J]. 北方环境, 2011, 23 (10): 167-168 [Deng AP. Discussion on integrated monitoring work of environment and health [J]. Northern Environ , 2011, 23 (10): 167-168]3范清华, 张涛, 沈红军. 典型区域环境与健康综合监测体系构建[J]. 环境科技, 2014, 27 (1): 45-48 [Fan QH, Zhang T, Shen HJ. Construction。
实验 蚕豆根尖微核检测技术(共25张PPT)
细胞数
微核数
污染指数在0－1.
数或微核数 在没有空调恒温设备时，如室温超过30℃，MCN本底可能有升高现象，但可经污染指数法数据处理，不会影响检测结果。
7．染色 改良石炭酸品红染色：
阳性因子可采用CrO3（1.
5mmol/L 3种浓度。
目前微核测试已经广泛应用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。
CrO3 污水：
五、实验方法
1．实验材料的培育 蚕豆根尖细胞的染色体大，DNA含量高，因而对诱变
因子反应敏感。松滋青皮豆是从不同蚕豆品种中筛选出来 的一种较为敏感的品种。本品种引入后在栽培繁殖时要注 意不要同其它蚕豆品种种在一起，不喷洒农药、以保持该 品种较低的本底微核值。也可用其它蚕豆品种，但是必须 设置对照组。种子成熟后，晒干贮藏于干燥器内或4℃冰箱 内备用。
六、实验数据的统计处理和污染程度划分
将实验数据按以下步骤进行统计学分析处理：
1． 计算各测试样品（包括对照组）微核千分率（MCN‰ ） 如果对照本底MCN‰为10 ‰以下，可采用如下标准进行分析 以确定样品的污染程度： MCN‰在10‰以下，表示基本没有污染； MCN‰在10‰－18‰区间，则表示有轻度污染； MCN‰在18‰－30‰区间，则表示有中度污染； MCN‰在30‰以上，则表示有重度污染；
6．酸解：
从70％乙醇中取出固定好的根尖→流水冲洗 ３min→吸水纸吸干→放入盛有适量1 mol/L HCl ，60±0.5℃水浴保温的青霉素瓶中→解离10min 。
7．染色 改良石炭酸品红染色：
解离后材料水洗3min并吸干，挑取1个根尖的 乳白色分生组织于载玻片上夹碎捣烂，滴加1～2 滴染液，染色10～15min，压片。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
临时装片制片 —— 细胞学鉴定
1. 解离：取70%乙醇中保存的根尖水洗两次，用 1N HCl 在60℃处理根尖8-10min后，水洗 3~4次，每次5min。
2. 染色：根尖在有盖的小瓶中加入希夫（Schiff ） 试剂染色30min~2h。
3. 压片：在干净的载玻片上切下根尖分生区，滴一 滴45%醋酸，加盖玻片，用滤纸吸净多余的液体， 一手压住盖玻片一角，另一手持竹针轻敲盖玻片 至组织呈云雾状。将载玻片在酒精灯上轻烤，在 盖玻片上覆滤纸条，用拇指垂直按压制片。
实验步骤： 根尖的培养
环磷酰胺处理
诱变处理
固定 解离
染色
压片
镜检及观察
实验材料 准备
细胞学鉴定
临时装片 制片
实验材料准备 —— 诱变处理
1. 毛葱沙培生根，室温下2-3天即长出0.5 ~ 1cm长的根；
2. 置于环磷酰胺溶液中处理24小时；
3. 从药液中取出，水洗后清水培养24 小时； 4. 水洗后用Carnoy’s固定液固定24小时，
由于大量新的化合物的合成、原子能的应用、各种 工业废物的排出，需要有一套高度灵敏、技术简单 的测试系统来监视环境的变化。只有真核生物的测 试结果更能直接推测反映诱变物质对人类或其他高 等生物的遗传危害，微核测试是一种比较理想的方 法。
目前国内外已把微核测试用于辐射损伤、辐射防护、 化学诱变剂、食品添加剂、新药试验、染色体遗传 疾病及癌症前期诊断等各方面。
微核测试法： （micronucleus test, MNT）
20世纪70年代初期由Matter和Schmid 首先建立了一种简便、快速、评价客观地检 测来自环境中的各种理化及生物因子对机体 产生潜在的遗传损伤方法，即用哺乳动物骨 髓嗜多染红细胞微核（polychromatic erythrocyte, PCE）出现率的实验方法。
背景知识——毒理遗传学：
或称遗传毒理学，用遗传学方法研究环境因素 对遗传物质的损害及其毒理效应的遗传学分支 学科，提供了许多迅速、准确、简便的方法来检
测各种环境因素对遗传结构的危害，以便采取措 施，减少这些因素对人类的危害。
应用：评价各种化学物的安全性（药物的临床过 渡），人类环境的现场监测、人群健康监测（职 业病的防治）以及遗传毒性与疾病、肿瘤的流行 病学调查等。
现在一般都采用细菌、离体培养的哺乳动物和人 类体细胞、植物为测试对象，主要的方法有：
①以基因突变为指标的检测法 ②以染色体为指标的方法
以染色体为指标的“三致 效应”的检测方法：
1. 经典的染色体畸变分析方法； 2. 姐妹染色单体互换测试法； 3. 微核测试法。
微核
（1）断片 （2）双着丝点 （3）环
3. 致畸效应：环境因素作用于发育中的胚胎细胞干扰 了基因的正常作用，从而影响到胚胎细胞分化和器 官系统的发育而导致畸胎的发生，也包括环境因素 诱发亲代生殖细胞的基因突变或染色体畸变引起畸 胎的作用。
肿瘤的发生和类型
“三致效应”的检测方法：
早期的方法：用待测化学物质喂饲、注射动物或 涂布在动物皮肤上，然后观查动物是否因此而患 肿瘤或出现畸胎等，可检测各种化学物质的致癌 和在胚胎发育过程中的致畸效应。
4. 镜检及观察。
结果及分析：
1. 细胞学观察：
在细胞分裂间期，微 核呈圆形或椭圆形， 游离于主核之外，大 小在主核的1/3以下， 折光率及细胞化学反 应性质和主核一样。
蚕豆根尖微核照片
2.微核率计算
微核率（MCN%o）= 微核数/细胞数×1000%o
片号 第一片
微核检测记录表
细胞数
微核数
微核千分率
微核率与用药剂量或辐射积累效应呈正相关。
实验材料：
毛葱（Allium fistulosum）根尖。
实验器材：
显微镜，冰箱，水浴锅，分析天平，剪刀，镊子， 刀片，载玻片，盖玻片，滤纸，量筒，滴瓶，酒精 灯，指管等。
试剂
1. 环磷酰胺（CP） 2. 卡诺氏（Carnoy‘s）固定液 3. 希夫（Schiff‘s）试剂 4. 45%醋酸 5. 1 N盐酸
4. 复合诱变：两种或多种诱变剂的先后使用。
环境因素造成的遗传毒理效应：
“三致效应”
1. 突变形成：环境因素诱发生殖细胞的基因突变（点 突变）和染色体畸变，从而造成子代遗传性疾病发 生频率的增加，
2. 癌形成：环境因素诱发体细胞基因突变或在亲代遗 传的突变形成的背景上诱发体细胞突变，引起的体 细胞恶性转化为癌细胞的作用；
智能全自动微核分析系统：
法国IMSTAR
本实验的目的：
1. 通过植物根尖微核试验，学习微核的制片 技术、识别及计数方法。
2. 掌握评价理化因子对机体遗传损伤的快速 筛选方法。
实验原理：
微核（micronucleus, MN）是真核生物 细胞中的一种异常结构。由于细胞经辐射或 化学药物等作用使染色体受到损伤，在有丝 分裂中、后期细胞中形成丧失着丝粒的染色 体单体或染色体断片，游离于子细胞质中形 成的次核。在间期细胞中，常常见到比普通 细胞核小很多的一个或几个圆形结构，其直 径大约相当于细胞直径的1/20~1/3。
环境中可产生诱变的因素：
1. 物理诱变：如紫外线，X-射线，γ-射线，快中子， 激光，微波，离子束等。
2. 化学诱变：如烷化剂(包括EMS、EI、NEU、NMU、 DES、MNNG、NTG等)，天然碱基类似物,氯化锂、亚 硝基化合物、叠氮化物、碱基类似物、抗生素、羟 胺和吖啶等嵌入染料。
3. 空间诱变：宇宙系列生物卫星、科学返回卫星、空 间站及航天飞机等空间飞行器进行搭载。
遗传毒理评价所用的材料：
1. 利用植物、昆虫（果蝇）、水生动物等生物的细胞 可以现场监测水源、空气及作业环境中遗传毒物的 存在。为此，发展了紫露草花序、蚕豆根尖、鱼红 细胞遗传毒性试验方法以及Ames（原生动物） 空气现场采样方法等。
2. 动物细胞：小鼠骨髓细胞、外周血淋巴细胞等。
3. 应用多种人类细胞：口腔粘膜细胞、鼻腔粘膜细胞、 头皮毛囊细胞、痰液细胞等检测微核、染色体畸变、 姐妹染色单体互换率等指标，对人类接触遗传毒物 的剂量及效应进行评价。
第二片
第三片
总计
作业和思考题：