WB试验每步原理和技术及试剂的分析
wb实验目的、原理和步骤
wb实验⽬的、原理和步骤在做WB实验时总会遇上这样那样的问题，⽐如WB检测信号弱、检测不到条带、背景深等，其实严格按要求做，控制好实验中的⼏个关键步骤，分分钟搞定WB~蛋⽩样品的制备与定量，好的蛋⽩是成功的⼀半1.提细胞蛋⽩（1）消化或刮下细胞⾄1.5的EP管中，标记，10000r离⼼2min，PBS洗3遍（2）吸去EP管中PBS，最好⽤滤纸吸⼲⾥⾯的⽔分，加适量RIPA裂解液（RIPA裂解液：蛋⽩酶抑制剂=250:1），如果你想做信号通路指标还得再加上磷酸酶抑制剂（磷酸酶抑制剂：RIP A裂解液=1:1000）（3）冰上裂解30min~1h，开4°离⼼机（4）4°离⼼11000r，20min（5）测蛋⽩浓度，取上清，加蛋⽩上清的四分之⼀体积5x上样loading buffer，煮沸，分装（蛋⽩质变性）2.提组织蛋⽩（1）研钵中倒⼊液氮，加⼊组织块，研磨，加液氮，药匙刮（2）刮下后放⼊1.5ml的EP管，加适量裂解液，吹打（3）冰上放置1h，期间，每隔10~15min吹打⼀次，开4°离⼼机（4）4°离⼼10000r，1h（5）测蛋⽩浓度，取上清，加1/4体积5x loading buffer，煮沸，分装3.测蛋⽩浓度（BCA法）（1）⼋个标准孔，按说明书先加超纯⽔，再加标准蛋⽩液（2）⽬的孔，每孔加18ul超纯⽔+2ul⽬的蛋⽩（3）按说明书配BCA⼯作液，每孔加200ul（4）37°放置半⼩时后测浓度4.计算上样量，设计上样顺序上样体积：上样量/浓度x 5/4上样顺序：⽆处理，对照，处理；体积最好不要相差太⼤经验总结：如何提⾼蛋⽩浓度：⾸先当然是多种点细胞啦，其次可以少加点裂解液，尽量裂解充分。
如何处理蛋⽩浓度低的问题：实验过程中发现蛋⽩的浓度太低，如果上样的话，体积太⼤，甚⾄电泳孔都装不下，举例：假设我需要上样40ul才能达到20ug，那么显然按照常规的⽅法，10孔的梳⼦只能加25ul左右，我们此时可以取40ul蛋⽩⼊EP管中，放置于PCR仪器，变性温度浓缩蛋⽩体积，这样不断浓缩之后促使EP管中蛋⽩的⽔分降低，蛋⽩量依旧是20ug。
免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明
免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明一、试剂和溶液转印缓冲液：0.025M Tris base , 0.187 M 甘氨酸, 25%甲醇氨基黑溶液：0.1% 酸性黑10B 1×TBST：25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl , 0.1%Tween 20 封闭液：TBST 配制的5%牛奶抗体稀释液：TBST 配制的5%牛奶显色系统：ECL 显色二、实验步骤1.电泳：将裂解液进行SDS-PAGE 电泳，80v，30 分钟，120v，90 分钟；2.转膜：PVDF 膜在甲醇中浸泡约30 秒左右，滤纸浸泡在转印缓冲液预湿，半干法转印到PVDF 膜上，10v，150 分钟；3.染色：氨基黑染色5 分钟，甲醇褪去背景色，观察条带；4.膜活化：将PVDF 膜置于甲醇活化1min，用纯水洗膜2 次后再用TBST 洗涤3 次；5.封闭：将膜条置于5%牛奶或2% BSA 中，室温混摇2h；6.一抗孵育：将待检抗体用3%牛奶或2% BSA 稀释到合适浓度（参照抗体说明书，根据客户预实验结果，稀释度上下浮动一个数量级都为正常），将膜放入对应的已稀释待检样品中，置4℃混摇孵育过夜；7.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；8.二抗孵育：将膜取出放入稀释好的HRP 标记的二抗（参照二抗说明书进行稀释）中，室温混摇2h；9.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；10.ECL 显色：将膜取出放入混匀的ECL 显色液中，孵育3min，将膜取出贴在有荧光角标的胶片上，迅速用保鲜膜包好；11.曝光：把底片放在暗盒中，根据荧光强度分别对X 光胶片作不同时间段的曝光，曝光结束后，将底片取出，1min 显影，30s 清洗，1min 定影，30s 清洗，晾干；12.结果分析：用扫描仪将曝光后的X 光胶片扫描，做后续结果分析。
WB试验每步原理和技术及试剂的分析
WB试验每步原理和技术及试剂的分析WB蛋白印迹在生物化学这一块是常规实验，就像有人说炒菜中境界最高也最难的是蛋炒饭一样，实验中常规实验也是很考验技能的，除了潜心研究原理、认真揣摩技巧以外，对于新实验试剂的信息把握，勇于尝试新方法也是非常之重要的——各大厂家都在不断开发更方便更灵敏的新产品，“idea是生产力”嘛，因此生物通这里介绍一些能把我们从日常操作中解脱出来，获得“升级版”效果WB产品。
讲完了Western Blotting的电泳转移仪器，蛋白分子量标准和转移膜之后，我们最后来探讨一下WB的检测系统。
一般的WB检测过程中，都会有封闭、一抗、二抗和底物显色这四道工序要“加工”。
我个人觉得底物显色这最后一步是最关键的，也是最有文章可以作的一个部分。
你看，光标记方式就有生物素标记，地高辛标记，各种酶标记等等，酶标的底物又有各种生色底物、化学发光法底物和荧光底物可供选择；就连识别一抗的配体也不一定非要二抗不可，也可以是抗生物素蛋白，链亲和素或者Protein A或G等，更别说各种试剂盒琳琅满目，叫人好像无从下手！不过不急，生物通帮你作个参考，让你对各种产品的优点缺点一览无遗，真正成为一个WB高手。
另外如果实验室有已经建立的固定的显色方法，那也没关系，有时候不经意浏览到的方法可能就会对你的实验有莫大的帮助——这也就达到我们的目的了。
封闭和一抗的选择没有太多的选择余地——封闭前面介绍过了；一抗？现在的抗体产品说明书一般都有注明应用范围的，说明可以用于WB的就OK。
如果没有这些信息可以遵从以下原则：单抗专一性高，但是经过SDS-PAGE变性胶电泳的蛋白质可能由于原来的识别位点构象发生改变而不被识别，多抗不如单抗专一性高但更容易得到结果。
如果还有多种抗体选择，那当然是来源于兔或者小鼠抗体为好，因为后继的检测试剂盒一般都是针对兔鼠的居多，因而选择范围更大通用性也更强。
除了无标记的一抗，还有生物素等各种标记一抗。
WB实验的基本原理及操作流程
WB实验的基本原理及操作流程WB实验（Western Blotting）是一种用于检测和分离蛋白质的实验方法，广泛应用于生物医学和生物化学领域。
它通过将复杂的蛋白质混合物按照分子大小分离，并使用特异性抗体来探测目标蛋白质。
本文将介绍WB实验的基本原理及操作流程。
一、基本原理WB实验主要基于蛋白质的电泳分离和免疫染色原理。
具体步骤如下：1.样品制备：首先，需要从细胞或组织中提取蛋白质，并经过适当的处理，如裂解细胞、破碎细胞膜等，以获取纯净的蛋白质样品。
2. SDS-电泳：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide Gel），随后进行电泳。
这一步骤会根据蛋白质的分子大小进行分离。
3.转膜：将分离的蛋白质从凝胶转移到聚乙烯2.2-羟基苯基酮（PVDF）或硝酸纤维素膜上，这样可以更容易进行免疫染色。
4.封闭：将转膜后的膜进行封闭，通常使用牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉等阻断非特异性结合位点。
5.抗体反应：加入目标蛋白质特异性的抗体，使其与特定抗原位点结合。
6.洗涤：将膜洗涤以去除非特异性的抗体。
7.免疫染色：加入酶标记的辅助抗体，它与目标抗体结合，并携带可检测信号物质（如酶或荧光染料）。
8.显色：加入合适的底物，使酶标记的辅助抗体产生可视化的颜色或荧光信号。
9.分析：通过成像设备（如X射线胶片或荧光成像系统）观察和记录目标蛋白质的表达。
二、操作流程下面是一份WB实验的基本操作流程，具体步骤可能因实验目的和实验条件而有所变化。
1.样品制备：a.收集细胞或组织样品，并使用适当的缓冲液裂解细胞膜。
b.添加蛋白质提取试剂，并彻底裂解细胞。
c.离心裂解后的细胞，收集上清液，其中含有目标蛋白质。
2.SDS-电泳：a.准备好聚丙烯酰胺凝胶，通常使用8%至12%的分辨胶。
b.加载待测样品和分子量标记蛋白质到凝胶中。
c.进行电泳，常用条件为100V持续电解，直到样品顶到凝胶底部。
3.转膜：a.准备合适大小的PVDF或硝酸纤维素膜，并剪成和凝胶一样大小。
wb实验原理及步骤
wb实验原理及步骤
WB实验是WesternBlot实验的缩写，是一种常用的蛋白质检测方法。
该实验可以通过检测目标蛋白在蛋白样本中的存在和数量来确定其表达水平。
以下是WB实验的原理及步骤：
一、实验原理
WB实验基于蛋白质的电泳分离和免疫学检测。
首先将蛋白质样本通过SDS-PAGE电泳分离，然后将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
接着使用一种特异性抗体与目标蛋白结合，最后通过酶标记的二抗和显色底物来检测目标蛋白。
二、实验步骤
1. 样品制备：将待检测的蛋白样本加入SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离。
2. 转移：将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
3. 阻断：将聚丙烯酰胺凝胶膜与含有蛋白质的阻断液进行接触，以防止非特异性结合。
4. 抗体反应：将目标蛋白结合的特异性抗体添加到聚丙烯酰胺凝胶膜中，并在室温下或4℃下进行孵育。
5. 二级抗体反应：添加酶标记的二级抗体，与特异性抗体结合。
6. 显色检测：加入显色底物，通过显色反应确定目标蛋白在样品中的存在和数量。
以上是WB实验的原理及步骤，该实验在生物医学研究中广泛应用，为疾病的诊断和治疗提供了有力的支持。
WB操作原理以及流程细节
WB实验的基本原理及操作流程【实验原理】一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质(或酶)。
因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志，检测蛋白质的方法很多，除ELISA法外，也可用与检测DNA和RNA相类似的吸印方法。
前两法有“南”和“北”之意，故本法遂被延伸称为Western(西)印迹法，该法能用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨出与专一抗血清结合的专一性蛋白质。
将聚丙烯酰胺凝胶上分辨出的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上并与第一抗体共孵。
第一抗体专一地与待分离蛋自质的抗原决定簇结合，然后用另一种蛋自质，如135I-蛋白A或辣根过氧化物酶连接的山羊抗IgG检测已结合上去的抗体。
本法所需时间6小时或过夜。
蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。
最常用的方法是将强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。
变性的多肽与SDS结合并因此而带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。
在达到饱和的状态下，每克多肽约可结合1.4克去污剂，借助已知分子量的标准参照物，则可测算出多肽链的分子量。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续缓冲系统中进行，其电泳槽缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液，当两电极间接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动加入凝胶的样品中所含的SDS多肽复合物向前推进。
样品通过高度多孔性的积层胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带(或称积层)。
曲于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝胶的分辨率。
最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornsstein(1964)和Davis(1964)设计的，样品和积层胶中含Tris-Cl(pH6.8)，上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH8.3)，分离胶中含Tris-Cl(pH8.8)的。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
WB实验原理
WB实验原理WB实验（Western Blot）是一种常用的生物化学实验技术，用于检测和识别蛋白质。
本文将介绍WB实验的基本原理和步骤，以及其在科研和临床应用中的重要性。
一、WB实验的原理WB实验是通过将复杂的混合物中的蛋白质分离、电泳、转移和检测，来研究特定蛋白质的存在与表达水平。
其原理主要包括以下几个步骤：1. 蛋白质提取与电泳分离：首先，需要从细胞或组织中提取目标蛋白质。
常用的方法包括细胞裂解、超声破碎等。
然后，将提取得到的蛋白质样品进行电泳分离，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
2. 转移：将分离后的蛋白质通过电泳转移到聚乙烯膜（PVDF）或硝酸纤维素膜上，这样可以使蛋白质固定在膜上，方便后续的检测。
3. 阻断与抗体探针：在转移的蛋白质膜上进行阻断处理，防止非特异性结合和减少背景信号。
然后，通过与目标蛋白质有特异性结合的一抗探针进行孵育，使其与目标蛋白质特异性结合。
4. 二抗与信号发生物：加入与一抗来源物种不同的二抗，二抗具有与一抗结合的能力。
通常，二抗会标记着某种信号发生物，如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP），这些信号发生物能够发出具体的发光信号。
5. 显示与分析：通过染色剂与特定的底物反应，使目标蛋白质发出可见的光信号，然后使用成像系统记录光信号。
最后，使用分析软件定量分析蛋白质带的强度。
二、WB实验的步骤根据上述的原理，WB实验的具体步骤如下：1. 细胞裂解：将待检测的细胞或组织进行细胞裂解，使用细胞裂解液溶解细胞膜，并释放目标蛋白质。
2. SDS-PAGE电泳：将提取的蛋白质样品注入电泳胶槽中，通过应用电场，根据蛋白质的大小和电荷分离蛋白质。
3. 蛋白质转移：将分离的蛋白质转移到膜上，通常使用温和的电压和适当的时间进行转移。
4. 阻断与孵育：在转移的膜上进行阻断处理，再用一抗孵育膜，使其与目标蛋白质结合。
5. 二抗与信号发生物：加入与一抗来源物种不同的二抗，再加入信号发生物，使目标蛋白质产生光信号。
超详细的Western实验步骤及结果分析
超详细的Western实验步骤及结果分析Western实验步骤1. 电泳(Electrophoresis)（1）SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶进行配制，配方试剂去离子水，Arc-HCL(29:1)，10%APS，SDS,TEMED。
一般按分子大小配胶，现实验分离胶配12%-15%的胶，浓缩胶10%的胶。
配胶步骤：1.清洗玻璃板，装好（注意不要漏即玻璃板要对齐）。
2.按比例配分离胶（8ml-10ml）3.加水压胶，待分离胶凝固后（可见有分离胶与水有分隔线，一般凝固时间30分钟-1小时左右），吸走上层水面4.按比例配浓缩胶（3ml-4ml），加入分离胶上层，插入梳子，（注意别有气泡），待凝。
（如果今日不上样可以放入4°C冰箱）注意：玻璃板要洗得干净；玻璃板要装好，不要漏；制胶过程中，一定要充分混匀，而且避免有气泡；（2）样品处理1.准备无菌EP管，向EP管内加入样品蛋白质体积的1/4体积的SDS缓冲液（5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，现样品加3.5ul），之后加入相应蛋白样品（要制冰，蛋白质样品要放置在冰上），充分吹打混匀2.100℃水浴加热5分钟，以充分变性蛋白。
3.12000r离心5分钟。
（3）上样与电泳1.将玻璃板装入电泳槽中，加电泳缓冲液至泳槽的的2/3左右2.蛋白质样品冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可，样品两边加蛋白质Maker(6ul)（注意上样蛋白质顺序，一定不要弄错）。
3.通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为100分钟（一般为90-120分钟）。
设置定时可以避免经常发生的电泳过头。
通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
（为了避免电泳过头，最好是在电泳设定时间的提前30分钟观察电泳）注意：上样时尽量避免样本被上漏出孔外；注意电泳时间的把握；最重要的是一定要记录上样顺序，必要时记录在本子上。
生化实验九 Western_blot的原理、操作
实验九 Western blot的原理、操作及注意事项原理：通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。
一、抗原的选择和制备A：样品的制备1 组织：组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
2 细胞：细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
3 分泌蛋白的提取（特例）：直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。
二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE）A：实际操作1.做胶前的准备1)检查是否有足够的、干净的 spacer、comb 和架子。
2)检查是否有新鲜的，足量10%APS，没有立刻重配。
3)按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。
2.制胶，电泳1）装好架子。
2)按照下面配方配制分离胶。
(单位：ml，Total： 8ml)在胶上面加入一层蒸馏水，促进胶更好的凝集。
3)4)待胶凝集好后，上样，电泳。
上层胶用60-80V电压，当样品至分离胶时，用100-120V 电压。
一般电泳时间在1.5小时左右。
WB实验步骤详解
WB实验步骤详解Western blotting (WB)是一种用于检测蛋白质的技术，它可以分析蛋白质的大小、数量和结构。
WB通常用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的表达水平，以及蛋白质的修饰状态。
本文将详细介绍WB实验的步骤，以帮助读者更好地理解和掌握这一技术。
步骤一，细胞或组织的裂解。
WB实验的第一步是将细胞或组织裂解，以释放蛋白质。
通常使用RIPA缓冲液或其它含有蛋白酶抑制剂的裂解液来裂解细胞或组织。
裂解液中的蛋白酶抑制剂可以防止蛋白质在裂解过程中被降解，保证蛋白质的完整性。
步骤二，蛋白质的分离。
裂解后的细胞或组织中含有大量的蛋白质，需要将这些蛋白质分离出来。
通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）来分离蛋白质。
SDS-PAGE可以根据蛋白质的大小将其分离成不同的条带，方便后续的检测。
步骤三，将蛋白质转移到膜上。
分离后的蛋白质需要转移到膜上，以便进行免疫印迹检测。
通常使用半湿式或全湿式电泳转印系统将蛋白质转移到聚偏氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素膜上。
转印的时间和电压需要根据蛋白质的大小和数量来确定。
步骤四，膜的封闭。
转移完蛋白质后，需要将膜进行封闭，以防止非特异性结合。
封闭通常使用5%脱脂奶粉或蛋白质封闭剂进行，可以有效地减少非特异性结合，并提高抗体对目标蛋白的特异性识别。
步骤五，抗体的孵育。
封闭后的膜需要与特异性的一抗进行孵育。
一抗可以是针对目标蛋白的单克隆或多克隆抗体。
孵育时间和温度需要根据抗体的性质来确定，通常在4°C下孵育一晚上。
步骤六，膜的洗涤。
孵育完一抗后，需要对膜进行洗涤，以去除未结合的抗体和非特异性结合。
洗涤液通常是含有Tween-20的PBS或TBST缓冲液，需要进行多次洗涤以确保膜的干净。
步骤七，二抗的孵育。
洗涤完膜后，需要与特异性的二抗进行孵育。
二抗通常是与酶或荧光素结合的抗体，可以识别一抗并发出特定的信号。
孵育时间和温度需要根据二抗的性质来确定。
步骤八，膜的洗涤。
Western Blot实验步骤及关键分析解析
【分享】个人整理Western Blot！！！1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL 混合，加水稀释到100ml终体积。
过滤后4°C保存。
4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。
过滤后4°C保存。
这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。
5、TEMED原溶液四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。
PH太低时，聚合反应受到抑制。
AP提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。
去离子水配制数ml，临用前配制.6. 10%过硫酸铵溶液：称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，冻存。
7、SDS-PAGE加样缓冲液:在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
8、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，临用前稀释10倍。
PH8.39、转移缓冲液： 2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS(可不加)，200ml 甲醇(临用前加)，加水至总量1L。
wb实验的原理和步骤
wb实验的原理和步骤WB实验的原理和步骤。
一、实验原理。
WB实验，即Western Blot实验，是一种常用于检测蛋白质的实验方法。
它通过电泳将蛋白质分离开来，然后用特定的抗体结合目标蛋白，最后通过化学发光或染色等方法来检测目标蛋白的存在与表达水平。
在WB实验中，主要包括蛋白质电泳分离、转膜、抗体结合和检测等步骤。
下面将详细介绍WB实验的步骤及操作要点。
二、实验步骤。
1. 蛋白质电泳分离。
首先，将待测样品加入SDS-PAGE凝胶槽中，进行蛋白质电泳分离。
电泳结束后，将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
2. 蛋白质转膜。
将电泳分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上，通常采用湿法转膜或半干法转膜。
转膜后，将膜进行封闭处理，以防止非特异性结合。
3. 抗体结合。
将待测蛋白质与特异性一抗进行孵育结合，然后进行洗脱，接着与辣根过氧化物酶标记的二抗结合。
最后再次进行洗脱，以去除非特异性结合。
4. 检测。
通过化学发光或染色等方法来检测目标蛋白的存在与表达水平。
化学发光法是常用的检测方法之一，它通过特定底物的化学反应产生发光信号，用于检测目标蛋白的存在与表达水平。
三、实验操作要点。
1. 实验前的准备工作要做到充分，包括准备好所需试剂、仪器设备的检查和调试等。
2. 在操作过程中要严格遵守操作规程，保证实验的准确性和可靠性。
3. 注意实验中各步骤的时间控制，避免步骤之间的等待时间过长或过短。
4. 蛋白质转膜时要注意膜的完整性和均匀性，避免出现膜上蛋白质分布不均匀的情况。
5. 在抗体结合和检测过程中，要注意洗脱的次数和时间，严格控制非特异性结合的发生。
6. 实验结束后，要及时清洗和维护仪器设备，妥善保存实验结果和数据。
通过以上步骤和操作要点的介绍，相信大家对WB实验的原理和操作有了更清晰的认识。
在进行实验操作时，一定要认真细致，严格按照操作规程进行，确保实验结果的准确性和可靠性。
希望本文对大家有所帮助，谢谢阅读！。
wb实验的原理和步骤
wb实验的原理和步骤WB实验的原理和步骤。
WB实验是一种常用的生物学实验方法，用于检测蛋白质的表达水平。
本文将介绍WB实验的原理和步骤，希望能够帮助读者更好地理解和掌握这一实验技术。
一、实验原理。
WB实验的原理基于免疫学技术，主要包括以下几个步骤：1. 细胞裂解，首先需要将待检测的细胞或组织样品进行裂解，使得蛋白质释放出来。
2. 蛋白质分离，裂解后的蛋白质需要通过电泳或其他方法进行分离，以便后续的检测。
3. 蛋白转移，将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺膜上，通常采用电泳转印的方法。
4. 抗体结合，将特异性的一抗与目标蛋白结合，形成抗原-抗体复合物。
5. 信号检测，通过添加化学发光底物或染色底物，检测目标蛋白的表达水平。
二、实验步骤。
WB实验的具体步骤如下：1. 细胞裂解，将含有蛋白质的细胞或组织样品加入裂解液中，使用超声或搅拌等方法进行充分裂解。
2. 蛋白质分离，将裂解后的蛋白质样品加入聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
3. 蛋白转移，将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺膜上，通常使用半干法或湿法转印。
4. 抗体结合，将膜中的蛋白质与特异性的一抗结合，通常需要进行过夜孵育，以保证抗体与蛋白质的充分结合。
5. 信号检测，通过添加化学发光底物或染色底物，检测抗体与蛋白质复合物的信号，得到目标蛋白的表达水平。
三、实验注意事项。
在进行WB实验时，需要注意以下几点：1. 样品处理，样品的裂解和处理过程需要在低温和无酶的条件下进行，以避免蛋白质的降解。
2. 抗体选择，选择特异性良好的一抗和二抗，以确保实验结果的准确性。
3. 数据分析，对实验结果进行准确的数据分析，包括目标蛋白的相对表达水平和统计学分析。
四、实验应用。
WB实验广泛应用于生物医学研究领域，可以用于检测蛋白质的表达水平、翻译后修饰和相互作用等。
在癌症、免疫学、神经科学等领域具有重要的应用价值。
总之，WB实验是一种常用的蛋白质检测方法，掌握其原理和步骤对于开展生物学研究具有重要意义。
WB原理、步骤及总结.doc
WB原理、步骤及总结实验原理蛋白质印迹是把电泳分离的蛋白质转移到固定基质上，然后利用抗原抗体反应来检测特异性的蛋白分子的技术，包括三个部分：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳转移，免疫印迹分析。
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量，SDS是阴离子去污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏其高级结构。
SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4:1，由于SDS带有大量的负电荷，与蛋白质结合时掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使各种蛋白质带有相同密度的负电荷，形似长椭圆棒，蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系。
因此，利用相对分子质量标准蛋白所作的标准曲线，可以求得未知蛋白的相对分子质量。
电泳后蛋白质分子嵌在凝胶介质中，探针分子很难通过凝胶孔，将蛋白质从凝胶转移到固定基质上可以对蛋白质进行免疫检测分析。
方法有两种：①水平半干式转移即将凝胶和固定基质似三明治样夹在缓冲液浸湿的滤纸中间，通电10~30min可完成②垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电2~4h或过夜可完成。
固定基质通常有硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜。
蛋白质转移到固定化膜上之后，通过蛋白质染料如丽春红S 检测膜上的总蛋白，或用考马斯亮蓝检测凝胶上的蛋白剩余量，以验证转移是否成功。
用抗体作为探针进行特异性的免疫反应检测抗原蛋白，分为4步：①用非特异性、非反应活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由结合区，以防止作为探针的抗体结合到膜上，出现检测时的高背景②固定化膜用专一性的一抗温育，使一抗与膜上的抗原蛋白分子特异性结合③酶标二抗与一抗特异结合④加入酶底物，适当保温，膜上便可见到颜色反应，检测出抗原蛋白区带。
主要溶液10%分离胶水3.3mL、30%丙烯酰胺混合液4.0mL、1.0mol/LTris（pH8.8）2.5mL、10%SDS0.1mL、10%过硫酸铵0.1mL、TEMED0.004mL5%浓缩胶水2.7mL、30%丙烯酰胺混合液0.67mL、1.0mol/LTris0.5mL、10%SDS0.04Ml/10%过硫酸铵0.04mL、TEMED0.004mL1×Tris–甘氨酸电泳缓冲液Tris碱3.03g、甘氨酸18.77g、SDS1g，用去离子水定容至1L2×SDS凝胶加样缓冲液Tris-HCl（pH6.8）100mmol/L，β-巯基乙醇10%，10%甘油，0.01%溴酚蓝，10%SDS转移缓冲液Tris2.45g，甘氨酸11.25g，甲醇100mL，加去离子水至1LTBSTTris1.21gNaCl8.77g，Tween-201mL，加去离子水至1LStripping1.3mLTris（pH6.8），4mL10%SDS，140µlβ-巯基乙醇，用水定容到20mL实验步骤1SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳⑴凝胶配置①分离胶的配置：将配置好的分离胶液混匀后迅速倒入胶槽中，至距离短玻璃板顶端约2cm处，停止灌胶。
WB试验每步原理和技术及试剂的分析
WB试验每步原理和技术及试剂的分析WB（Western Blotting）试验是一种常用的蛋白质分析技术，通过将复杂的混合蛋白质样品进行分离、转移、固定和检测，从而鉴定所感兴趣的蛋白质。
以下是WB试验的每步原理、技术及试剂的分析：1.蛋白质提取：首先需要从细胞或组织中提取蛋白质。
该步骤的目的是破坏细胞膜并释放细胞质中的蛋白质。
蛋白质提取的方法通常包括细胞裂解和蛋白质的沉淀。
-细胞裂解：细胞膜的破裂可以通过机械方法（如超声波破碎仪）或化学方法（如离心及化学裂解剂）来实现。
-蛋白质沉淀：提取的细胞裂解液通常含有其他细胞组分，如核酸、多肽和小分子化合物。
这些杂质会影响后续的蛋白质电泳分离。
因此，本步骤通常会进行蛋白质的沉淀以去除杂质。
常用的沉淀试剂包括三氯醋酸（TCA）和四氯化钛（TCA）。
2.SDS-电泳分离：经过蛋白质提取和沉淀后，将蛋白质样品进行电泳分离。
这是通过SDS-（聚丙烯酰胺凝胶电泳）技术实现的。
该技术利用带负电的SDS（十二烷基硫酸钠）对蛋白质进行界面活性剂处理，使所有蛋白质呈现负电荷，并在线性凝胶中按照分子质量大小进行分离。
-凝胶制备：通常使用7.5%或12%的聚丙烯酰胺凝胶来分离蛋白质。
聚合物原液将与TEMED（N，N，N´，N´-四甲基乙二胺）和铵过硫酸铵（APS）等催化剂混合。
-电泳条件：电泳过程中，将样品加载到凝胶孔上，并在恒定电流下进行电泳。
较大分子量的蛋白质会迁移得更慢，较小分子量的蛋白质则会迁移得更快。
3.蛋白质转移：蛋白质分子在凝胶中的分离只是半成品，需要将蛋白质转移到膜上以进行后续的蛋白质检测。
这是通过蛋白质半湿式或湿式转印技术实现的。
-半湿式转印：在半湿式转印中，凝胶和膜将分别与蛋白质转印缓冲液一起放置在蛋白质转印池中。
经过一段时间的转印，蛋白质将从凝胶逐渐转移到膜上。
-湿式转印：湿式转印利用蛋白质转印缓冲液进行蛋白质转印，凝胶和膜与蛋白质转印缓冲液完全接触，并在恒定的电流下进行转印。
蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项
蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项实验方法原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基乙醇ddH2O甘氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24 g；加ddH2O至1000 ml。
5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸 2 ml；ddH2O118 ml。
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wb实验WB实验导言：WB实验（Western Blotting）是一种广泛应用于生物医学研究中的实验技术，它通过将蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，再将被分离的蛋白质转移到聚乙烯膜或硝酸纤维素膜上，最后使用特定抗体对目标蛋白质进行检测。
本文将详细介绍WB实验的基本原理、步骤和应用。
一、基本原理1.1 蛋白质电泳分离在WB实验中，首先将待测蛋白质与断裂蛋白质加入SDS-PAGE （聚丙烯酰胺凝胶电泳）胶液中，然后通过电泳，根据蛋白质的分子量以及电荷特性，将蛋白质从胶液中分离出来。
当电流作用于聚丙烯酰胺凝胶时，蛋白质会根据其电荷和分子量的不同，在电场中迁移。
1.2 蛋白质转移接下来，将蛋白质从SDS-PAGE胶液中转移到固定在聚乙烯膜或硝酸纤维素膜上。
这一步骤通常使用电泳转移装置，通过电流将蛋白质从凝胶中转移到膜上。
此过程可以进一步将蛋白质进行定量或定性分析。
1.3 特定抗体检测转移完成后，利用特定抗体对目标蛋白质进行检测。
特异性抗体与目标蛋白质结合后，通过化学或光学方法可可视化目标蛋白质。
常见的可视化方法包括荧光染色、酶联免疫吸附试验（ELISA）和放射性探针等。
二、实验步骤2.1 样品制备样品的制备是WB实验的关键步骤之一。
需要将待测蛋白质从细胞或组织中提取出来，并进行蛋白质浓度的测定。
可以使用细胞裂解液来破坏细胞膜，释放蛋白质。
同时，可以使用加热和还原剂来使蛋白质在电泳过程中分离。
2.2 SDS-PAGE电泳分离将样品和标准蛋白质分别加载到预制的凝胶槽中。
开启电源，设定适当的电流和运行时间，进行电泳分离。
分离完成后，将凝胶放入转移装置中。
2.3 蛋白质转移将凝胶转移到聚乙烯膜或硝酸纤维素膜上。
同时提供足够的电流，并根据蛋白质大小和热力学性质设置适当的时间，以确保蛋白质可以完全转移到膜上。
2.4 特定抗体检测将蛋白质膜进行一定的前处理步骤，如预浸泡、阻断和洗涤。
然后，加入特定的一抗，与目标蛋白质结合。
wb实验的原理和步骤
wb实验的原理和步骤WB实验的原理和步骤。
WB实验是一种常用的蛋白质检测方法，它可以用来检测目标蛋白在细胞或组织中的表达水平，是生物学研究中常用的实验技术之一。
本文将介绍WB实验的原理和步骤，希望能够帮助读者更好地理解和掌握这一实验技术。
一、实验原理。
WB实验的原理主要基于蛋白质的电泳分离和免疫印迹技术。
首先，将待检测的蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后将分离后的蛋白转移到聚丙烯酰胺膜上，接着用特异性抗体与目标蛋白结合，最后通过化学发光或显色反应来检测目标蛋白的表达水平。
二、实验步骤。
1. 样品制备，将待检测的蛋白样品加入SDS-PAGE样品缓冲液，加热变性，然后进行电泳分离。
2. 凝胶电泳，将样品加载到SDS-PAGE凝胶孔中，连接电源进行电泳分离，直至蛋白样品分离完全。
3. 转膜，将分离后的蛋白转移到聚丙烯酰胺膜上，可以选择湿式转膜或半干式转膜的方法，转膜时间和电流密度需要根据蛋白的大小和数量进行调整。
4. 封闭，将转膜后的膜放入封闭液中，封闭蛋白质膜上的非特异性结合位点，减少后续免疫印迹过程中的非特异性结合。
5. 抗体结合，将封闭后的膜与特异性一抗抗体孵育，使抗体与目标蛋白结合。
6. 洗膜，将膜进行多次洗涤，去除未结合的抗体。
7. 二抗结合，将膜与辣根过氧化酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。
8. 洗膜，将膜进行多次洗涤，去除未结合的二抗。
9. 显色或发光，根据实验需要选择化学发光或显色反应，观察目标蛋白的表达水平。
三、实验注意事项。
1. 样品制备时需加入还原剂和变性剂，使蛋白完全变性并且带有负电荷，便于电泳分离。
2. 蛋白转膜时，需保持膜的完整性，避免出现气泡和损坏，影响后续的免疫印迹效果。
3. 免疫印迹过程中的抗体孵育和洗膜步骤需要严格控制时间和条件，以保证特异性结合和减少非特异性结合。
4. 显色或发光反应的时间和条件也需要根据实验情况进行优化，以获得清晰的实验结果。
实验时间WB详解（原理、试剂、步骤及问题解答）
实验时间WB详解（原理、试剂、步骤及问题解答）Western Blot 实验原理WB 是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
Western Blot 分类根据显色方法主要有以下几种：i.放射自显影ii.底物化学发光 ECLiii.底物荧光 ECFiv.底物 DAB 呈色现在常用的有底物化学发光 ECL 和底物 DAB 呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用 HRP 标记）：反应底物为过氧化物 + 鲁米诺，如遇到 HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
实验常见的问题指南01参考书推荐A. 对初学者看什么资料比较好？解答：《抗体技术实验指南》和Antibodies（a laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane）两本书不错。
02针对样品的常见问题此处内容较多，有部分答案省略，想查看更多详情，请点击【阅读原文】查看。
B. 做线粒体膜 UCP2 蛋白的 Western Blot（以下简写成 Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120 μg，换了个santa cloz 的一抗仍不行。
是什么原因？蛋白酶抑制剂单加 PMSF 行吗？解答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。
同时，建议检查Western Blot 过程，提高一抗浓度。
对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF 就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。
C. 细胞水平要做Western Blot，多少细胞提的蛋白够Western Blot？解答：一般地 5* 106 就足够了。
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WB 试验每步原理和技术及试剂的分析 整理 by 李栋 2008 年 9 月 27 日星期六
同位素；而后者由于直接显色而操作简便且成本低。最为大家熟悉当数辣根过氧化物酶 HRP（Horseradish Peroxidase， 属于过氧化物酶 POD 类）和碱性磷酸酶 AP（Alkaline Phosphatase），此外还有比较少见的葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase）、β半乳糖苷酶β-Galactosidase。
Hyperfirm ECL/CCD
虽然延长信号持续时间让研究人员能充分利用成像系统的所有特点，但低极限的灵敏度才是研究者期望的终极目 标。除了拥有王牌产品 ECL 的 GE 公司，化学发光底物方面不得不提到 Pierce 公司。Pierce 形象广告十分有趣鲜明： 用不同色彩的手掌印来表示 Pierce 真的很有一手:）。这家已经有半个世纪历史、在蛋白质化学领域声誉卓著的的公司 6 年前与 HyClone 合并，拥有世界上最优秀的 HRP 化学发光底物生产技术——世界上许多知名的化学发光底物试剂盒 厂商都采用 PIERCE 提供的化学发光底物作为生产原料。其中最耀眼的璀璨之星是 SuperSignal 系列，就像印证上面我 们提到的选择显色系统的标准一样，SuperSignal 灵敏度高（有 10-12g 级，10-14g 级，10-15g 级选择），发光持久（6-24 小时），可反复曝光，稳定性好（室温贮藏 6 个月，4℃至少是 12 个月），节约抗体（由于灵敏度高，一抗二抗稀释 倍数是同类产品的 10 倍以上，这对于宝贵一抗来说十分重要）。让人几乎无法从中挑出毛病来，如果说有的话，当然 就是希望便宜一点，再便宜一点罗。另外需要提醒的是抗体一定要比底物显色法中稀释更多倍数，不然过于灵敏（背 景高）可不能怪 Supersignal 哦，还有记得不能拿叠氮钠来当防腐剂――因为叠氮钠会抑制 液要用棕色瓶避光保存。Pierce 的很有一手不仅仅于此，还有更好玩的东西——不用转膜直接在 PAGE 胶上做 Western Blot 的好东西！且看生物通后面慢慢介绍。
WB 试验每步原理和技术及试剂的分析 整理 by 李栋 2008 年 9 月 27 日星期六
WB 试验每步原理和技术及试剂的分析 WB 蛋白印迹在生物化学这一块是常规实验，就像有人说炒菜中境界最高也最难的是蛋炒饭一样，实验中常规实 验也是很考验技能的，除了潜心研究原理、认真揣摩技巧以外，对于新实验试剂的信息把握，勇于尝试新方法也是非 常之重要的——各大厂家都在不断开发更方便更灵敏的新产品，“idea 是生产力”嘛，因此生物通这里介绍一些能把 我们从日常操作中解脱出来，获得“升级版”效果 WB 产品。 讲完了 Western Blotting 的电泳转移仪器，蛋白分子量标准和转移膜之后，我们最后来探讨一下 WB 的检测系统。 一般的 WB 检测过程中，都会有封闭、一抗、二抗和底物显色这四道工序要“加工”。我个人觉得底物显色这最后一 步是最关键的，也是最有文章可以作的一个部分。你看，光标记方式就有生物素标记，地高辛标记，各种酶标记等等， 酶标的底物又有各种生色底物、化学发光法底物和荧光底物可供选择；就连识别一抗的配体也不一定非要二抗不可， 也可以是抗生物素蛋白，链亲和素或者 Protein A 或 G 等，更别说各种试剂盒琳琅满目，叫人好像无从下手！不过不急， 生物通帮你作个参考，让你对各种产品的优点缺点一览无遗，真正成为一个 WB 高手。另外如果实验室有已经建立的 固定的显色方法，那也没关系，有时候不经意浏览到的方法可能就会对你的实验有莫大的帮助——这也就达到我们的 目的了。 封闭和一抗的选择没有太多的选择余地——封闭前面介绍过了；一抗？现在的抗体产品说明书一般都有注明应用 范围的，说明可以用于 WB 的就 OK。如果没有这些信息可以遵从以下原则：单抗专一性高，但是经过 SDS-PAGE 变 性胶电泳的蛋白质可能由于原来的识别位点构象发生改变而不被识别，多抗不如单抗专一性高但更容易得到结果。如 果还有多种抗体选择，那当然是来源于兔或者小鼠抗体为好，因为后继的检测试剂盒一般都是针对兔鼠的居多，因而 选择范围更大通用性也更强。除了无标记的一抗，还有生物素等各种标记一抗。还听说有用荧光标记的一抗直接检测 而降低背景和非特异结合，不过由于少了二抗的级联放大信号扩增，信号也会比较弱，所以需要选择荧光信号特别明 亮的标记（Invitrogen 收购了著名的 Molecular Probes 后有推出 Alexa Fluor 的抗体标记试剂盒，生物通这里有详细而精 彩的介绍，我们就不罗嗦了。毕竟不是 WB 的主流方法。）一抗的稀释度通常需要预实验摸条件，可以根据说明书上 建议的 WB 稀释度附近做 2—3 个梯度，如果是用化学发光法检测，由于灵敏度高而建议将稀释度再放大一些。 二级试剂的作用是信号扩增，选择是根据一抗的标记形式而决定的，对于无标记的一抗，可以选择对应一抗来源 种属的标记二抗，或者更便宜的标记蛋白 A（来自金黄葡萄球菌 Protein A 可以高度亲和来自人，兔，豚鼠的 IgG，但 对大鼠、山羊和鸡的 IgG 亲和力弱）。不过，二抗是更可靠的选择——除了要选择对应一抗的来源种属，也要根据你 准备采用的检测方法选择合适的标记。
. HRP 辣根过氧化酶是最常见的酶促发光或显色的交联酶，由于 HRP 比活高、特异性更强、分子量小（40kD）、 稳定和作用底物范围广的优点而得到广泛使用。HRP 的底物种类有不少，主要可以分为化学发光底物和生色底物 2 大 类。对于底物的选择，主要考虑的是灵敏度、背景和使用的方便性和稳定性——比如底物可溶性高使用就比较方便； 对于 WB 来说产物不可溶有助于信号在原位的积累和结果的稳定（产物可溶的底物更适合于 Elisa）。
Secondary antibody
Up to 1:500 000
Up to 1:15 000
Up to 1:200 000
Blocking Agent included
Yes-ECL Advance Block
Certain systems
Certain systems
Simple reprobing Yes
protocols
Yes
Yes
Emission duration
4-6 h
1-2 h
24-18 h
Recommended membrane
Hybond-P or Hybond ECL
Hybond ECL
Hybond-P
Recommended detection
Hyperfirm ECL/CCD
Fluorescent Scanner/ Hyperfirm ECL/CCD
ECL Plus High sensitivity Western blotting and chemifluorescent detection on scanners Up to 20 times greater than ECL Very Good Up to 1:20 000
3
WB 试验每步原理和技术及试剂的分析 整理 by 李栋 2008 年 9 月 27 日星期六
底物
DAB
4-CN
AEC
TMB
学名
3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride
4-chloro-1-naphthol
3-amino-9-ethyl carbazol
3,3,5,5 tetramethylbenzidine
分子量
214.14
178.58
210.28
240.4
2 WB 试验每步原理和技术及试剂的分析 整理 by 李栋 2008 年 9 月 27 日星期六
WB 试验每步原理和技术及试剂的分析 整理 by 李栋 2008 年 9 月 27 日星期六
易成像的优点，能获得很好的黑色沉淀成像。用金属离子增强信号的 DBA 显色试剂灵敏度可以高达 20pg。TMB 的 signal-to-noise 信噪比高，成分安全，特别合适于灵敏度要求高的 WB，但是也要避免由于灵敏度高而引起的高背景， 因此可以相应的延长封闭的时间和注意洗涤的次数；ACE 各方面性质与 DAB 相似，但灵敏度要比 DAB 差一点。
Sensitivity
Up to 10 times greater than ECL Plus
Up to 10-12g
Antibody economy
Outstanding
Good
Primary antibody
Up to 1:100 000
Up to 1:10 000
WB 试验每步原理和技术及试剂的分析 整理 by 李栋 2008 年 9 月 27 日星期六
ECL Advance
ECL
Recommended applications
Highest sensitivity Western blotting primary antibody and/or target is very low abundance
Routine Western blotting
GE Healthcare（原安玛西亚）的 ECL 堪称是经典，ECL 在许多研究人员心目中的几乎成为化学发光法的代名词， 有时竟然是高品质文章的保证之一，可见其经典。后来推出的 ECL Plus 和 ECL Advance 不单将检测灵敏度提高了 10 —20 倍，发光时间也长达 24 小时以上，兼容 CCD 成像系统的检测，使得 ECL 系统继续领导潮流。前不久 GE Healthcare 公司在生物通上发布了 ECL 全系列的 65 折特价优惠，价格相当吸引，对于 ECL 的忠实粉丝们实在不该错过。
酶促反应比同位素安全且快速，已经成为 Western Blot 的主流检测方法。酶促反应可以搭配不同的底物从而实现不 同的显色方法：化学发光 Chemiluminescent 和底物显色 Colormetirc/Chromogen，前者灵敏度很高——随着各大厂家努 力开发研制灵敏度更高的发光底物，化学发光法的灵敏度已经达到 pg 级别，甚至还有 Femto 级别的，灵敏度超过了