化学发光方法学比较

免疫学技术的迅速发展对精度的要求越来越高，一般的酶免检测技术已逐渐无法适应这种形势的需要。

现今发展的主流已不再是用放射性同位素标记的测定方法(避免污染环境及对人体损害)，而是转向于能在任何地方操作的快速均相和固相测定，最终趋向于能够枪测到皮克或10负18摩尔级的、非同位素的、自动或半自动的实验室测定技术，发光免疫分析技术顺应了这一潮流，开创了免疫诊断的新纪元。

发光免疫分析是一种灵敏度高、特异性强、检测快速及无放射危害的分析技术。

70年代末以来得到了迅速发展，目前在国际上已经实现商品化和产业化的发光免疫分析产品，基本上可以分为：化学发光、时间分辨荧光(也称时间延迟光致发光)、电化学发光(也称场致发光和电致发光)几种。

1、化学发光化学发光是指在化学反应过程中发出可见光的现象。

通常是指有些化合物不经紫外光或可见光照射，通过吸收化学能(主要为氧化还原反应)，从基态激发至激发态。

退激时通过跃迁(或将激发能转移至受体分子上)，释放能量产生光子，以光形式放出能量从而导致的发光现象。

其主要特点为消耗发光剂。

同时量子效率相对较低。

1.1 按化学反应类型分类：可分为酶促化学发光和非酶促化学发光两类。

其中酶促化学发光主要包括辣根过氧化物酶(HRP)系统、碱性磷酸酶 (ALP)系统、黄嘌呤氧化酶系统等。

酶促发光的共同特点为发光过程中作为标记物的酶基本不被消耗，而反应体系中发光剂充分过最，因此发光信号强而稳定，且发光时间较长。

因此可采用速率法测量，故检测方式简单、成本较低。

酶促反应的主要缺点为工作曲线可能随时间漂移，而且低端斜率容易呈非线性下移。

而非酶促化学发光包括吖啶酯系统、草酸酯系统、三价铁一鲁米诺系统等。

非酶促发光的共同特点为发光过程中标记物被消耗，同时作为标记物的发光剂是发光反应的瓶颈，即含量总是相对不足，因此发光信号持续时间较短；如果直接在免疫反应杯中启动发光反应，由于发光剂被很快消耗，故只能进行一次性测量。

所以重复性较差。

为降低检测成本并实现重复测量，目前普遍采用原位进样加流动池的时间积分测量方式。

因此仪器成本及维护费用较高，而且反复使用的流动池可能导致交叉污染；并目冲洗或进样中产生的气泡也会干扰测定；同时繁琐冗长的冲洗过程也会成为提高检测效率的瓶颈。

另外，使用磁性或非磁性微粒时，强烈的散射吸收作用也会降低灵敏度。

1.2 按发光持续时间分类：可分为闪光和辉光两类，闪光型发光时间在数秒内，如吖啶酯系统。

其检测方式一般采用原位进样和时间积分法测量，即在检测器部位加装进样器，并保证加入发光剂和检测2个过程同步进行；同时以整个发光信号峰的面积为发光强度。

而辉光型发光时间在数分钟至数十分钟以上，如HRP一鲁米诺系统、ALP—AMPPD 系统、黄嘌呤氧化酶-鲁米诺系统等。

其信号检测无需原位进样，一般以速率法测量，即在发光信号相对稳定的区域任意点测量单位时间的发光强度。

测量化学发光反应的光强度，求得某些化学物质和生物物质的含量，尤其与免疫学方法结合以后形成的化学发光免疫测定法(CLIA)，其既具有发光检测的高度灵敏性，又具有免疫分析的高度特异性，检测快速，试剂无放射危害，检测限达10负15 mol／L。

1.3 评价：化学发光标记物已广泛应用于抗原、半抗原和抗体的检测，与放射性核素标记物相比较，它的优点在于安全(无放射危害)、稳定、测量快速、灵敏度高、线性范围宽、自动化程度高、减少了人为的误差。

检测快速缩短了等待结果的时间，无需批量检测可随到随测保证及时提供结果。

缺点在于一般化学发光是标记催化酶或化学发光分子的发光反应，一般发光不稳定，为问断的、闪烁性发光，而且在反应过程中易发生裂变，导致反应结果不稳定。

此外。

检测时需对结合相、游离相进行分离，操作步骤多，测试成本高。

主要问题是化学发光的产生通常是瞬间完成的，发光的峰值很快衰减，再是本底较高和干扰妨碍应用。

1.4 代表仪器1.4.1 美国拜耳公司最新诊断产品——ACS：180系列全自动化学发光免疫分析系统，以吖啶酯作为标记，量度AE标记物化学反应所产生的光量为基础，灵敏度可达10负15 g／mL。

1.4.2 美国雅培公司生产的AxSYM系列全自动免疫发光分析仪将3种技术于一机，可用于非均相标记微粒子酶免发光分析(MEIA)、离子捕捉发光分析(ICIA)和均相标记荧光偏振免疫发光技术(FPIA)，目前已有80多个检测项目可供临床应用。

1.4.3 美国贝克曼库尔特公司AccessOR全自动微粒子化学发光免疫分析系统。

采用ALP-AMPPD发光系统，以微粒子作为载体，表面积大、结合快、达到最大发光信号时间短、反应及分离速度快，缩短了分析时间，有效提高了灵敏度和准确性。

该系统可全自动控制整个测定和数据分析处理，具有批量和任选测定24个项目的能力和急诊插入功能，平均检测速度100/h。

冷藏试剂盘可放24种试剂，探针直接插入试剂盒并自动封闭，直至试剂用完，不污染不浪费。

超声波技术被用于搅拌使微粒悬液混均匀并加速反应，用于探针取样液面检查保证取样准确，用于洗涤时减少交叉污染。

使用AccessOR的用户还可以申请Internet全球通讯网络，进行通讯查询。

AccessOR独特的塑料智能化外形设计，使其从外观到内在品质，给人们留下深刻的印象。

1.4.4 美国DPC公司全自动化学发光免疫分析仪IMMULlTE，以ALP为标记物，以金刚烷作发光底物，测定灵敏度相当于10负21mol ／ml的酶，采用聚苯乙烯珠作载体，其检测水平已能达到10负12g／ml。

目前能够检测性腺类、甲状腺功能类、肿瘤标记物类、传染病类、细胞因子类、血液病类、糖尿病类、肾上腺功能类、治疗药物类、成瘾药物类、短肽及其他分析物类，还能提供象肌钙蛋白(TNI)这类急诊项目的快速诊断试剂盒。

2、电化学发光分轿2.1 电化学发光2.1.1 电化学发光的原理是对电极施加一定的电压进行电化学反应，反应的产物之间或与体系中某种组分发生化学发光，用普通光学手段测髓发光光谱军Ⅱ强度从而对物质进行衡量分析的一种方法。

与化学发光有所不同，其差异在予氧化反应是通过电极上的电化学反应产生的，而不是氧化剂或发光剂自身内氧化产生，其标记物为三联吡啶钌及其衍生物Ru(bpy)3 2+，并以三丙胺(TPA)为还原荆。

如图1所示，Ru(bpy)32十穰TPA分剃在弼投袅嚣氧化成Ru(bpy)3 3+搬TPA的阳离子自由基IPA+，IPA+迅速脱去一个质子形成TPA自由基，TPA具有强的还原性，从而把Ru(bpy)3 3+还原为激发态的Ru(bpy)3 2+，后者发射一个620 nm的光子回到基态再参与下一次电化学发光。

必需0.01毫秒就可发出稳定的光，每毫秒几十万次的循环电化学发光，大大提高了分析的灵敏度。

另外，通过电极反应在线制备了不稳定的发光剂Ru(bpy)32+TPA，避免了直接使用Ru(bpy)3 2+对分析测试的影响。

2.1.2 电纯学发光的主要特点是发光过程中的标记物基本不被消耗，丽反应体系中其他成分充分过量，因此发光倍号强而稳定，且发光时间较长。

其缺点为测量方式复杂、仪器成本及维护费用高；同时环境及样品中同类元素也存在较弱的本底干扰。

反复使用的流动池可能导致交叉污染；而冲洗或进样中产生的气泡也会干扰测定；同时繁琐冗长的冲洗过程也会成为提高检测效率的瓶颈。

另外使用磁性或非磁性微粒时，强烈的散射吸收作用也会降低灵敏度。

2.2 免疫电化学发光分析：集电化学发光、生物素一抗生物索、免疫分析和由固相免疫分析发展起来的磁微球等技术于一体，是众多学科交叉的研究领域。

免疫学的核心问题是抗原一抗体的特异性结合，主要采用固相的方法，即将抗原或抗体固定到磁微球上，经免疫反应后，在固相载体磁微球上形成抗原一抗体复合物，外加磁场沉降这种复合物，然后洗涤除去多余或游离的抗体或抗原，然后进行电化学发光测定。

与一般免疫反应类似，可分为直接法、双抗体夹心法和竞争法。

2.3 免疫毫纯学发光鹣瘟曩毫纯学发光综合了光学、电子学、生物学、免疫学和计算机，禚临床中可糟予以下几个方面。

(1) 蛋白质和激素测定：电化学发光技术在激素的测定中有替代放射免疫的趋势。

可检测甲状腺激素、促甲状腺激索、性激素、雌二醇、促卵泡激索、促黄体激索、人绒毛膜促性腺激素、胰岛素、胰岛素样生长因子、甲状腺降钙素、肿癌标志物、前列腺特异性抗原、肌钙蛋白、甲胎蛋白、癌胚抗原、肿瘤坏死因子、r干扰素、人体肿瘤相关糖蛋白、自细胞介素系列等。

2.3.1 毒素与病毒抗原分析：如肉毒杆菌毒索、蓖麻蛋翻、霍乱亚基和葡萄球菌肠毒素等，检测限达10-15g。

还有炭疽杆菌芽孢、伤寒沙门菌、鼠疫抗原等沙门菌和。

O一157病毒等。

2.3.2 DNA／RNA核酸序列分析：在核酸分析中利用电化学发光技术将Ru(bpy)3+标记引物或探针进行DNA杂交分析或聚合酶链反应，是实验室定量分析标本中核酸含量的一种有发展前景的检测方法。

该技术述可用于检测乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒等其他致病性病毒和病原微生物。

2.3.3 其它物质的检测：还可对其他一些微量物质进行测定，如维生索、叶酸、免疫球蛋白及酶类，人免疫球蛋白、人血清清蛋白、人中性粒细胞溶菌酶、葡萄糖和除草荆等。

2.4 评价：电化学发光是一种电促发光技术，采用的是特殊的化学发光剂Ru(bpy)3+作为标记物并在发光反应中循环使用，既避免了同位素的半衰期短及放射蚀危害，又克服了酶标记的不稳定性，而标记物很稳定，在室温下半衰期大于1年；同时还结合了90年代初期问世的链霉亲和素的新型固相技术，不但使检测的融敏度大大提高，而且还可自动分离游离相和结合相，使检测更易实现自动化。

电化学发光的反应时间仅为20 min，而且标准曲线储存在条码中，每次测定只需一点标定，Ru(bpy)3+的稳定性很好，在室温下半衰期长达1年。

这些优点决定了操作的快速、简捷，无需经常校正。

因此该技本与其它的分析手段比较，在免疫学检测中有显著的优势。

它的优点除了灵敏度高、特异性强、检测快速外，更为可取的是所用试剂毒性低，无放射性危害，并且有良好的稳定性。

以最易受影响的促甲状腺素为例，35℃3周后，电化学发光试剂仍然稳定。

电化学发光分析方法多样，适用面较大，广泛地应用于抗原、半抗原和抗体的免疫梭测。

其线性范围也较宽，符合临床检验的需要。

耐它与普通的化学发光比较，前者为电促发光，在电极表面通过三角形脉冲电压的激发产生稳定、连续、高效的发光，后者则是标记辣根过氧化物酶作用下催化化学发光剂(如鲁米诺、吖啶酯等产生不稳定、间断、闪烁性的发光)，基反应过攘中容易发像裂变恧使结果不稳定。

电亿学发光测定的照光度裰据释放光子的波长仍属荧光测定酶范畴，但与直接的荧光发光不同，荧光发光的灵敏度受荧光发光的本底和光学部件散射光的影响，适应范围也较低。