3.小鼠解剖及动物原代细胞培养
小鼠的解剖及组织观察实验报告
小鼠的解剖及组织观察实验报告一、实验目的1、熟悉小鼠的外部形态和内部结构。
2、掌握小鼠的解剖方法和操作技巧。
3、观察小鼠主要器官的组织形态和结构特点。
二、实验材料1、实验动物：健康成年小鼠若干只。
2、实验器械：解剖盘、解剖剪、镊子、手术刀、大头针等。
3、实验试剂：75%酒精、生理盐水等。
三、实验步骤（一）小鼠的处死1、采用颈椎脱臼法处死小鼠。
用左手拇指和食指捏住小鼠的头颈部，右手拉住小鼠的尾巴，将小鼠头部用力向后上方牵拉，使小鼠的颈椎脱位，迅速死亡。
（二）小鼠的外部形态观察1、观察小鼠的整体外形，包括体型、毛色、头尾、四肢等。
2、注意小鼠的性别特征，雄鼠的生殖器距离肛门较远，有明显的睾丸；雌鼠生殖器距离肛门较近。
（三）小鼠的解剖1、将处死的小鼠仰卧固定在解剖盘上，用大头针固定四肢。
2、用酒精棉球擦拭小鼠腹部的皮毛，使其湿润。
3、用手术刀在小鼠腹部正中线从胸骨剑突下至耻骨联合处做一个纵切口，然后沿两侧腹股沟向左右横切，小心地剥离腹部皮肤。
4、沿腹白线切开腹壁肌肉，暴露腹腔。
注意不要损伤腹腔内的脏器。
5、观察腹腔内的脏器位置和形态，依次辨认肝、胃、肠、脾、肾等器官。
（四）小鼠器官的观察和组织取样1、肝脏：观察肝脏的颜色、质地和分叶情况。
用镊子轻轻夹取一小块肝脏组织，放入盛有生理盐水的培养皿中，用于后续的组织切片制作。
2、胃：观察胃的形态和位置，区分胃的贲门、幽门和胃体。
3、肠：观察小肠和大肠的区别，注意肠壁的结构和肠系膜的分布。
4、脾：观察脾的形状和颜色，注意其与周围组织的连接。
5、肾：观察肾的位置、形态和颜色，区分皮质和髓质。
（五）小鼠胸腔的解剖1、用剪刀小心地剪断肋骨，打开胸腔，暴露心肺等器官。
2、观察心脏的外形和位置，区分心房和心室。
3、观察肺的形态和颜色，注意其与气管的连接。
（六）小鼠组织切片的制作和观察（如有条件）1、将取好的组织块经过固定、脱水、包埋、切片等步骤制作成组织切片。
2、用苏木精伊红（HE）染色法对切片进行染色。
解剖小白鼠实验
实验步骤
动 物 细 胞 原 代 培 养 过 程 图
方法与步骤
（1）动物拉椎处死 （2）取肝及剪碎：剖开腹部，将肝脏取出，放
入小培养皿中，用PBS液洗涤1次；将肝剪成 1mm大小的块，再用PBS液洗涤2次，直到液体 澄清。
（3）消化及分散组织块：将上述清洗过的 组织放入试管内，加入的0.25％胰蛋白酶 液，完全没过组织，置37℃水浴中消化 20 ～ 30min，每隔10min摇动一次，直到 组织块变得疏松，粘稠，且颜色略变为白 色为止。取出试管，吸去胰蛋白酶液，加 入5ml培养液，用吸管反复吹打组织块， 使其分散成细胞悬液，取上清液至另一试 管中。
倒置显微镜
自动双重纯水蒸馏器 纯水仪
培养板
培养瓶
实验材料
2月龄的小鼠
实验试剂
（1） 1640-RPMI培养液 （2） 小牛血清 （3） 青、链霉素 （4） PBS液 （5） 5％NaHCO3 （6） 75％酒精
实验步骤
一、培养前的准备工作
（1） 清洗与消毒 （2） 配制溶液 （3） 紫外线消毒 （4） 洗手和着装 （5） 进入无菌室
滤器
滤器工作原理
CO2培养箱
CO2培养箱设定的条件为37 ℃ ，5％CO2 。
使用CO2培养箱应注意的问题：
①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松， 以保证通气。
②保持培养箱内空气干净。定期消毒 （90℃ ，14 h)。
③箱内无菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以 保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。
（4）观察与计数：从细胞悬液中取出1 滴滴于载玻片上，显微镜下观察细胞的 数目。看到球型的细胞，证明消化下来 细胞，实验成功。
作业:
1.在细胞培养过程中如何防止污染?
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代之flamerking图文版[精华]很多战友发email或PM向我询问小鼠MSC的培养方法，我零零散散地一个个回复过几次，由于我平时时间不是很多，所以回答地时候有些内容写的不是很详细。
今天又有一个战友PM我，询问我培养方法。
看来做小鼠MSC的战友越来越多。
一遍遍地重复写很费时间（想粘贴复制又找不到上次写的在哪～惨！），所以我想还是发贴公布一下。
其实我小鼠MSC在我的课题中不是主角，只是起一个control的作用，因此我在这方面的经验可能没有一些专门做小鼠MSC的战友丰富，不过我还是很愿意把我的经验写出来供大家参考，希望能够起到“抛砖引玉”的作用。
欢迎各位同道对我的方案进行批评和指正，与大家一起分享你们的经验和智慧。
提纲一，简版主要步骤及操作要点。
二，完整版1. 试剂及材料准备2. 动物手术及取材3. 原代细胞培养4. 细胞传代5. 讨论时间关系，今天先给个简版。
我先顶一下,由于我还是新手,故不能说是经验介绍,只好讲让你们指出缺点,谢谢斑竹1. 试剂及材料准备MEM,10%FCS,手术器械,培养瓶,200目滤网,5ml注射器2. 动物手术及取材CR小鼠1只,酒精浸泡5分钟,取股,胫,肱骨,用基培冲出骨髓,滤过,1000转离心,完培重悬,接种于25厘米培养瓶3. 原代细胞培养:,3天后首次换液,自己发现一周贴壁细胞就铺满达90%,自行传代4. 细胞传代:消化下来很少,能下来的增长很慢5. 讨论:没经验欢迎斑竹的继续讲解,希望有经验的老师们能不啬指教羽之无限版主,能有空再讲讲吗这几天,我的原代就是不长,42天了,25平方厘米的培养瓶还未铺慢,不能传代真是天天盼着你啊呵呵，不好意思，最近我的sony笔记本又坏了，上次坏了几次维修部修不好，给我换了台新的，结果以用了没2个月又不能启动了，真是麻烦，我的资料都在里面，最近实验又忙，没空去维修部……不过明天我就去了。
……呵呵，跑题了。
小鼠背根神经节神经细胞的原代培养新方法
小鼠背根神经节神经细胞的原代培养新方法小鼠背根神经节神经细胞原代培养是神经学研究、药物筛选及细胞病理学研究中必不可少的一环。
本文将介绍一种新的小鼠背根神经节神经细胞原代培养方法的步骤及注意事项。
步骤1: 动物处理。
用取出小鼠的背根神经节放入无菌的PBS缓冲液中搅拌7-8分钟，使神经节中的细胞离体，并通过多次离心来去除PBS缓冲液。
步骤2: 细胞悬浮。
将含有神经细胞的细胞悬液用1mL冰冷的PBS缓冲液洗涤2次。
再用1mL冰冷的70%酒精进行紧密覆盖，静置5分钟。
再用PBS缓冲液洗涤5次，最后用DMEM/F-12添加10%胎牛血清（FBS）调整至适当浓度。
步骤3: 细胞培养。
将细胞悬液转移到含有0.1%聚赖氨酸的DMEM/F-12培养基中，距离表面1cm左右，进行孵育24-48小时。
孵育室应控制在37℃的恒温条件下，同时CO2含量应设定在5%。
步骤4: 原代细胞出现。
24-48小时后，可见到原代神经细胞在培养皿中生长，而其他非神经细胞则无法生长。
这是因为神经元比其他细胞易受到聚赖氨酸的作用，从而对组织细胞进行筛选。
步骤5: 细胞传代。
当原代细胞数量足够时，可进行细胞传代。
将同等的DMEM/F-12培养基中加入0.5%胰酶，将原代细胞取下进行培养。
注意事项：1.处理过程中必须保持无菌，防止微生物污染。
2.神经节处理过程中的时间要注意，过久会导致细胞死亡，过短则分离不完整。
3.使用的培养基及化学试剂要质量优良。
4.培养条件要严格控制，CO2含量及温度要保持恒定。
本文介绍的方法较为简单易行，对于初学者或初学者也容易了解。
但细胞培养中实验操作需要非常谨慎，为保证实验的准确性和有效性，一定要保证实验过程中的无菌、温度、CO2含量和实验技术的高效性。
动物细胞原代培养和传代培养中的培养方法
动物细胞原代培养和传代培养中的培养方法1. 引言嘿，大家好！今天咱们聊聊动物细胞的培养，听起来可能有点高大上，但其实就像种花一样，只是“花”是细胞，养护的方法也有讲究。
说白了，细胞也有自己的“家”，咱们得给它们创造个舒适的环境，让它们在里面嗨起来！接下来，我就带你走进这个充满神奇和乐趣的细胞世界。
2. 原代培养2.1 什么是原代培养？原代培养，简单来说，就是从活体动物身上直接提取细胞，然后把它们放在培养皿里，就像把新鲜的花插进水里一样。
你知道吗，这些细胞就像刚从大自然里来的小家伙，特别活泼，适应能力强。
不过，这可不是随便就能搞定的，得有点技术活。
2.2 原代培养的方法首先，咱得准备好一切工具，这可是基础中的基础，不能马虎。
咱们要用到无菌技术，确保培养环境干净得像新洗的碗，不然细胞们就会遭殃。
提取细胞时，通常会用胰酶把它们从组织中“松开”，就像剥开一个大榴莲，里边的果肉才好吃嘛。
然后，把这些细胞放到培养基里。
培养基就像细胞的“快餐”，里面有细胞需要的各种营养物质和生长因子。
要记得，细胞也要“吃好”，才能长得壮壮的，不然就不成气候了。
培养的环境也不能小看，温度、pH值、二氧化碳浓度都得保持稳定。
咱们得把细胞放在适合的温度下，就像给它们开个温暖的“家庭聚会”。
如果环境不合适，细胞就会抗议，甚至罢工！3. 传代培养3.1 什么是传代培养？说到传代培养，那就是把原代培养中的细胞继续繁殖，让它们“生儿育女”。
这就像一个大家庭，越来越壮大，热闹得不得了。
传代培养可以让我们获得更多细胞，方便后续的实验和研究。
3.2 传代培养的方法传代培养的关键在于及时分离细胞，咱不能让细胞们挤在一起，这样容易“打架”。
通常，当细胞长满培养皿后，就需要把它们分离开。
这个过程又得用到胰酶，跟原代培养一样，轻轻松松把它们从皿里“请”出来。
接下来，咱们需要把细胞分到新的培养皿里，再给它们加上新鲜的培养基，确保它们能继续健康成长。
注意，细胞们需要一点时间适应新环境，就像搬家后要习惯新居的味道一样。
动物细胞原代培养过程
动物细胞原代培养一、剪取组织颈椎脱臼法处死小鼠，放在100ml的烧杯中用70％乙醇消毒3min。
用剪刀剪开腹部，取出肾、肝、脾（任意一种脏器）。
1、将小白鼠断颈处死，然后用75%酒精或1‰ 新洁尔灭浸泡消毒，迅速进入无菌室。
2、将小白鼠置超净工作台上，打开腹腔二、清洗在盛有PBS 液平皿中洗涤数次，剔除包膜、结缔组织，将剔除后脏器放入另一盛有PBS 平皿中。
三、剪切将肾、肝、脾剪成1mm3 （剪成肉末状）大小的组织块，再次清洗，洗去残留的血细胞，以备消化。
四、消化1、在50ml离心筒中加入0. 25％胰蛋白酶溶液25ml，在温暖的环境中或置于37 °水浴摇床中轻轻摇动15min，转速约为180r/min。
2、让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活胰蛋白酶。
（小牛血清在共用无菌操作台上取用）3、在离心管中残留未消化组织块中再次加入胰蛋白酶进行消化，重复步骤1和2。
五、制备单细胞悬液1、将混合的细胞悬液离心，1200rpm，5min，弃上清。
2、将沉淀用新鲜的无菌PBS重悬，再1000-1200rpm，5min离心。
3、用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止,然后再按照（1）进行离心，离心后弃去上清液，将沉淀用少量细胞培养液反复吹打。
制的细胞悬液。
六、接种1、将细胞悬液接种到细胞培养瓶中。
2、用滤器过滤RPMI1640再悬沉淀，并使终体积为20ml。
（RPMI-1640RPMI是Roswell Park Memorial Institute的缩写，代指洛斯维.帕克纪念研究所。
RPMI是该研究所研发的一类细胞培养基，1640是培养基代号。
其中含有10%胎牛血清。
）七、培养1、在培养瓶外做好标记（标明所培养细胞的名称和时间），2、置于CO2的孵箱中培养，3、72h后即可观察。
小鼠细胞实验培养步骤
小鼠细胞试验培养步骤小鼠细胞常用的分别方法有两种，一种是贴块法，一种是消化法，这两种方法都可以用于分别和培养原代细胞。
一、试验分别和培养步骤1. 小鼠颈椎脱臼处以死刑后，剃除腹胸部的被毛，放入装有75%酒精的烧杯中浸泡5min。
2. 取出小鼠，在无菌环境下打开胸腔，取出心脏组织，注入盛有无菌1×PBS的培养皿中，洗净组织表面的血液。
3. 将清洗干净的心脏组织转入装有75%酒精的培养皿中浸泡15s以杀死大多数的心脏被膜细胞，浸泡完成后赶忙转入装有无菌1×PBS的培养皿中震荡清洗。
4. 清洗完成后，用剪刀镊子搭配除掉自动脉弓和心房组织，仅保管心室部分，再次用1×PBS清洗去除心室内的血液。
5. 将清洗干净的心室组织用剪刀减成1mm3大小左右的碎块，之后用PBS清洗若干次后按下述两种方法之一进行后续操作。
A. 贴块法6. 将清洗好的碎块转入另一培养皿中，用0.25%胰蛋白酶消化液浸泡组织，室温消化3—5 min。
7. 消化完成后，添加数毫升FBS停止消化，之后吸弃液体，加PBS清洗组织块1伺次后，用200 ul吸头将组织块平均接种于T—25培养瓶的培养面上，之后将培养瓶放置于37℃二氧化碳培养箱中，静置2—4h。
8. 待组织处于略微脱水的状态时，小心添加2ml培养基，添加时注意尽量不要将组织块冲起，要使培养基接触全部的组织块。
9. 之后放入培养箱中连续培养，一般2—4天后成纤维细胞会从组织块四周爬出，待爬出的细胞有较多数量时，可将细胞消化下来，去除组织块，转入另一培养瓶中培养。
B. 消化法6. 将清洗好的碎块转入另一离心管中，加入混合消化液（0.08%胰酶+0.06%Ⅱ型胶原酶）37℃水浴消化8 min后，吸取上层混悬液弃去。
7. 余下组织加入混合消化液10 ml，37℃水浴震荡消化10 min；吸取上层悬液至另一离心管中，加入适量FBS停止反应；剩余沉淀物再加消化液消化3—5次，直至组织块消化。
实验五 动物细胞的原代培养
实验五动物细胞的原代培养一、实验目的1．了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。
2．学习细胞消化、营养液的配制及酸碱度的调节。
3．初步掌握无菌操作方法。
二、实验原理细胞培养（cell culture）是用无菌操作的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养，使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、分化以及衰老等过程。
细胞培养的突出优点是：便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；便于人们对细胞内结构（如细胞骨架等）、细胞生长及发育等过程的观察。
因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术，同时也不可忽略另一个困素，那就是它脱离了生物机体后的一些变化。
细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。
如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等。
为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的内基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞（primary culture cell）与传代细胞（subculture cell）有一个基本的了解。
原代细胞培养又称原代培养（primary culture），是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，在体外培养，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。
要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节；二是严格控制无菌条件。
三、实验仪器、材料和试剂1．器材：解剖剪、解剖镊、眼科剪（尖头、弯头）、眼科镊（尖头、弯头）、培养皿、纱布块（或不锈钢网）、玻璃斗、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶（小方瓶或中方瓶）等。
原代细胞培养 实验报告
细胞生物学实验报告原代细胞培养1.实验目的：了解原理代细胞培养的基本方法，初步掌握无菌操作的方法。
2.实验用品：（1）仪器及器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、手术剪、解剖盘、胶头滴管、微量移液管、培养皿、离心机、注射器、L型针头（2）实验药品：蒸馏水、75%酒精溶液、PBS溶液、细胞培养液（3）实验材料：小鼠3.实验原理：（1）动物细胞培养：从动物体内取出体细胞，在体外模拟体内环境在无菌、适宜温度和一定的营养条件下，使之生存、生长、繁殖，并维持其结构和功能的方法。
原代细胞培养：直接从体内获取细胞组织或器官进行体外培养至第一次传代培养为止。
细胞培养至一定程度后，需再做培养。
及培养的细胞分散后，从一个容器以一定比例转移到另一容器扩大培养。
代数：传代培养累计次数（2）细胞培养的条件①气体条件：有一定的O）（小于空气中浓度）和CO2（5%）②无菌环境：培养用品应高温灭菌，培养液应无菌处理，操作应在超净工作台无菌操作。
③最适温度：36～37℃为最适温度，30～37℃细胞可进行代谢，4℃细胞可存活数天。
④渗透压：一般为260～320mmol/l （人血浆一般为290mmol/l）⑤营养条件：含细胞生长必须的有机物，氨基酸、维生素、无机盐、辅助物等。
培养基中不含生长因子，因此，必须在培养基中加入小牛血清。
⑥最适pH：7.0～7.4（中和细胞代谢废物与酸性气体环境）（3）贴壁生长与不贴壁生长①贴壁生长：来自于实体组织的细胞多贴壁生长。
贴壁生长的细胞进行传代培养更换培养皿时有以下步骤：首先，应轻晃培养皿并弃去上清液（去除死细胞），再用胰蛋白酶处理（细胞成片收缩，变圆），倾斜培养皿，用滴管吸去多余酶液，然后用滴管吸取PBS溶液吹打细胞并离心，最后，加入新的培养液，按比例分入培养皿中。
②不贴壁生长：造血细胞、癌细胞等。
半量换液法：吸取1/2培养液到新的培养皿中，再离心，取下层细胞，分入多个培养皿中。
4.实验步骤：（1）用断头法处死小鼠，置于解剖盘中。
小鼠成纤维细胞原代培养
实验-小鼠成纤维细胞的原代培养一、实验目的1.掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中的取材、消化及无菌操作等基本实验技术与操作过程。
2.熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态与生长状况的方法。
3.了解细胞原代培养与传代培养的原理与方法。
二、实验原理自17世纪下半叶Robert Hooke提出“细胞”概念直至20世纪中叶,细胞培养(Cell culture)才逐渐发展起来。
现代生命科学以及相关领域的研究前提就是细胞的维持与增殖,因此,细胞培养不仅就是细胞生物学的密不可分的组成部分,而且已经成为生物化学、生物物理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学与神经科学、甚至临床医学的重要内容。
细胞培养也就是细胞生物学延伸至相关学科的一条主要途径。
如今,细胞培养已经成为生命科学与医学研究最常用的基础技术之一。
细胞培养就是模拟机体内生理条件,将细胞从机体中取出,在人工条件下,使其生存、生长、繁殖与传代,进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
细胞培养的直接目的就是维持或扩增细胞数量。
依据取材于动物组织或培养细胞,细胞培养分为原代培养与传代培养。
1.原代培养(primary culture)就是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前的培养。
但实际上通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
原代培养就是建立细胞系的第一步,其最基本的方法有两种:组织块培养法与消化培养法。
组织块培养法就是指直接从机体取下组织与器官,通过组织块直接长出单层细胞,该培养法就是最常用的原代培养方法,其将刚刚离体的、生长活力旺盛的组织剪成小块接种在培养瓶中作为实验材料,一天后细胞可从贴壁的组织块四周游出并生长。
组织块培养法操作过程简便、易行,培养的细胞较易存活,适用于一些来源有限、数量较少的组织的原代培养。
消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后,在不加任何粘附剂的情况下,直接移植在培养瓶壁上,加入培养基立即进行培养的方法。
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代之flamerking图文版[精华]很多战友发email或PM向我询问小鼠MSC的培养方法，我零零散散地一个个回复过几次，由于我平时时间不是很多，所以回答地时候有些内容写的不是很详细。
今天又有一个战友PM我，询问我培养方法。
看来做小鼠MSC的战友越来越多。
一遍遍地重复写很费时间（想粘贴复制又找不到上次写的在哪～惨！），所以我想还是发贴公布一下。
其实我小鼠MSC在我的课题中不是主角，只是起一个control的作用，因此我在这方面的经验可能没有一些专门做小鼠MSC的战友丰富，不过我还是很愿意把我的经验写出来供大家参考，希望能够起到“抛砖引玉”的作用。
欢迎各位同道对我的方案进行批评和指正，与大家一起分享你们的经验和智慧。
提纲一，简版主要步骤及操作要点。
二，完整版1. 试剂及材料准备2. 动物手术及取材3. 原代细胞培养4. 细胞传代5. 讨论时间关系，今天先给个简版。
我先顶一下,由于我还是新手,故不能说是经验介绍,只好讲让你们指出缺点,谢谢斑竹1. 试剂及材料准备MEM,10%FCS,手术器械,培养瓶,200目滤网,5ml注射器2. 动物手术及取材CR小鼠1只,酒精浸泡5分钟,取股,胫,肱骨,用基培冲出骨髓,滤过,1000转离心,完培重悬,接种于25厘米培养瓶3. 原代细胞培养:,3天后首次换液,自己发现一周贴壁细胞就铺满达90%,自行传代4. 细胞传代:消化下来很少,能下来的增长很慢5. 讨论:没经验欢迎斑竹的继续讲解,希望有经验的老师们能不啬指教羽之无限版主,能有空再讲讲吗这几天,我的原代就是不长,42天了,25平方厘米的培养瓶还未铺慢,不能传代真是天天盼着你啊呵呵，不好意思，最近我的sony笔记本又坏了，上次坏了几次维修部修不好，给我换了台新的，结果以用了没2个月又不能启动了，真是麻烦，我的资料都在里面，最近实验又忙，没空去维修部……不过明天我就去了。
……呵呵，跑题了。
小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养
小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养一、实验材料1．主要仪器设备倒置显微镜、培养箱、离心机、25ml玻璃培养瓶、吸管；10ml尖底离心管、Ф80mm玻璃培养皿、青霉素小瓶、小鼠用解剖器械（包括眼科剪和眼科镊）2．试剂RPMI 1640培养液、平衡缓冲生理盐水(PBS, pH7.2-7.4)、0.25%胰蛋白酶3．实验动物孕14～15天(E14～16)昆白母鼠，领自福建医科大学实验动物中心。
二、实验步骤1. 获取小鼠胚胎(1) 取孕14～15天的母鼠，断颈处死，置于蜡盘上(2) 75％酒精消毒后，用剪刀和镊子剪开下腹皮肤，用两把弯头止血钳夹住切口处的皮肤向头尾两侧牵拉即剥皮，用眼科弯镊和眼科弯剪打开腹腔，暴露出子宫。
(3) 用眼科弯镊夹住一侧子宫，分离子宫系膜，眼科弯剪剪断子宫角和子宫颈，将整个子宫分离下来（注意勿使子宫滑落到腹腔外，避免污染）。
将子宫置于无菌滤纸上去除血迹。
(4) 在超净台内将子宫移入预先盛有PBS的培养皿中，洗涤数次。
(5) 将子宫移入另一盛有PBS的培养皿中，用眼科弯剪沿子宫系膜打开子宫，取出带有胎膜的胎鼠，并用两把眼科镊子剔除胎膜，取出胎鼠（一般有12只）。
(6) 将胎鼠移入另一盛有PBS的培养皿中，用眼科剪和眼科镊去除胎鼠的头、四肢和内脏，得鼠胚躯干。
(7) 将鼠胚躯干移至另一盛有PBS的培养皿中，用PBS洗涤两次至无肉眼可见的血色。
2. 小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养（组织块半消化法）(1) 将干净的鼠胚躯干移至青霉素小瓶内（每6个鼠胚躯干装1瓶），用眼科直剪剪成约1 mm3以下的碎块。
(2) 用5ml的刻度吸管每瓶加入约3ml的PBS，混匀后连同鼠胚碎块一起移至一尖底离心管中。
(3) 室温下静置5min，用刻度吸管吸去上清液，留下鼠胚组织碎块。
(4) 向装有鼠胚碎块的离心管内加入1ml 0.25%胰蛋白酶消化液，轻轻吹吸30秒（可见组织块变得较为粘稠）。
(5) 加入1 ml 1640培养液终止消化，室温下静置5min，吸去上清液，留下鼠胚组织碎块沉淀。
动物细胞原代培养
动物细胞原代培养
小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。 勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在 打开之容器正上方操作实验。容器打开后， 以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取 用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放臵桌面。 细胞培养应在超净工作台或有空气滤过装臵 的工作间里进行。 培养液或其它溶液不应该在工作区以外打开 。 装吸管或吸头的容器也不应该在工作区以外 打开。
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动物细胞原代培养
原代培养程序
取材 漂洗 剪切 消化 制备单细胞悬液 接种
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动物细胞原代培养
日常维护及注意事项
1.所有镜头表面必须保持清洁，落在镜头表面的灰尘，可用吸耳球吹去，也可用 软毛刷轻 轻的掸去掉。 2.当镜头表面沾有油污或指纹时，可用脱脂棉蘸少许无水乙醇和乙醚的混合液（3:7）轻轻 擦拭。 3.不能用有机溶液清擦其它部件表面，特别是塑料零件，可用软布蘸少量中性洗涤剂清擦。
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动物细胞原代培养
实验动物的选择
小鼠，清洁级。(选择大约一半足孕时间的胚 胎，10－13天龄胚胎含有最大数量的未 分化的间质细胞，成纤维细胞可从这些 细胞衍生获得。)
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动物细胞原代培养
实验材料
药品：RPMI1640培养液，小牛血清(FCS)， 0. 25% 胰蛋白酶 ，PBS（-） 器材：培养瓶1支/组，50ml离心筒2支/组，培 养皿1套/组，吸管1支/组，EP管1支/组 （在无菌室共用试剂车取用），剪子1把 /组，镊子1把/组，滤器1支/组。 设备：水浴摇床、离心机、二氧化碳培养箱、 倒置显微镜
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动物细胞原代培养
操作步骤
1、开机。接连电源。打开镜体下端的电控开关。 2、使用 （1）准备：将待观察对象置于载物台上。旋转三孔转换器，选择较小的物镜。 观察，并调节铰链式双目目镜，舒适为宜。
细胞工程实验-动物细胞原代培养及观察
实验三动物细胞原代培养及观察一、实验目的1.学习并掌握动物细胞原代培养前各种器具的消毒方法。
2.学习并掌握动物细胞的机械切割和组织块原代培养方法。
二、实验原理原代培养也叫初代培养，是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。
原代培养的细胞具有很多特点，其最大的优点是组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生很大变化，仍具有二倍体遗传性状，最接近和反映供体体内生长特性，因此原代培养细胞是研究基因表达的理想系统，也很适合做药物测试、细胞分化、疫苗制备等实验研究。
原代培养是建立各种细胞系的第一步，因此细胞原代培养技术是从事组织培养工作者应熟悉和掌握的最基本的技术。
原代培养最基本的方法，依据切割方式不同，可分为蛋白酶消化法和组织块直接培养法两种。
组织块直接培养法是指在无菌条件下，从有机体取下组织，用平衡盐溶液漂洗数次后剪碎，加培养液进行培养的方法。
是常用的、简便易行和成功率较高的方法。
依据组织块贴壁方式不同，又可分为薄层培养法和翻转干涸法两种。
本实验采用翻转干涸法。
酶消化法是指将组织剪成小块，然后用蛋白酶消化成单细胞悬液后，再接种培养的方法。
由于蛋白酶比较贵，以及组织块消化成单细胞的条件要求远较组织块法复杂，因此，采用组织块直接培养法的较多。
三、主要仪器与试剂1.实验仪器：培养瓶、培养皿、剪子和镊子、青霉素小瓶、滴管、移液管若干、冻存管、乳胶头2.实验试剂及材料：PBS、MEM（含100IU/ml 青霉素和100ug/ml链霉素）、泥鳅四、实验步骤（一）材料的预处理1.将所需的一定量水（或海水）进行煮沸消毒处理。
2.冷却后，加入青霉素至终浓度1000单位/ml水（或海水），加入链霉素至终浓度1000单位/ml水（或海水）。
3.将实验用泥鳅放入经处理的消毒水（或海水）中浸泡24小时。
4.用纱布包裹住将泥鳅取出，将其击昏。
（二）原代培养1.将欲取材部位如心脏、鳍、肝脏、肌肉等剪下，放入已灭菌的培养皿中。
2. 用75%酒精漂洗一次后，去除皮下脂肪和结缔组织。
小鼠小胶质细胞原代培养方法！
6、0.4%台盼蓝溶液的配制 台盼蓝 4 g PBS 少许（研磨） PBS 定容至 100ml，滤纸过滤，室温保存。
7、4%多聚甲醛的配制： 多聚甲醛 4 g PBS 溶液 100ml 加热至 60，边滴加 1mol/L NaOH 边搅拌，至液体澄清。
2、小鼠小胶质细胞的混合培养
（1） 75%（体积分数）酒精消毒新生 24h 内的清洁级小鼠，在无菌条件下断头，剪开头皮及颅骨，取出脑组织，置于盛冷的pH7.2,无 钙、镁的D-Hank's液的平皿中（下置冰袋）。
（2） 无菌剥离脑组织，除去小脑、海马、大脑髓质,分离大脑皮层，仔细剥离脑膜及血管。 （3）用虹膜剪将组织剪切成 1mm3左右的组织块，0.125%胰蛋白酶消化，37作用 20min，期间振摇 2～3 次。 （4）弃去上清液，加入完全接种液终止消化，漂洗两次。巴斯德吸管轻轻吹打至肉眼观察无明显的脑组织团块，静置 2min。 （5）悬液收集于新的离心管，离心（1000r/min，10 min，4），弃去上清液。加入完全培养液重悬，200 目不锈钢网过滤。根据实验需要 接种于若干个25cm细胞培养瓶或培养皿中。 （6）置 37、5%CO2培养箱培养24h后更换一次培养基，以后每3d换一次液，并在镜下观察细胞的生长和存活情况。
（3）离心管配平,1000r/min, 离心5min, 弃上清；加定量完全培养再次吹打成细胞悬液,接种于预先包被的置有盖玻片的24孔培养板,置于 CO2恒温细胞培养箱(37度)培养。
生长24h后吸掉培养液,以去除未贴壁的少突胶质细胞,加完全培养液继续培养。
小鼠胚胎细胞的原代与传代培养及观察
小鼠胚胎细胞的原代与传代培养及观察南京师范大学生命科学学院09070150 唐嘉艺摘要：细胞培养是生物学和医学研究最常用的手段之一，可以分为原代培养和传代培养两种。
原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养。
由于细胞刚从活体组织中分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。
这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后的传代培养创造条件。
传代培养是组织培养常规保种方法之一。
当细胞在培养在培养瓶中长满之后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。
这一过程就叫传代。
传代培养可获得大量细胞供实验所需。
传代培养要在严格的无菌条件下进行。
本次实验主要是为了培养能独立进行细胞的原代和传代培养的能力，熟练掌握进行细胞原代与传代培养的条件、实验材料、方法等。
关键词：小鼠胚胎原代培养传代培养无菌前言：在体外培养中，有三个培养层次，即细胞培养、组织培养和器官培养。
细胞培养是指从体内取出组织，经消化酶消化成单细胞或细胞群，模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下使细胞生存和生长并维持其结构和功能的方法。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。
要使细胞能在体外生长，必须满足一下的基本要求：一、供给细胞存活所必需的营养条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气等。
二、要有适合各种细胞生长的适宜温度，并注意细胞生长环境的酸碱度与渗透压的调节。
三、细胞培养必需严格控制在无菌条件下。
细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。
培养细胞所用器材及试剂：1、设备（1）超净工作台（2）滤器（3）C O2培养箱（4）电热干燥箱2、器械及器皿：培养瓶、培养皿、滴管、镊子、手术剪3、培养液：目前常用的基础培养基均已商品化，如RPM1640，MEM，M—199等，可根据培养需求合理选择。
血清：一般常用为小牛血清，人血清和其它动物血清。
平衡盐溶液：主要用于作为稀释和灌注的液体，维持细胞渗透压，提供缓冲系统，使培养液的酸碱度维持在培养细胞生理范围内，提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子等。
3.小鼠解剖及动物原代细胞培养
实验三、小鼠解剖及动物原代细胞培养引言：细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。
动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。
从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。
当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。
传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。
细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。
细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。
培养细胞的条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适PH、营养条件和培养基质等。
1.实验材料：实验室购买的雄性小鼠、13.5天孕鼠。
DMEM培养基（胎牛血清、青/链霉素溶液）、胰蛋白酶溶液、PBS溶液（NaCl 8.00g，Na2HP04 1.15g，KCl 0.20g，KH2P04 0.20g，pH调至7.2，超纯水定容到1000mL，分装，121 ℃灭菌20 min）2.实验步骤：2.1 处死小鼠用右手拇指和食指捏住雄性小鼠或怀孕雌鼠尾巴中部放在铁笼上，使小鼠前肢接触铁笼（后肢悬空），左手从小鼠后方向前按住鼠头及颈部。
左手拇指、食指用力向下按压鼠头及颈部，同时右手抓住鼠尾根部用力拉向后上方，造成颈椎脱臼，造成小鼠立即死亡。
当小鼠停止抽搐，松开左手。
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实验三、小鼠解剖及动物原代细胞培养
引言：细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外
模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。
动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。
从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。
当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。
传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。
细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。
细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。
培养细胞的条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适PH、营养条件和培养基质等。
1.实验材料：
实验室购买的雄性小鼠、13.5天孕鼠。
DMEM培养基（胎牛血清、青/链霉素溶液）、胰蛋白酶溶液、PBS溶液（NaCl 8.00g，Na2HP04 1.15g，KCl 0.20g，KH2P04 0.20g，pH调至7.2，超纯水定容到1000mL，分装，121 ℃灭菌20 min）
2.实验步骤：
2.1 处死小鼠
用右手拇指和食指捏住雄性小鼠或怀孕雌鼠尾巴中部放在铁笼上，使小鼠前肢接触铁笼（后肢悬空），左手从小鼠后方向前按住鼠头及颈部。
左手拇指、食指用力向下按压鼠头及颈部，同时右手抓住鼠尾根部用力拉向后上方，造成颈椎脱臼，造成小鼠立即死亡。
当小鼠停止抽搐，松开左手。
将整个小鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中。
2.2 解剖小鼠
将雄性小鼠或怀孕雌鼠从烧杯中移入超净台取出后放在无菌大平皿中，用碘酒棉球消毒腹部的被毛，然后再用酒精棉球擦拭碘酒擦过的部位。
用镊子提起腹部皮肤，剪刀剪开皮肤，打开腹腔，将剪开的皮肤分别拉向两边。
观察小鼠内脏器官。
2.3 小鼠肾细胞培养
①用镊子及剪刀，剪开腹腔。
取出肾脏，置于无菌培养皿中，加入少量PBS洗液。
换眼科剪及镊，将肾膜剪破，去掉肾膜、脂肪及肾盂。
②将肾组织转移于另一无菌培养皿，换弯头眼科剪，将肾组织剪碎至约1立方毫米大小，加入PBS洗液洗涤，吸掉洗液，重复数次，直到洗液澄清、无血球为止。
③用大口径枪头将上述组织液转移至50ml离心管。
静止1分钟，换小口径枪头吸掉洗液。
④按组织总体积的10倍量加入0.25%胰蛋白酶液，置于37℃水浴酶解消化60分钟左右。
每隔5分钟摇动一次。
⑤从水浴中取出，吸掉弃去胰蛋白酶液，向离心管加入5毫升DMEM培养液反复吹打组织块至细胞悬液。
⑥吸取少量细胞悬液，用血球计数板进行计数。
根据上述计数结果，调整细胞终浓度至每毫升含30～50万个细胞进行分瓶培养。
一周内每天观察细胞培养情况、拍照。
3.结果与讨论
第一天：小鼠肾细胞浓度1:3
第二天：
小鼠肾细胞浓度1:1
小鼠肾细胞浓度1:2
小鼠肾细胞浓度1:3
第四天：
小鼠肾细胞浓度1:1
小鼠肾细胞浓度1:2
小鼠肾细胞浓度1:3
实验结论讨论：第一天小鼠肾细胞浓度1:1 和 1:2 的培养瓶颜色由红色变为
黄色，我们推测为细胞浓度太高而培养基内营养物质耗尽，但是第二天之后变色的培养瓶又变回了原本的红色，但是不清楚原因是什么。
虽然我们组没有第三天的图片，不过从第二天和第四天可以明显看出小鼠肾细胞的生长轨迹。
不过通过第一天到第四天的图片可以看出小鼠肾细胞浓度1:1的培养瓶内无法找到明确的细胞，浓度太高营养物质耗尽细胞死亡，而小鼠肾细胞浓度1:2 的培养瓶虽
然中途变过色，但是从第四天的观察来看，该培养瓶内有细胞生长，说明细胞没有死亡，但不清楚培养基中途变色的原因，猜测可能是刚开始的时候培养瓶的盖子拧太紧而导致细胞缺氧。
而小鼠肾细胞浓度1:3从第一天到第四天的图片对比可看出小鼠肾细胞在1:3的浓度下能够正常生长，而且第四天小鼠肾细胞已经分散，细胞明显。
因此可以得出结论1:3的浓度更加适合小鼠肾细胞的原代细胞培养，而1:1的细胞浓度太高营养物质太快耗尽而容易导致细胞死亡。
参考文献：吴国娟，杨明，小数肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定，解剖学报，2007年12月，第38卷，第6期。