3.小鼠解剖及动物原代细胞培养

实验三、小鼠解剖及动物原代细胞培养

引言：细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外

模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。

细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。

细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。培养细胞的条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适PH、营养条件和培养基质等。

1.实验材料：

实验室购买的雄性小鼠、13.5天孕鼠。

DMEM培养基（胎牛血清、青/链霉素溶液）、胰蛋白酶溶液、PBS溶液（NaCl 8.00g，Na2HP04 1.15g，KCl 0.20g，KH2P04 0.20g，pH调至7.2，超纯水定容到1000mL，分装，121 ℃灭菌20 min）

2.实验步骤：

2.1 处死小鼠

用右手拇指和食指捏住雄性小鼠或怀孕雌鼠尾巴中部放在铁笼上，使小鼠前肢接触铁笼（后肢悬空），左手从小鼠后方向前按住鼠头及颈部。左手拇指、食指用力向下按压鼠头及颈部，同时右手抓住鼠尾根部用力拉向后上方，造成颈椎脱臼，造成小鼠立即死亡。当小鼠停止抽搐，松开左手。将整个小鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中。

2.2 解剖小鼠

将雄性小鼠或怀孕雌鼠从烧杯中移入超净台取出后放在无菌大平皿中，用碘酒棉球消毒腹部的被毛，然后再用酒精棉球擦拭碘酒擦过的部位。用镊子提起腹部皮肤，剪刀剪开皮肤，打开腹腔，将剪开的皮肤分别拉向两边。观察小鼠内脏器官。

2.3 小鼠肾细胞培养

①用镊子及剪刀，剪开腹腔。取出肾脏，置于无菌培养皿中，加入少量PBS洗液。换眼科剪及镊，将肾膜剪破，去掉肾膜、脂肪及肾盂。

②将肾组织转移于另一无菌培养皿，换弯头眼科剪，将肾组织剪碎至约1立方毫米大小，加入PBS洗液洗涤，吸掉洗液，重复数次，直到洗液澄清、无血球为止。

③用大口径枪头将上述组织液转移至50ml离心管。静止1分钟，换小口径枪头吸掉洗液。

④按组织总体积的10倍量加入0.25%胰蛋白酶液，置于37℃水浴酶解消化60分钟左右。每隔5分钟摇动一次。

⑤从水浴中取出，吸掉弃去胰蛋白酶液，向离心管加入5毫升DMEM培养液反复吹打组织块至细胞悬液。

⑥吸取少量细胞悬液，用血球计数板进行计数。根据上述计数结果，调整细胞终浓度至每毫升含30～50万个细胞进行分瓶培养。一周内每天观察细胞培养情况、拍照。

3.结果与讨论

第一天：小鼠肾细胞浓度1:3

第二天：

小鼠肾细胞浓度1:1

小鼠肾细胞浓度1:2

小鼠肾细胞浓度1:3

第四天：

小鼠肾细胞浓度1:1

小鼠肾细胞浓度1:2

小鼠肾细胞浓度1:3

实验结论讨论：第一天小鼠肾细胞浓度1:1 和 1:2 的培养瓶颜色由红色变为

黄色，我们推测为细胞浓度太高而培养基内营养物质耗尽，但是第二天之后变色的培养瓶又变回了原本的红色，但是不清楚原因是什么。虽然我们组没有第三天的图片，不过从第二天和第四天可以明显看出小鼠肾细胞的生长轨迹。不过通过第一天到第四天的图片可以看出小鼠肾细胞浓度1:1的培养瓶内无法找到明确的细胞，浓度太高营养物质耗尽细胞死亡，而小鼠肾细胞浓度1:2 的培养瓶虽

然中途变过色，但是从第四天的观察来看，该培养瓶内有细胞生长，说明细胞没有死亡，但不清楚培养基中途变色的原因，猜测可能是刚开始的时候培养瓶的盖子拧太紧而导致细胞缺氧。而小鼠肾细胞浓度1:3从第一天到第四天的图片对比可看出小鼠肾细胞在1:3的浓度下能够正常生长，而且第四天小鼠肾细胞已经分散，细胞明显。因此可以得出结论1:3的浓度更加适合小鼠肾细胞的原代细胞培养，而1:1的细胞浓度太高营养物质太快耗尽而容易导致细胞死亡。

参考文献：吴国娟，杨明，小数肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定，解剖学报，2007年12月，第38卷，第6期