组培防止灭菌的方法
组培成功必备的几大要素
组培成功必备的几大要素组织培养（tissue culture）是一种在实验室或生物技术设施中，通过控制环境条件来培养植物组织或细胞的技术。
以下是组织培养成功必备的几大要素：1.无菌环境：无菌环境是组织培养成功的首要条件。
所有用于组织培养的材料，包括外植体、培养基、接种工具等，都必须进行严格的消毒处理，以防止细菌、真菌等微生物的污染。
实验室应配备超净工作台、紫外灯、高压蒸汽灭菌器等设备，确保无菌操作。
2.合适的培养基：植物组织培养的成功与否，很大程度上取决于所使用的培养基。
培养基应含有植物生长所需的营养成分，如糖、氨基酸、微量元素、维生素等，以及适量的植物生长调节剂，如生长素和细胞分裂素。
根据不同的植物种类和培养目的，可以选择不同的培养基。
3.适宜的温度和光照：在组织培养过程中，温度和光照也是影响成功的关键因素。
每种植物都有其最适的生长温度和光照条件。
一般来说，大多数植物在25-30℃的温度下和16-24小时的光照条件下生长良好。
4.外植体选择与处理：选择健康、无病虫害的植物材料作为外植体，并对材料进行适当的预处理，如清洗、消毒等，是组织培养成功的关键步骤。
此外，选择适合的外植体类型也对培养成功至关重要。
5.接种技术：接种是将外植体接入培养基的过程。
熟练的接种技术能够减少对植物组织的损伤，避免污染，并提高组织的存活率。
6.细胞分裂与增殖：在适宜的培养条件下，植物细胞会分裂并增殖形成愈伤组织。
这个过程需要定期观察和记录细胞的生长情况，及时调整培养条件以促进细胞的分裂和增殖。
7.生根与移植：当愈伤组织形成后，可以将其转移到生根培养基中，促使组织产生根系。
当根系形成后，可以将其移植到土壤中或进行其他后续实验。
8.遗传稳定性：为了确保组织培养后得到的植株是纯合的，并保持其遗传稳定性，需要采用适当的遗传检测方法。
这可以通过分子生物学方法，如DNA 指纹分析或基因表达分析来实现。
9.法规与伦理：在进行组织培养实验时，必须遵守相关的法规和伦理准则。
植物组织培养实验指导书
《植物组织培养实验指导》《植物组织培养实验指导》的相关说明一、本指导用于《植物组织培养概论》课程的实验教学。
二、各专业班级根据实际情况做相应调整，调整情况详见各专业班级的授课计划。
其中15个课时的内容调整如下：实验一、二、五 3学时实验六 3学时实验七 3学时实验九、实验十二 3学时实验十三 3学时实验一实验室基本设备及其用途的识别一、目的认识植物组织培养实验室的基本结构，必须的基本设备及其用途与作用方法。
二、实验室的基本结构（一）化学实验室（工作室）培养基药品称量、配制、分装、灭菌；材料预处理；培养材料的观察分析；制蒸馏水。
设备、药柜、工作台、蒸馏水器、天平、冰箱，手提高压消毒锅、显微镜、解剖镜、各种玻璃仪器、金属仪器等。
安装水、电、排气等装置。
（二）接种室①无菌操作室②接种箱③超净工作台（三）培养室（四）洗涤、消毒室；卧式高压消毒锅。
（五）温室（培养大棚）。
实验二常用仪器、必要器皿、几种主要设备的使用方法、常用几种药剂的配制一、目的认识植物组织培养必需的仪器、器皿，几种主要设备的使用方法、常用几种药剂的配制。
二、常用仪器1.蒸馏水器（学习操作）2.手提式高压消毒锅、卧式高压消毒锅（学习使用、操作）3.天平⑴药物天平（工业天平）、粗天平、（精密度1/10）⑵扭力天平（精密度1/100）⑶分析天平（精密度1/10000）4.超净工作台（学习、使用、操作）5.电热干燥箱（烘箱）6.恒温光照培养箱（学习、操作）7.电冰箱8.显微镜和解剖镜①手提式解剖镜（学习、使用、操作）②立体解剖镜③普通显微镜9.旋转培养机10.离心机（学习、使用、操作）11.酸度测定仪：⑴精密PH4－7试纸；⑵笔型袖珍酸度计。
三、必要的器皿（一）玻璃器皿1.培养器皿①试管②三角烧瓶（锥形瓶）③圆形高形培养瓶（罐头瓶）④培养皿⑤扁身培养瓶⑥L型和T型管⑦凹面载玻片2.盛装器皿①试剂瓶②烧杯3.计量器皿①量筒②容量瓶③吸管4.其它器皿滴瓶、称量瓶、漏斗、玻璃管、注射器等实验室常用器皿。
植物组织培养的三大难题[1]
![植物组织培养的三大难题[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/7d69cb08763231126edb11a2.png)
第一作者简介:杨丽琴(19842),女,宁夏灵武人,硕士,主要从事植物学方面的研究。
E 2mail :ylq616@ 。
通讯作者:王俊。
E 2mail :w_jun @ 。
基金项目:国家科技攻关资助项目(2005BA901A18)。
收稿日期:2008-01-11植物组织培养的三大难题杨丽琴,李 瑞,王 俊,胡海英,吴晓玲(宁夏大学,宁夏银川750021) 摘 要:在植物组织培养过程中,常发生褐变、污染、玻璃化现象三大难题,严重影响了组织培养材料的正常发育,给组织培养带来了一定的困难。
结合近些年的研究,对三者发生的原因以及控制措施进行了综述,以期为科研和生产提供一定的理论依据和实践指导。
关键词:组织培养;褐变;污染;玻璃化中图分类号:Q 943.1 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2008)04-0104-04 植物组织培养技术是指在无菌条件下,将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体,在人工配制的培养基上培养成完整植株的过程[1]。
植物组织培养研究自Haberlandt (1902)的工作开始,至今已有100年的历史。
现在植物组织培养技术已在科研和生产中广泛应用,成为最引人注目的生物技术之一。
特别是近30年来,不少组织培养工厂应用该技术大量生产花卉、蔬菜及特种经济植物幼苗、脱毒苗,使作物种植逐步走向集中控制化、规模化、自动化、不受自然影响的工厂化生产[2]。
尽管组织培养方面理论研究已相当精深,但在试验和生产过程中常常会遇到褐变、菌类污染和玻璃化现象三大难题[3],严重者会导致试验和生产的失败,给科研和生产造成巨大的经济损失。
所以,植物组织培养操作过程中的经验积累和技术的掌握是很重要的。
现根据国内外的研究成果,对植物组织培养中的三大难题进行了分析,并提出了相应的解决方法。
1 褐变现象1.1 褐变概念及产生机理褐变是指外植体在诱导脱分化或再分化过程中,自身组织从表面向培养基释放褐色物质,以至培养基逐渐变成褐色,外植体也随之进一步变褐而死亡的现象[4]。
开放式植物组培
培养基中只加入原MS培养基30%的蔗糖，组培苗的生长比常规组培要缓慢些。但此组培过程无需大量培养瓶及高压灭菌器、超净工作台等昂贵设备，大幅度降低了植物组培一次性投入(单从使用的仪器来比较，本试验的成本只相当于常规组培的15%左右)和能源消耗，简化了操作程序，提高了工作效率，仍然具有很广阔的推广前景和较高应用价值。
减少培养基含糖量也可有效抑制菌类生长。同时需加强光照，使植物通过光合作用自养。
二、试验结论
配制抑菌配方培养基(具体配方为：链霉素0.14g/L、百菌清1 g/L、多菌灵1 g/L、琼脂9g/L、蔗糖9g/L，其他成分如大量元素、微量元素、维生素、铁盐、激素等同MS培养基)，按每4小时1次对培养基表面进行水雾喷刷，给予8000LX较强光照可有效抑制各种杂菌生长，较好保证菊花继代组培苗生长正常，从而实现开放式抑菌组培。
一、创新思路
在一定间隔时间内，用具有一定压力的水雾冲刷培养基表面，可去除培养基表面尚未萌发的真菌孢子和各种微小菌药和抗生素，如农用链霉素、医用青霉素、多菌灵、百菌清、可杀得2000等，对各种真菌和细菌都有较广谱的抑制或杀灭作用。把一定浓度的上述药物按一定组合配方加入培养基，可抑制杂菌在培养基内以及培养基表面的生长。
实验中可能出现的常见问题与解决办法
实验中可能出现的常见问题与解决办法一．污染ﻫ污染是指由于微生物的侵染,在组织培养容器中滋生大量菌斑,使组培材料不能正常生长和发育的现象,主要有以下５方面的原因:１.器具灭菌：实验的所有器具都要在１21°C消毒25min,若灭菌温度不够或者时间不足，都会导致污染。
灭菌时要求冷空气完全排除,否则会达不到指定温度。
其次，要做好灭菌登记,杜绝出现人为失误造成的污染。
此外，在接种过程中，每用一次都要在火焰上彻底灼烧，特别在接触到污染物时极易引起器具污染。
2．外植体：很多材料在灭菌后其实还是带菌的,不过量比较少，短期应该观察不到被感染的现象。
３.接种操作:首先，接种人员的手，手腕要用酒精棉球好好擦拭。
其次,对于放置在外的培养物（灭菌好的培养基）其瓶子外壁上有灰尘与微生物，放入超净台前可以用酒精消毒一下。
再者，很容易出现瓶口的污染,所以接种人员的技术要娴熟，干练。
ﻫ４.环境条件:加强环境的灭菌消毒。
若有污染的材料不可以就地清洗,必须高压杀菌后再清洗，否则会导致大量孢子弥漫。
此外，要及时打扫卫生，定期蒸熏消毒。
保证环境的干净。
5．超净工作台：要定期对初过滤器进行清洗和更换。
此外，每次使用前要提前20min打开机器预处理，并对台面进行酒精喷雾消毒。
二．材料死亡实验过程中,很可能出现材料死亡，主要有以下几个方面：ﻫ1.外植体灭菌过度:一旦材料太小或灭菌时间太长,剂量太大，就会导致材料死亡，所以要严格控制时间。
２.污染:大量污染会造成材料死亡。
3.培养基配置出现问题:在激素配置或营养成分配置出现问题时,材料易死亡,常常发生在无生长点的材料和愈伤组织中。
4.培养环境的恶化：温度过高,透气不好，培养过于密集，久不转移,有害气体的累积都会造成培养材料的死亡。
ﻫ【措施】：【1】.选用较为温和的灭菌剂，降低药物浓度,减少灭菌时间,或选取较为坚强的外植体（eg：生长季节取芽）【2】注意个人卫生，严格按照规则进行操作。
【3】认真配置各种母液及培养基,选用盐含量较低的培养基,也可以试着用1/2或1/４的培养基，并调整各激素的用量和配比。
组培中常见问题分析
组培苗在培养过程中常见问题分析一、植物褐化A、原因可能有：1、植物本身含有较多的酚类物质，在切割外植体时，从伤口渗透出来，直接渗入培养基中，或在继代培养时不断形成并渗出。
2、（1）外植体的取材部位及季节（2）培养基成分，浓度过高的无机盐和高浓度6-BA、KT 等容易加重褐化。
（3）培养条件不当，温度过高培养时间过长、光照过强，均可以提高多酚氧化酶的活性。
B、防止措施：1、选择合适的外植体：选取幼龄材料，选合适部位，时间一般在初冬或初春2、暗培养或勤转瓶3、弱光培养、低温培养4、添加活性炭或抗氧化剂等5、可以降低无机盐含量，由全量降为半量，减少铵态氮的含量。
二、玻璃化现象A、原因可能有：1、培养温度高2、生长素种类及其配制比例不合适。
铵态氮及碳源对某些植物培养不适宜。
B、防止措施：1、降低培养瓶内的湿度，增加琼脂量，每瓶接种量减少三分之一2、降低培养温度3、增加光照4、降低培养温度5、降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。
也可以降低或去除铵态氮。
6、在培养基中加入1.0~5.0g/L活性炭。
三、黄化现象A、原因可能有：1、培养基中铁元素含量不足，激素配比不当，糖用量不足。
2、培养瓶温度不适，光照不足。
3、pH值有问题。
（培养基配置不正确）B、防止措施：1、检查培养基配置过程，保证培养基成分正确添加2、调节培养基的成分和pH值3、控制培养室温度，增加光照，用透气盖改善瓶内通气情况四、污染现象A、原因可能有：1、原瓶苗有污染2、接种工具灭菌不彻底3、操作时认为带入菌4、接种环境不干净5、原瓶苗细菌性污染（浑浊水渍状、或泡沫发酵状）常由于灭菌锅未排尽冷空气、灭菌锅压力温度不够，计时不准确造成。
6、原瓶苗真菌性污染（出现各种颜色的孢子），可能是由于空气、瓶口及瓶盖真菌孢子引起。
B、防止措施：1、正确使用灭菌锅2、接种工具每次使用完后要消毒灭菌，接种时，手不要碰盘子的任何地方，用镊子夹盘子。
3、污染的原瓶苗要及时淘汰，如果原瓶苗数量少要进行灭菌4、接种时，要保证接种环境的干净卫生，台内工具不宜放太多。
组培室无菌化操作规程
无菌操作一、接种室的消毒1、每天开始工作前用75%酒精喷雾自己周围环境。
2、一天的工作结束后，值日、值班人员要对培养基储存间、三个接种室、两个培养室及风淋室进行紫外灯及臭氧灭菌20~30min。
3、风淋室两个门随时关紧，灭菌间和储存间之间的门除了放培养基外不得随意开门。
风淋室与接种间之间的门要随时关闭！接种四人间对着的门绝对不允许开！二、无菌操作要求1、在一楼换各自的护士鞋。
1、进实验室首先要穿过风淋室吹风，换工作服，换拖鞋，戴好帽子、把头发全部包进去、不许有头发留在外面，之后进入实验室。
2、自己的工作服、帽子一周清洗一次。
口罩要保持干净。
4、必须剪除长指甲，接种时用75%酒精擦洗。
5、接种时禁止谈话并戴上口罩。
6、接种过程尽量减少工作人员在接种室的走动。
三、接种前应做好相应的准备工作1、超净台紫外灯灭菌20min，值日值班人员提前10min 开台子。
2、打开高温灭菌消毒器，温度达到200℃左右时可以使用。
3、此时将当天或某时间段所需要的原瓶苗、培养基、盘子、一瓶无菌水及放置瓶盖的空框子准备好，待紫外灯关闭5min后进入接种室，4、将事先准备好的原瓶苗及其他物品放到医用小推车上（有条理的摆放，便于在操作时使用）。
5、于8：20之前和14:50之前进入操作室超净台前进行接种工作。
四、具体的无菌操作步骤如下：1、首先要拉下超净台挡风板，隔离人体和无菌苗，减少菌的发生。
2、操作前要用酒精喷壶喷洒超净台并用抹布擦干净。
3、将两把解剖刀和镊子放入灭菌消毒器内进行2~3min灭菌，之后放在灭菌支架上，冷却或不烫手的情况下使用。
每做完一瓶无菌分化材料，都应将刀子镊子进行灭菌，否则会引起交叉污染。
3、器具及用品（盘子、培养基、原瓶苗）用酒精喷壶消毒之后，放在超净工作台面上待用（台内只放无菌器具和用品）。
盘子在酒精消毒后，小心地打开报纸，反扣在台面上，手不要触碰碟子，否则碟子会积聚菌，导致瓶苗污染。
4、操作前要检查好所取苗子是否为无菌苗，在发生真菌性污染（在培养基表面有粉状、毛状菌）、细菌性污染（在培养基表面有油状、浓状菌斑）时要将瓶苗放在一边，不可以打开瓶盖，以免发生超净台环境污染。
百合组培苗的污染成因及其预防措施
百合组培苗的污染成因及其预防措施摘要百合寓意美好，花型美丽，是重要的观赏花卉，尤其在切花市场和庭院绿化中需求量较大。
除了可以用于观赏，有些品种的百合还具有药用和食用价值，有广阔的市场前景。
目前主要是通过百合组培苗的方法来大量繁殖，该方法相对于传统的鳞茎包埋法大大提高了繁殖效率，但是百合组培苗常因为培养材料或是培养环境灭菌不达标而导致污染，严重影响了组培苗的生产效率，本文设计了多组对照实验探讨了导致百合组培苗污染的成因，并在此基础上提出了一些预防的措施。
关键词百合组培污染灭菌预防Abstract Lilium is a genus of herbaceous flowering plants growing from bulbs, all with large prominent flowers, which are large, often fragrant, and come in a range of colours. Lilies are often grown for the garden , also they form important cut flower crops and are very useful as food, as well as herb.Tissue culture is the most popular methods to breed Lilium. It is more effective and less infected .Several control experiments are performed in this paper to investigate the causes of infection ，at the base of which we include some feasible precautions.Key words Lilium Tissue culture infection sterilization precautions百合是百合科百合属所有种的总称，属于多年生具有地下鳞茎的草本植物，主要分布在亚洲的东部、欧洲和北美洲等北半球的温带地区。
植物组培实验报告
植物组培实验报告一、实验目的本实验旨在通过植物组培技术培育出按需选择的完整植株，并探究植物组培技术的应用。
二、实验材料试验材料：百香果种子、消毒酒精、无菌培养基、干燥器、灭菌器、显微镜、组织培养器具。
三、实验方法1.种子外壳处理将百香果种子先用消毒酒精处理5min，再用盐酸（1~2mL/L）处理1min，最后用净水清洗3~5次，使种子壳子软化。
2.种子表面消毒将处理后的种子放入75%乙醇，浸泡2mins，在无菌条件下进行消毒处理。
然后在滤纸上用双倍浓度的漂白粉水溶液进行消毒2~4min，之后用无菌水洗3次，每次20~30s。
3.种子萌发将消毒处理好的种子放入含有生长调节剂的MS培养基中进行培育。
培养条件为25℃，光照强度为1500lx，每天进行16小时的光照和8小时的黑暗，培养30天之后，进行观察和筛选。
4.植株分化将萌发出来的幼苗转移到含有植物生长调节剂和培养素的组织培养基上。
在培养的过程中，由于组织培养的原理是通过植物生长调节剂和培养素激活其分裂能力，以实现大规模繁殖，因此在培养时一定要注意调节生长调节剂和培养素的浓度。
5.植株转化和生长将组织培养出来的未成熟小植株转移到含有特定基因和生长调节剂的培养基上进行转化培育，并在之后进行细胞壁硬化，以使小植株具备专门应用的性状。
之后，将已转化和生长成熟的植株经过移栽成功地种植到土壤中。
四、实验结果分析1.种子处理是组织培养成功的关键处理好了种子，百香果的发芽率可达65%～80%。
可见，用酒精消毒、盐酸处理和漂白粉消毒的方法可有效控制种子的杀菌，同时软化外壳，达到提高发芽率的预期目的。
2.多种因素会影响百香果的组培成功率影响百香果组培成活率的因素很多，包括培养条件、培养液质量、培养基配方、营养成分等。
调整不同参数来探究其合理性，比如控制不同光照强度，不同的基质等。
3.尝试不同的分化方法以提高分化率在组织培养出来的小植株进行分化时，可以通过一些策略来提高分化度，如预处理再接种、生长调节剂和营养因子酵素等，以及锌、铜等金属元素。
植物组织培养的三大难题及解决方法
植物组织培养的三大难题及解决方法摘要：植物组织培养是以细胞全能性为理论基础建立的一种离体培养技术，阐述了植物组织培养快繁中褐变、玻璃化、污染和移栽成活率低等问题出现的原因，提出预防和控制措施。
关键词：植物组织培养；污染；玻璃化；褐化中图分类号：q813.1+2 文献标识码：a 文章编号：1674-0432（2012）-11-0142-2植物组织培养是利用植物体的一部分进行无性繁殖，而产生大量同源母本基因幼苗的生物技术。
植物的组织培养到如今以和农业、园艺、林业、医药等多个方面有了密不可分的关系，为其提供了理论基础和研究方法。
利用自然条件在获得珍稀植物和经济价值较高的植物时，由于受地域及季节的限制，很难达到高效、快速的目的。
通过组织培养这一技术手段则能满足这一要求。
组织培养在挽救珍稀植物、创造新物种等方面做出了重要的贡献[1]。
但是在植物的组培技术上面临的三个难题却经常困扰大家。
它们分别是污染，植物玻璃化和植物褐化。
1 污染污染是在组培过程中所面临的首要难题，该问题经常遇到并且难以解决。
不能把污染率降低到可行的范围内植物组培就很难进行下去，这是该问题所要面对的第一个难题。
在进行植物的组织培养时，通常存在两种污染方式：一种是外植体消毒不彻底以及无菌操作过程中引起的污染；另一种是引起内源菌污染的主要原因的真菌和细菌[2]。
大多数的研究结果表明引起污染的主要原因为外植体的生长状况、环境条件和操作过程[3]。
外植体污染是最难解决的污染之一。
污染来源主要为外植体处理不当或培养基的灭菌不彻底，或对接种工具的消毒不够，或操作人员的操作不慎，或环境不洁等所致。
选取外植体的原则是污染少易启动[4-5]。
选择有最大分化潜能的外植体是确保组织培养成功的关键[6]。
常规试验一般选用0.1%hgcl2溶液浸泡，再用无菌水对外植体进行反复冲洗，灭菌效果最好且污染率低。
胡重怡等在烟草无菌苗培养前种子消毒技术的研究中使用先用70%c2h5oh溶液进行消毒，再用30%h2o2的浸泡，再用无菌水反复冲洗外植体，所得烟草种子污染率底[7]，h2o2分解后生成有杀菌作用的氧气而成为无毒害的化合物[8-9]对外植体的损害小。
植物组培中常见污染及其预防措施
植物组培中常见污染及其预防措施1、污染原因污染是指在培养过程中，培养基或培养材料上滋生真菌、细菌等微生物，使培养材料不能正常生长和发育的现象。
组织培养中污染是经常发生的，常见的污染病原是细菌和真菌两大类。
细菌污染常在接种1-2d 后表现，培养基表面出现黏液状菌斑。
真菌污染一般在接种后3d 以后才表现，主要症状时培养基上出现绒毛状菌丝，然后形成不同颜色的孢子层。
造成污染的原因也很多，主要有(1) 培养基及各种使用器具灭菌不彻底(2) 外植体消毒不彻底(3) 接种时不严格无菌操作(4) 接种和培养环境不清洁(5) 培养容器原因，包括盖子和封口膜等。
材料带菌或培养基灭菌不彻底会造成成批接种材料被细菌污染，操作人员不严格遵守无菌操作规程也是造成细菌污染的重要原因。
培养环境不清洁、超净工作台的过滤装置失效、培养容器的口径过大以及封口膜破损等主要引起真菌污染。
2、污染的预防措施(1)灭菌要彻底在组培生产中，各种培养基以及接种过程中使用的各种器具都要严格灭菌。
首先是培养基的灭菌，耐高温的培养基需要在121-123'C条件下灭菌20-30min。
若出现灭菌时间不足或温度不够，培养一段时间后就会在培养基表面产生细菌性的污染。
一些不耐高温的物质，可采取细菌过滤器除去其中的微生物。
其次，接种用的器具除了经过高温霉菌外，在接种的过程中，每使用 1 次后，都要蘸酒精在酒精灯火焰上灼烧灭菌，特别是在不慎接触到污染物时，极易由于器具引起污染。
第三，对于被污染的培养瓶和器皿要单独浸泡，单独清洗，有条件的灭菌后再清洗。
(2)选择适当的外植体要认真地选择外植体，减少外植体上的带菌量。
一般多年生的木本材料比一二年生的草本材料带菌多；老的材料比幼嫩的材料带菌多；田间生长的材料比温室生长的材料带菌多；带泥土的材料比不带泥土的材料带菌多。
用茎尖作外植体时，应在室内或无菌条件下对枝条进行预培养。
将枝条用水冲洗干净后插入无糖的营养液或自来水中，使其发枝。
植物组织培养室及培养用具的消毒与灭菌（3学时）
实验一植物组织培养室及培养用具的消毒与灭菌（3学时）一、目的要求1、通过实验，培养学生良好的卫生观念，确立组织培养的无菌意识；2、掌握组织培养室的消毒及灭菌方法。
3、掌握培养用具的干热灭菌的一般操作技术。
二、仪器与用具1、用具：喷雾器、工作服、口罩、手套等；2、药品：2%新洁尔灭，高锰酸钾，甲醛，70%酒精。
三、方法步骤（一）植物组织培养室的灭菌1、地面、墙壁和工作台的灭菌：用2%新洁尔灭喷雾。
（1）配方：取新洁尔灭原液20ml，加水980ml，配成2%新洁尔灭溶液。
（2）方法：将配好的2%新洁尔灭溶液倒入喷雾器内，进行均匀喷雾。
（3）注意事项：①墙壁、角落、地面喷雾要均匀，不要遗漏；②注意安全，在喷房顶时，要特别小心，防止药液雾滴掉入眼睛。
2、无菌室和培养室的灭菌：用甲醛和高锰酸钾熏蒸，1年中熏蒸1-2次。
（1）配方：每立方米空间用甲醛10ml加高锰酸钾5g的配比液熏蒸。
（2）方法：首先房子要密封。
然后在房子中间放一口缸或大烧杯，将称好的高锰酸钾放入缸内，再把已称量的甲醛溶液慢慢倒入缸内，完毕，人迅速离开，并关上门，密封3天。
（3）注意事项：①操作前要戴好口罩及手套；②倒入甲醛时要小心，因为甲醛遇到高锰酸钾会迅速沸腾，并产生大量烟雾。
操作时人要迅速避开烟雾；③3天后，打开房间，搬走费液缸；一周后，方可进入操作。
3、在已经熏蒸过的房间内，用70%酒精纱布擦洗培养架、工作台。
4、用紫外灯照射20—30min。
5、使用前，再用70%酒精喷雾，使空间灰尘落下。
（二）培养基的灭菌——高压蒸汽灭菌（湿热灭菌法）（1）洗涤：把组织培养基用的培养皿、三角瓶、试管等玻璃器皿进行彻底清洗。
自然晾干或烘箱干燥。
（2）包扎：用牛皮纸、报纸、纱布或锡箔纸把玻璃器皿和金属器械分别包扎好。
（3）装水：在高压灭菌锅内装入一定量的水（水要淹没电热丝）。
（切忌干烧！）（4）装物品：在灭菌锅内放入含培养基的培养瓶或三角瓶、装蒸馏水的玻璃瓶，以及包扎好的玻璃器皿和金属器械等。
植物组织培养实验中存在的问题及其解决办法
植物组织培养实验中存在的问题及其解决办法李万德，杜桂，张剑（湖北生态工程职业技术学院，湖北武汉430200）[摘要]植物组织培养操作过程中的经验积累和技术的掌握是很重要的。
在实验过程中常常出现下列问题：培养基母液配置时容易出现钼酸钠难溶解，母液的贮存过程中产生沉淀或有结晶析出，培养基高压蒸气灭菌后出现灭菌不彻底，组织培养中出现褐化及玻璃化现象。
通过改进母液的配制方法、培养基高压灭菌时采用二次排气法，在培养基中,添加有机物、抑制剂等可解决实验出现的问题。
[关键词]植物组织培养；问题；解决办法[中图分类号]Q813.1+2[文献标识码]C [文章编号]0000-2157/SG (2006)02-0011-02植物组织培养研究自Haberlandt (1902)的工作开始，至今已有100年的历史，广义的组织培养，不仅包括在无菌的条件下利用人工培养基对植物组织的培养，而且包括对原生质体、悬浮细胞和植物器官的培养。
Gam-borg 曾根据所培养的植物材料的不同，把组织培养分为5种类型，即愈伤组织培养、悬浮组织培养、器官培养（胚、花药、子房、根和茎的培养等）、茎尖分生组织培养和原生质体组织培养。
现在植物组织培养技术已在科研和生产中广泛应用，成为最引人注目的生物技术之一，虽然植物组织培养的操作过程并不复杂，但在实验和生产的失败，给科研和生产造成损失，所以，植物组织培养操作过程中经验积累和技术掌握是很重要的。
1培养基母液的配制MS 培养基是组织培养中常见的培养基，下面以MS 培养基为例，简述其母液配制过程中常见的问题及改进办法。
1.1大量元素母液贮存时有沉淀物大量元素中的Ca 2+与SO 42-和HPO 42-容易生成CaSO 4，CaHPO 4沉淀，改制方法把其中的Ca 2+单独配制成一个贮备液，而把其他的大量元素配制成另一个贮备液，考虑到大量元素的溶解度及方便使用问题，通常配制成20倍母液，例如配制1000ml 培养基，只需50ml 大量元素母液。
降低植物组培苗的污染方法
摘要：控制污染是植物组培苗工厂化生产中重要的技术环节，本文从外植体消毒、操作污染和环境污染、继代培养中污染的防治、减少培养基中的有机成分等方面讨论了减少污染的措施和方法。
关键词：组织培养污染防治方法植物组培苗的工厂化生产在我国发展速度很快，组织培养技术日趋完善，在市场竞争中，如何降低成本是提高经济效益的首要问题，组织培养中污染率的增加势必引起组培苗成本的提高，经济损失很大。
因此,组织培养中降低污染率是工厂化生产中不可忽视的技术环节[1]。
植物组织培养过程中造成污染的原因是多方面的，应根据具体情况从不同方面预防解决。
1 外植体的消毒要尽量选取带菌少的材料，如果室外栽培的材料污染太严重，就要采取一些预防措施：先将植物样本挖出，改为室内盆栽，喷布杀虫剂和杀菌剂，不便移栽的，可套塑料袋，等它们长出新枝条后，再行采样接种。
邢震等对比野外直接采用外植体和经室内黄化处理的外植体组织培养效果分析发现，经黄化处理的外植体污染率低，但分化明显没有野外直接采用的外植体强[2]。
先对材料进行低温预处理也有利于降低污染率，于福科等把刚采回的玫瑰枝置于冰箱7d后，选取带芽茎段培养，并与未经低温处理的材料作对照，发现低温处理后的材料，污染和褐化均有不同程度的降低，且带芽茎段的萌动也明显提早。
这可能与杂菌或某些酶的活性在低温下受抑制或被冻结有关[3]。
高成伟等在夏橙的组织培养中用10ｍｇ/Ｌ培福朗溶液预处理56ｈ接种枝条也取得了较好的消毒效果[4]。
外植体消毒常用药剂有：70 %～75%的乙醇溶液，0.3－0.6％的次氯酸钠溶液和0.1 %的升汞溶液。
选用何种灭菌剂和灭菌时间根据操作者的经验来掌握，既要求将外植体表面的微生物彻底杀死，又要求尽可能少伤害外植体组织和表层细胞。
先用75％的酒精棉花擦拭外植体材料再使用消毒药剂常能取得较好的消毒效果，尤其对有毛的材料。
周俊辉等对玛丽安万年青采用减压灭菌，利用减压抽走植物组织中的气体使消毒剂更易进入植物内部，从而增强杀菌效果，使污染率从对照的93.3 %降低到40.0 %[5]。
组培实验室常见消毒方法优劣比较
组培实验室常见消毒方法优劣比较组培实验室是生命科学及相关学科实验室建设中必备的实验室。
组培实验室的消毒是实验室日常管理工作的重要环节，直接关系着组培实验的成功与否和组培幼苗的质量高低。
组培实验室的消毒一般又可分为环境消毒、培养基消毒和外植体的消毒。
培养基的消毒主要是在高压灭菌锅中进行，在此不再赘述。
环境消毒和外植体的消毒则有多种方法，这些方法各有优劣，使用不当时还会对人体产生伤害，为此，笔者特对这些典型方法进行分析比较，为组培实验室的科学管理提供一些参考。
1 组培实验室的环境消毒保持组培实验室的空气清洁度是减少组培污染的重要条件，用于实验室消毒的常规消毒方法包括紫外线照射法、甲醛熏蒸法、新洁尔灭(苯扎溴铵溶液)法等，比较新的方法有中草药消毒法。
1.1 紫外线照射法紫外线是波长在10-400 nm之间辐射光的总称，能引起细菌、病毒等微生物遗传物质的结构发生变化，从而影响DNA复制、RNA转录和蛋白质的翻译，导致病菌或病毒死亡。
此外，紫外线辐射所产生的臭氧和各种自由基可损伤蛋白质和酶分子，导致功能改变。
紫外线消毒具有广谱性，可杀灭细菌、病毒、真菌、支原体等各种微生物。
紫外消毒具有较高的杀菌效率，且由于未使用化学药剂，消毒过程中不会产生对人体和环境有害的副产物。
该技术运行维护简单，费用较低。
采用室内悬吊式紫外线消毒时，室内安装紫外消毒灯的数量为每平方不少于1. 5 W，照射时间不少于30 min。
但需要指出的是，过量的紫外线照射对人体有一定的危害乃至致癌作用。
紫外线作用于中枢神经系统，可出现头痛、头晕、体温升高等症状。
过量辐射会诱发皮肤癌。
紫外辐射对眼睛的损伤特别明显，严重时可能诱发白内障。
因此，当组培实验室在用紫外消毒期间，工作人员不要呆在正消毒的空间内，切忌用眼睛注视紫外灯。
特别的，如超净工作台内的紫外灯打开消毒时，应避免将手长时间暴漏于紫外灯下。
一般在接种室用紫外线消毒后，不要立即进入接种室，此时室内充满高浓度的臭氧，会对人体，尤其是呼吸系统造成伤害。
组培常用的消毒方法[资料]
![组培常用的消毒方法[资料]](https://img.taocdn.com/s3/m/75716d9d6429647d27284b73f242336c1eb930c0.png)
组培常用的消毒方法一、物理消毒方法：是利用物理因素作用于病原微生物将之杀灭或清除的方法。
物理因素按其在消毒中的作用可分为五类：（１）具有良好灭菌作用的，如热力、微波、红外线、电离国徽等，它杀灭微生物的能力很强，可达来灭菌要求；（２）具有一定消毒作用的，如紫外线、超声波等，可杀灭绝大部分微生物；（３）具有自然净化作用的如寒冷、冰冻、干燥等，它们杀灭微生物的能力有限；（４）具有除菌作用的，如机械清除、通风与过滤除菌等，可将微生物从传染媒介物上去掉；（５）具有辅助作用的，如真空、磁力、压力等，虽对微生物无伤害作用，但能为杀灭、抑制或清除微生物创造有利条件。
二、热力灭菌法：包括干热灭菌与湿热灭菌法。
热力灭菌效果可靠又简便易行，为首选的灭菌方法。
干热灭菌可使菌体蛋白质变性及电解质浓缩。
湿热灭菌可使菌体蛋白质变性，核酸降解及损伤细菌的细胞膜。
湿热灭菌的优越性有穿透力强，菌体吸收水分易变性凝固及蒸汽有潜在热能。
干热灭菌法主要有焚烧法、烧灼法和干烤法3种。
（1）焚烧法：是一种较彻底的灭菌方法，在焚烧炉内焚烧尸体及废弃物，可杀灭细菌芽胞。
（2）烧灼法：为直接用火焰灭菌，例如在微生物实验室内，利用火焰对接种环，试管口等灭菌。
（3）干烤法：为利用烤箱加热至160～170℃，2小时，适用于耐高温的玻璃、陶瓷或金属器皿的灭菌。
湿热灭菌法包括巴氏消毒法、煮沸法、加压蒸汽灭菌法和间歇蒸气灭菌法等。
（1）巴氏消毒法：加热62℃30分钟或71.1℃15～30秒（s），不使蛋白质变性，但可杀灭常见致病菌常用于牛奶和酒类的消毒。
（2）煮沸法：在1个大气压下，将水煮沸（100℃）5分钟，可杀灭细菌繁殖体，如加入2%碳酸钠，可提高沸点至105℃并可防锈，常用于餐具及一些医疗器皿的消毒。
（3）加压蒸汽灭菌法：应用高压蒸汽灭菌器，加压至1.05kg/cm2即温度达121.3℃，15～20分钟，可杀灭细菌芽胞和各类微生物，常用于培养基、葡萄糖盐水输液、手术敷料及各种耐高温湿物品的灭菌。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
浅谈植物组织培养中如何预防细菌污染的技术摘要:植物组织培养中经常出现不同程度的污染问题，造成很大的损失，因此预防细菌污染是植物组织培养苗工厂化生产中重要的技术环节。
本文通对植物组织培养污染来源的分析和控制，浅析了如何在植物培养中预防何控制细菌的污染，以达到植物组织培养的最优化。
关键词:植物组织培养污染防治前言：植物组织培养是 20 世纪初以植物生理学为基础发展起来的一门新兴技术 ,这项技术已在科研和生产中得到广泛应用 ,成为举世瞩目的生物技术重要内容之一。
特别是近几年 ,不少组织培养工厂应用该技术大量生产花卉、蔬菜及特种经济植物幼苗、脱毒苗 ,使作物种植逐步摆脱周期长、完全受自然控制的分散状态 ,逐步走向集中控制、规模化、自动化、不受自然影响的工厂化生产【1】尽管组织培养方面理论研究已相当精深 ,但在预防细菌污染中还存在种种的问题，因此介绍和讨论了组织培养中的污染原因及其对策。
植物组培苗工厂化生产在我国发展速度很快，组织培养各方面的技术日渐完善。
但在组织培养中常常出现不同程度的污染。
据了解，很多学者在初代培养这一阶段，很难得到无菌苗，或者虽然在初代培养得到了无菌苗，但在继代培养时往往出现大量污染甚至全部污染。
在市场竞争中，如何降低成本是提高经济效益的首要问题，组织培养中污染率的增加势必然引起组培苗成本的提高，经济损失大。
因此，组织培养中降低污染率是工厂化生产中不可忽视的技术环节。
在植物组织培养过程中，存在两种类型的污染：一类是通常所说的污染，即外植体消毒不彻底，无菌操作和培养过程中，如：培养基、接种工具、接种室消毒不严格或操作不规范而导致的污染；另一类是内源菌污染，内源菌包括真菌和细菌，内源污染一般是指内源细菌所致的污染。
本文主要探讨了如何预防细菌的污染。
1细菌污染简介1.1污染的原因污染的原因在培养过程中污染是经常发生的。
它会导致培养基和培养材料上滋生杂菌 ,最终组培失败。
在科研和商品化生产种苗中 ,污染率是与经济效益紧密相关的一个重要指标 ,控制污染率无疑是一项提高经济效益、节约材料的有效途径之一。
因此 ,探讨和重视污染在科研和生产中显得十分重要。
1.2操作污染和环境污染操作污染和环境污染指真菌污染和细菌污染。
真菌污染主要来源于环境，细菌污染主要来源于接种材料及工具。
此类污染可通过如下措施加以克服：1.2.1 改善环境条件每次接种前应对接种室的地面进行清洁卫生工作，并用75%的酒精喷雾使空气中的灰尘沉降，并用紫外线灯在黑暗中照射20~30分钟。
接种前工作台面要用新洁尔灭或75%酒精擦洗,使用超净工作台对接种环境污染的控制更有成效。
但它应置放在洁净的房间，窗户密封，并定期清洗过滤膜，以延长使用寿命。
培养室的相对湿度应控制在70%左右，相对湿度太高时可以用抽湿机除湿。
在接种结束时，应进行地面清洁卫生工作，即先打扫一遍，再用湿布擦过，并定期用甲醛熏蒸接种室。
1.2.2无菌操作和无菌操作技术工作人员使用的工作服、帽子、口罩等，要经常保持干净，并定期进行消毒。
在接种前要剪除指甲，并用肥皂或洗衣粉溶液擦洗，最好再在新洁尔灭溶液中浸泡10分钟，后用75%的酒精擦手，并用75%的酒精擦拭母种瓶表面进行消毒，以防把微生物带进超净工作台。
同时要求工作人员在接种时，最好不要感冒咳嗽和说话。
污染中特别注意一种呈乳白色的细菌污染，这种细菌为芽孢杆菌。
法国林木育种协会鉴定为迟缓芽孢杆菌，它外被荚膜，耐高温，一般消毒剂难以杀死。
它可随培养材料、用具等传播；也可出现在培养基表面，或呈滴形云雾状存在培养基内，若出现时应严格灭菌，清洗和消毒用具，并更换消毒酒精。
操作人员操作动作要熟练、动作快、规范，这样可以缩短操作时间，减少污染。
因为有很多组织培养的失败，从材料、培养基条件等方面检查均无问题，只是由于操作技术不熟练，如脱毒培养抽取茎尖很小，操作时间长了就会使茎尖失水变干，或不慎感染杂菌，再同时接种的环境又不是绝对无菌的。
1.2.3 严查接种材料淘汰被细菌污染过的接种材。
1.2.4经常检查消毒锅的灭菌质量消毒锅的压力表降到零后不能马上出锅。
因冷热空气作用的负压效应，使外界环境的冷空气倒吸入已灭菌好的培养瓶内引起真菌污染，为避免该现象的发生，消毒后培养瓶应留在锅里，等冷却后才出锅。
如果出现培养基造成的污染，就要及时地检查灭菌锅的性能或其他的问题。
1.2.5检查培养容器是否存在问题培养容器封口多用塑料盖、胶塞、棉塞、薄膜等，塑料盖用久了易老化，密封性差，也会造成污染。
同时，培养瓶在使用之前要洗净（包括瓶内瓶外），灭好菌的培养瓶不要放在空气中太久，一般出锅后1~2天内接完种最好，以减少培养瓶表面的微生物引起的污染。
2 内源性污染的控制2.1 内源性污染的含义在植物组织培养中，由于材料内部的内生菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料进入培养过程，引起的污染称为内生性污染或内源性污染。
2.2 内源性污染的种类从已有报道看，被鉴定的种类主要有：黄单胞菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、土壤杆菌属、棒状杆菌属、欧文氏菌属等。
真菌主要有霉菌。
目前在各种农作物及果树等经济作物中发现的内生细菌已超过129种（隶属于54个属）对于一种植物而言，从中分离到的内生真菌和内生细菌通常为数种至十种，有的还到百种之多，其主要出现在热带植物组织中。
2.3内源性污染的分布内源性污染主要发生在那些生长在高温多雨的热带、亚热带和多年生木本植物，尤其是在污染较严重的地区，如工业区，人口众多的城市，公路边等。
2.4内源性污染的症状和危害性在初代培养中，表面细菌引起的污染通常在2~3天就能在外植体周围或培养基表面形成明显的如水污状、油污状、气泡或干缩的红、黄、乳白等颜色的菌落。
而在外植体培养后3~5天内并未发现细菌污染，以后则不继出现明显的或不明显的细菌菌落，就可能是由内生细菌引起的污染。
在某些植物初代培养或前几代的继代培养中存在的污染，并不形成明显的菌落而只在培养基内部形成“丝状物”，“晕状物”，不易被肉眼发现的，如不仔细观察很容易忽视，随着继代培养次数的增加，菌量不断的积累，就会在培养基上表现出来。
对于这种情况，我们可以利用背光检查法去观察发现它。
内生细菌引起的危害主要包括在早期导致培养失败，增殖效率降低，培养物生长减慢，玻璃化苗增多等。
在后期导致试管苗移栽困难或死亡，有时污染也会引起培养物的遗传变异。
3细菌污染的防止措施3.1外植体的消毒3.2.1预栽管理一般来说，温室内盆栽的植株比室外栽培的植株含菌少，为了能更好的降低污染率，我们要把室外栽培变为室内盆栽。
要求：盆栽用土应使用不含有机质及经消毒的清洁土壤，尤其是要采集地下材料时，须用经过消毒蛭石等作栽培基质；施用无机肥，并对植物喷洒杀虫剂和杀菌剂。
不便移栽的，可套塑料袋，待长出新枝条后，再采样接种。
3.2.2 外植体预处理3.2.2.1促发新枝将田间采集的枝条用水冲洗干净后插入无糖的培养液或自来水中，使其发枝，后以这种新抽的嫩枝作为外植体，可大大减少内源菌的污染。
3.2.2.2 黄化处理在无菌条件下，对采自田间的枝条进行暗培养，待抽出徒长的黄化枝条时取材，也可减少污染。
这方法曾用于成年栗树的枝条和仙客来实生苗，减少了内生细菌的污染。
3.2.2.3热击处理如将美丽百合的鳞茎外植体放入试管中进行43聂氏度热击处理，罗伯利槭的休眠芽进行42.5聂氏度或45聂氏度热击处理；草莓茎尖在30聂氏度处理可得到脱毒苗。
3.2.2.3用抗生素进行处理庆大霉素和链霉素，属于氨基糖苷类型，它们与细菌中的30S核蛋白体亚单位结合，抑制细菌的酸苷油酯合成，通过阻断其正常代谢途径使微生物致死。
如相思树的茎段灭菌时，用皂液刷洗和75%酒精杀菌后，转入不同的抗生素溶液中，在摇床上振荡过夜，再用75%的酒精和0.1%升汞分别杀菌1分钟和15分钟，灭菌效果（如下表）其中以抑制剂ANB1和ANB2的抑制效果较好，未污染的分别为63.3%和76.7%；成活率分别为60.0%和50.0%。
不同抗生素预处理对相思树茎段的影响3.2.3改进灭菌方法3.2.3.1真空减压灭菌利用真空减压抽走植物组织中的空气，使消毒剂容易侵入，从而增强杀菌效果。
经对万年青茎段的实验可知道：减压灭菌的效果明显优于常规灭菌（如下表），未污染率从常规的6.7%升到60.0%，成活率从常规的3.3%升到43.3%。
常规灭菌与真空减压来灭菌对万年青茎段防止效果比较3.2.3.2磁力搅拌、超声波振动法为减少在外植体表面形成的气泡，在浸泡时还可采用磁力搅拌和超声波振动的方法。
如对月季、苹果的枝条，用0.1升汞磁力搅拌15~20分钟，再用无菌水磁搅拌清洗，污染率有所下降。
3.2.3.3灼烧灭菌利用火烧的方法杀死外植体表面的所有微生物，以不伤害所要使用的组织或细胞为度。
如将马蹄莲的根在95%的酒精中浸泡1分子钟后，短时间内灼烧2次，比常规消毒的污染率降低60%。
这种方法已用在绿色荚果、蒜的小鳞茎和银白杨芽的消毒。
3.2.3.4酸化培养基除了欧文氏菌属外，大多数细菌在介质PH小于4.5时不能生长。
在紫苑属、鸢尾属、蔷薇属植物组织中，将培养基的PH5.8降到3.9~4.3，可防止大量的细菌污染。
3.2.3.5 其他多次消毒如先用皂液对番木瓜侧芽浸泡20~30分钟，再用0.1%高锰酸钾溶液处理5分钟，然后进行消毒处理，然后用4%次氯酸钠加0.1%升汞消毒，最后用无菌水洗，污染率降低为50%左右；使用混合消毒液是用几种消毒液(如多菌灵、抗坏血酸、柠檬酸、氯霉素等混合)对外植体时行处理，以降低污染率；在培养基中加入其他抑菌剂（如50%多菌灵、70%甲基托布津和25%甲霜灵）抑菌率也非常高。
3.2.4继代培养中污染的控制初代培养获得的无菌材料在后期或继代培养也可能出现污染，这一方面是由于操作不慎的原因，另即是由于初代培养中使用了营养相对简单的培养基有可能使污染不易表现出来，有时继代材料在培养室则可能被螨传播的真菌污染。
这类污染可以从以下2个方面进行防止。
(1)扩大繁殖时应有合理程序。
在获得的无菌培养物之后，应将其中一部分作为“原种”保存起来，分批繁殖和复检后再大规模生产。
（2）可通过在培养基中加入抗菌剂来防止。
多菌灵用于金线莲组织培养的抑菌促生长，培养物不受微生物污染，灭菌率为98%以上，无白化苗，生长健壮，不过这种方法不能广泛使用，因为有些植物在抑菌素会受到毒害，如叶片变小、变黄和不能分化等。
还有使用时要调到适合的浓度。
对植物中的内生细菌，由于它潜伏得较深，表面消毒方法无法将其消灭。
有时在外植体的初级培养中，包括前几代的继代培养，往往在培养基上不易被发现，随着继代次数的增加，菌量慢慢累积发展，才在培养基上显现出来。
可通过在培养基中添加抗菌素，降低PH值等措施防止和减少细菌等内生菌的污染。