组培防止灭菌的方法

浅谈植物组织培养中如何预防细菌污染

的技术

摘要:植物组织培养中经常出现不同程度的污染问题，造成很大的损失，因此预防细菌污染是植物组织培养苗工厂化生产中重要的技术环节。本文通对植物组织培养污染来源的分析和控制，浅析了如何在植物培养中预防何控制细菌的污染，以达到植物组织培养的最优化。

关键词:植物组织培养污染防治

前言：

植物组织培养是 20 世纪初以植物生理学为基础发展起来的一门新兴技术 ,这项技术已在科研和生产中得到广泛应用 ,成为举世瞩目的生物技术重要内容之一。特别是近几年 ,不少组织培养工厂应用该技术大量生产花卉、蔬菜及特种经济植物幼苗、脱毒苗 ,使作物种植逐步摆脱周期长、完全受自然控制的分散状态 ,逐步走向集中控制、规模化、自动化、不受自然影响的工厂化生产【1】尽管组织培养方面理论研究已相当精深 ,但在预防细菌污染中还存在种种的问题，因此介绍和讨论了组织培养中的污染原因及其对策。

植物组培苗工厂化生产在我国发展速度很快，组织培养各方面的技术日渐完善。但在组织培养中常常出现不同程度的污染。据了解，很多学者在初代培养这一阶段，很难得到无菌苗，或者虽然在初代培养得到了无菌苗，但在继代培养时往往出现大量污染甚至全部污染。在市场竞争中，如何降低成本是提高经济效益的首要问题，组织培养中污染率的增加势必然引起组培苗成本的提高，经济损失大。因此，组织培养中降低污染率是工厂化生产中不可忽视的技术环节。

在植物组织培养过程中，存在两种类型的污染：一类是通常所说的污染，即外植体消毒不彻底，无菌操作和培养过程中，如：培养基、接种工具、接种室消毒不严格或操作不规范而导致的污染；另一类是内源菌污染，内源菌包括真菌和细菌，内源污染一般是指内源细菌所致的污染。本文主要探讨了如何预防细菌的污染。

1细菌污染简介

1.1污染的原因

污染的原因在培养过程中污染是经常发生的。它会导致培养基和培养材料上滋生杂菌 ,最终组培失败。在科研和商品化生产种苗中 ,污染率是与经济效益紧密相关的一个重要指标 ,控制污染率无疑是一项提高经济效益、节约材料的有效途径之一。因此 ,探讨和重视污染在科研和生产中显得十分重要。

1.2操作污染和环境污染

操作污染和环境污染指真菌污染和细菌污染。真菌污染主要来源于环境，细菌污染主要来源于接种材料及工具。此类污染可通过如下措施加以克服：

1.2.1 改善环境条件

每次接种前应对接种室的地面进行清洁卫生工作，并用75%的酒精喷雾使空气中的灰尘沉降，并用紫外线灯在黑暗中照射20~30分钟。接种前工作台面要用新洁尔灭或75%酒精擦洗,使用超净工作台对接种环境污染的控制更有成效。但它应置放在洁净的房间，窗户密封，并定期清洗过滤膜，以延长使用寿命。培养室的相对湿度应控制在70%左右，相对湿度太高时可以用抽湿机除湿。在接种结束时，应进行地面清洁卫生工作，即先打扫一遍，再用湿布擦过，并定期用甲醛熏蒸接种室。

1.2.2无菌操作和无菌操作技术

工作人员使用的工作服、帽子、口罩等，要经常保持干净，并定期进行消毒。在接种前要剪除指甲，并用肥皂或洗衣粉溶液擦洗，最好再在新洁尔灭溶液中浸泡10分钟，后用75%的酒精擦手，并用75%的酒精擦拭母种瓶表面进行消毒，以防把微生物带进超净工作台。同时要求工作人员在接种时，最好不要感冒咳嗽和说话。污染中特别注意一种呈乳白色的细菌污染，这种细菌为芽孢杆菌。法国林木育种协会鉴定为迟缓芽孢杆菌，它外被荚膜，耐高温，一般消毒剂难以杀死。它可随培养材料、用具等传播；也可出现在培养基表面，或呈滴形云雾状存在培养基内，若出现时应严格灭菌，清洗和消毒用具，并更换消毒酒精。

操作人员操作动作要熟练、动作快、规范，这样可以缩短操作时间，减少污染。因为有很多组织培养的失败，从材料、培养基条件等方面检查均无问题，只是由于操作技术不熟练，如脱毒培养抽取茎尖很小，操作时间长了就会使茎尖失水变干，或不慎感染杂菌，再同时接种的环境又不是绝对无菌的。

1.2.3 严查接种材料

淘汰被细菌污染过的接种材。

1.2.4经常检查消毒锅的灭菌质量

消毒锅的压力表降到零后不能马上出锅。因冷热空气作用的负压效应，使外界环境的冷空气倒吸入已灭菌好的培养瓶内引起真菌污染，为避免该现象的发生，消毒后培养瓶应留在锅里，等冷却后才出锅。如果出现培养基造成的污染，就要及时地检查灭菌锅的性能或其他的问题。

1.2.5检查培养容器是否存在问题

培养容器封口多用塑料盖、胶塞、棉塞、薄膜等，塑料盖用久了易老化，密封性差，也会造成污染。同时，培养瓶在使用之前要洗净（包括瓶内瓶外），灭好菌的培养瓶不要放在空气中太久，一般出锅后1~2天内接完种最好，以减少培养瓶表面的微生物引起的污染。

2 内源性污染的控制

2.1 内源性污染的含义

在植物组织培养中，由于材料内部的内生菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料进入培养过程，引起的污染称为内生性污染或内源性污染。

2.2 内源性污染的种类

从已有报道看，被鉴定的种类主要有：黄单胞菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、土壤杆菌属、棒状杆菌属、欧文氏菌属等。真菌主要有霉菌。目前在各种农作物及果树等经济作物中发现的内生细菌已超过129种（隶属于54个属）对于一种植物而言，从中分离到的内生真菌和内生细菌通常为数种至十种，有的还到百种之多，其主要出现在热带植物组织中。

2.3内源性污染的分布

内源性污染主要发生在那些生长在高温多雨的热带、亚热带和多年生木本植物，尤其是在污染较严重的地区，如工业区，人口众多的城市，公路边等。

2.4内源性污染的症状和危害性

在初代培养中，表面细菌引起的污染通常在2~3天就能在外植体周围或培养基表面形成明显的如水污状、油污状、气泡或干缩的红、黄、乳白等颜色的菌落。

而在外植体培养后3~5天内并未发现细菌污染，以后则不继出现明显的或不明显的细菌菌落，就可能是由内生细菌引起的污染。

在某些植物初代培养或前几代的继代培养中存在的污染，并不形成明显的菌落而只在培养基内部形成“丝状物”，“晕状物”，不易被肉眼发现的，如不仔细观察很容易忽视，随着继代培养次数的增加，菌量不断的积累，就会在培养基上表现出来。对于这种情况，我们可以利用背光检查法去观察发现它。

内生细菌引起的危害主要包括在早期导致培养失败，增殖效率降低，培养物生长减慢，玻璃化苗增多等。在后期导致试管苗移栽困难或死亡，有时污染也会引起培养物的遗传变异。

3细菌污染的防止措施

3.1外植体的消毒

3.2.1预栽管理

一般来说，温室内盆栽的植株比室外栽培的植株含菌少，为了能更好的降低污染率，我们要把室外栽培变为室内盆栽。要求：盆栽用土应使用不含有机质及经消毒的清洁土壤，尤其是要采集地下材料时，须用经过消毒蛭石等作栽培基质；施用无机肥，并对植物喷洒杀虫剂和杀菌剂。不便移栽的，可套塑料袋，待长出新枝条后，再采样接种。

3.2.2 外植体预处理

3.2.2.1促发新枝

将田间采集的枝条用水冲洗干净后插入无糖的培养液或自来水中，使其发枝，后以这种新抽的嫩枝作为外植体，可大大减少内源菌的污染。

3.2.2.2 黄化处理

在无菌条件下，对采自田间的枝条进行暗培养，待抽出徒长的黄化枝条时取材，也可减少污染。这方法曾用于成年栗树的枝条和仙客来实生苗，减少了内生细菌的污染。