半定量

半定量又叫半定量PCR

半定量是RT-PCR做基因表达分析的一种方法，其操作的方法是在野生型和突变体中用一个看家基因（通常是actin）做参照标准来观察目标基因在各自的表达情况（上调还是下调），所谓半定量的“半”是通俗的说法，即在看电泳图估计参照亮度一致（可看作是表达的细胞数一致）情况下，确定目标基因的表达；这是与更加精确的Q-PCR的相对定量和绝对的量区分。

半定量解释

（semi-quantitative interpretation）是介于定性和定量之间的解释。尽管使用了数学方法对地质目标的空间位置或物性进行了数值计算，也获得了量值，但由于这些方法的使用是有非常严格的前提条件的，而在实际情况下这些条件是不满足的，所以这些定量计算的结果只能从趋势上为解释人员提供参考。

半定量分析

定性分析是能区分出是个什么东西。举个例子来说，你能辨认出这是苹果，但你不能确定是几个苹果。

定量分析是在定性的基础上给出清晰的数量关系。比如，你确定了这是5个苹果。

而半定量分析是通常实现定量分析非常困难时采取的一种则中办法。还是举例说明。这里有一堆苹果，你不知道具体的数量。但是你能知道的是这一堆苹果能装5麻袋。这5麻袋的数量估计就是半定量分析。

定量PCR是PCR的一种。PCR仪目的为了基因扩增。在基因扩增中最重要的就是升降温过程，最早的PCR就是三个水浴锅,一个机械臂，定时抓出反应槽转换水浴锅。PCR的结果需要借助其他手段来检测。后来随着定量技术的发展，将PCR和检测做成一体，就形成了定量PCR仪。还可以与荧光技术结合，同时在每个扩增过程都能实施监控。

定量PCR（PolymeraseChainReaction）技术有广义概念和狭义概念。广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR 起始模板量的定量。

广义概念下的定量PCR技术可以分为五种类型：

（1）外参法+终产物分析。所谓“外参法”是指样本与阳性参照在两个反应容器内反应。这种类型没有对样本进行质控监测，易出现假阴假阳结果，没有监测扩增效率，定量不准。

（2）内参法+终产物分析。所谓“内参法”是指样本与阳性参照在一个反应容器内反应。这种类型对样本进行质控监测，排除假阴结果，但是定量不准。

（3）外标法+过程监测。这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，但是无法排除假阴结果。

（4）内参法+过程监测。由于样本与阳性参照在一个容器内反应，用同样的Taq酶和反应参与物，存在竟争性抑制，起始模板量浓度高的反应会抑制起始模板量浓度低的反应，所以定量不准。

（5）外标法+过程监测+内对照。这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，同时排除假阴结果。这种类型是应该提倡的。

狭义概念的定量PCR技术（严格意义的定量PCR技术）是指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果(扩增效率为零)。在国家没有出台阴阳判定标准时，所用PCR 系统灵敏度最好达到一个拷贝（一个病毒）。从理论上说，只要有一个拷贝数，样本就算阳性；一个拷贝数都没有才算阴性。

编辑本段【应用】

定量PCR可以得出准确的定量结果，改变了PCR只用作微量物定性测定的历史，并可进行动态检测和病程疗效分析。同时让质控的建立成为可能，以保证结果的准确性。能对基因突变进行分析。

PCR过程的监测有多种检测模式。最常用的有三种检测模式：

（1）RGreenI检测模式。温度循环为94—55—72°C三步法，只有引物，无探针，荧光染料镶嵌在双股螺旋链中间。通过对特定方向的强荧光检测获得信号，这种试剂检测模式易产生非特异信号，且本底光较大。

（2）解探针模式（Taqman）HydrolysisProbe。温度循环为94—60°C二步法，不仅有引物，还有另外一个特异针对扩增模板的探针在引物对之间。在探针相邻两个碱基上分别结合两个荧光染料，一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态。当Taq酶在60°C延伸扩增链时，遇到探针，利用Taq

酶5`—3`外切酶活性将探针水解成单个碱基，单个碱基之间距离较远，第一个染料的能量无法传给第二个染料，只好通过发射特征光子回到稳定态，通过对溶液中第一个染料的荧光检测获得信号。这种试剂检测模式增加了检测信号的特异性，但是由于利用了Taq酶5`—3`外切酶活性，一般试剂厂家只给Taq酶的聚合酶活性定标，没有同时给Taq酶5`—3`外切酶活性定标，不同批号试剂之间会给定量带来差异。另外对探针的熔点温度（Tm）仅要求其高于60°C，这就使不同试剂盒之间的特异性参差不齐，而且无法做质控检测。

（3）杂交探针（HybridizationProbes）模式。温度循环为94—55—72°C三步法，有引物，二个特异针对扩增模板相邻的探针在引物对之间，在一个探针3`碱基上结合一个荧光染料，在另一个探针5`碱基上结合第二个荧光染料。在55°C时，两个探针都刚好接合在模板上，第一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态，通过对结合在扩增模板上双探针中第二个染料的荧光检测获得信号。这种试剂检测模式中荧光信号与特定杂交温度相关，探针的浓度始终保持不变，因此可

以在扩增后检测熔解曲线作为信号的特异性质控。另外这种试剂检测模式可以用于点突变检测。