复旦大学免疫实验免疫比浊法检测免疫球蛋白

免疫比浊法检测免疫球蛋白

时间：地点：实验人：

1基本原理：

样本中的IgA、IgG与试剂中的抗IgA和抗IgG的特异性抗体结合，产生不溶性免疫复合物，使得反应溶液产生浊度。溶液浊度与样本中IgA、IgG的浓度成正比。在合适的nm处（700nm）测吸光度，通过计算可以得到IgA、IgG的浓度。

2实验材料：

免疫球蛋白A、G（IgA、IgG）测定试剂（试剂1、试剂2）

免疫球蛋白A、G（IgA、IgG）校准品

蒸馏水、血清样本

微量加样枪、ep管（1.5ml离心管）

酶标仪、水浴箱

3实验方法步骤

在酶标管内反应。

从左到右共做6管试剂：

1：IgG试剂1（125µl）+蒸馏水1µl

2：IgG试剂1（125µl）+校准品1µl

3：IgG试剂1（125µl）+样本1µl

4：IgA试剂1（150µl）+蒸馏水3µl

5：IgA试剂1（150µl）+校准品3µl

6：IgA试剂1（150µl）+样本3µl

混匀，37度水浴五分钟。

继续添加试剂，从左到右：

1、2、3：IgG试剂2（42.5µl）

4、5、6：IgA试剂2（50µl）

混匀，37度水浴五分钟。

在OD700nm测取吸光度，记录数据。

4.实验结果：

4.1 IgG蛋白：

空白管吸光度0.051 校准管吸光度1.155 样本管吸光度0.699

IgG校准浓度31.3g/L

待测血清样本中免疫球蛋白含量IgG浓度（g/L）= 0.699-0.051/1.155-0.051 ×31.3=18.4g/L

实验结果偏高，且误差为（18.4-16.0）/16.0 ×100% =15.0%

4.2 IgA蛋白：

空白管吸光度0.049 校准管吸光度0.372 样本管吸光度0.212

IgA校准浓度4.15g/L

待测血清样本中免疫球蛋白含量IgA浓度（g/L）=0.212-0.049/0.372-0.049

×4.15=2.1g/L 实验结果在标准范围内

5实验分析：

5.1 IgG实验校准组数值偏高的原因我们认为可能有以下几点：

●IgG试剂所加的量偏高，但是没有达到过量的程度。导致更多的抗体与抗原

结合，从而使得有更多的抗原抗体复合物沉淀生成，造成最后算出的校准组IgG浓度偏高。

●IgG实验校准组液体中含有气泡，气泡使得液体的吸光度增加，从而造成最

后算出的校准组IgG浓度偏高。

●抗原抗体复合物沉淀附着在装置内壁，阻碍光线传播，造成吸光度偏大。

●透射比浊法本身灵敏度和精密度均不够理想，所做得的结果方差较大，造成

本次实验校准组吸光度偏大。

●抗原抗体反应需要一定时间和温度，操作过程中可能因为时间限制未能使抗

原抗体完全反应，对实验数据可能会造成一定影响。

5.2免疫比浊法的适合区带？

应采用抗体过量的前带，因为所检测的物质是抗原，希望所加样品中的抗原完全与抗体结合形成微粒，所有的微粒均可吸收酶标仪中透过的光线。因为吸光度OD值与溶液中颗粒的浓度成正比，而计算时默认颗粒的浓度与样品中所含抗原的浓度相当，所以，只有在抗体含量过量时，才能保证所有抗原都能与抗体结合形成微粒，降低因抗原未完全结合抗体所带来的误差。

5.3加样头在每次加样器加样之前需不需要更换？

如果加样头没有伸入液面以下，或者是没有更换加样头中所加试剂的种类，则不需要更换加样头。

5.4为什么分两次在37。C水浴加热而非一次?

我们分析认为，在加入抗原之前先进行37。C保温处理，能够更好的保证抗体正常的生理活性，避免了低温环境下小部分抗体活性降低或者失活对实验的影响，使得实验数据具有更高的准确性。