克隆基因的表达和常见系统的类型
外源基因原核系统克隆表达的基本流程
外源基因原核系统克隆表达的基本流程
外源基因原核系统克隆表达的基本流程如下：
1. 设计引物：根据外源基因的序列，设计引物，其中至少包括一个启动子和一个终止子。
2. 基因克隆：使用PCR或其他克隆技术，将外源基因与载体DNA连接起来，形成重组质粒。
3. 转化：将重组质粒转化到适当的宿主细胞中，如大肠杆菌。
4. 筛选：通过选择性培养基或其他筛选方法，筛选出带有重组质粒的转化菌落。
5. 培养：将筛选出的转化菌落进行扩增培养，在适当的培养条件下培养细菌。
6. 表达：在培养过程中，外源基因会被宿主细胞转录和翻译，产生目标蛋白质。
7. 提取：收集细菌培养物，利用细胞破裂或其他细胞提取方法，提取目标蛋白质。
8. 纯化：通过各种纯化技术，如柱层析、电泳等，纯化目标蛋白质。
9. 鉴定：利用各种方法，如SDS-PAGE、Western blot等，对
目标蛋白质进行鉴定和定量分析。
10. 应用：利用纯化的目标蛋白质进行后续的研究或应用，如
功能鉴定、结构分析、抗原制备等。
这是一个基本的流程，根据不同的实验目的和具体情况，可能还会涉及到一些其他的步骤和操作。
基因重组技术生产胰岛素
4. 质粒的拷贝数
增加mRNA数量， 提高核糖体与mRNA的结合速度
（1）强启动子提高转录效率；
（2）使用高拷贝表达载体。
可调控的诱导型复制子
宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制
宿主大量生长后，诱导载体质粒复制， 增加拷贝数
第31页，共79页。
5. 宿主菌的选择 表达载体与宿主相互匹配
6. 培养条件优化
5’-UAAGGAGG-3’ > 5’-AAGGA-3’
③ SD序列后面的4个碱基
5’-AGGAGGU-3’ ？？？？
如果是A（T），翻译效率最高； 如果是G（C），效率只有50%或25%。
第22页，共79页。
（2）起始密码AUG
AUG左侧的三个碱基也有影响 -半乳糖苷酶的mRNA中：
AUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有 效；
（1）培养基
（2）环境因素 （3）诱导时间和剂量
第32页，共79页。
七、原核细胞表达的缺陷
1、缺乏翻译后蛋白质的加工修饰系统， 如糖基化、氨基酸修饰等。
2、原核表达外源蛋白常以包涵体形式存 在，必须经过变性、复性处理才能获 得有生物活性的蛋白，并且其表达量 非常低。
第33页，共79页。
七、原核细胞表达的缺陷
肠杆菌最有效的翻译终止序列。
（3）密码子的选择 ① 受体菌中共表达稀有密码子tRNA基因 ② 将稀有密码子改为偏爱密码子
第28页，共79页。
3. 提高目的产物稳定性 防止被宿主的酶降解。
（1）表达分泌蛋白
外膜 内膜
细胞质
染色体
周间质
质粒
“外排”：蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。 “分泌”：蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。
基因表达系统及技术
基因表达系统的研究意义
理解生命活动的基本原理 揭示疾病的发生和发展机制 提供新的药物靶点和治疗策略 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ动生物技术的发展和应用
基因表达系统的组成
转录因子
转录因子通过与DN结合调控 基因的转录过程
转录因子是基因表达调控的 重要因素
转录因子可以分为激活因子 和抑制因子
转录因子的种类和数量众多 具有不同的功能和作用
技术： CRISPR/Cs9、 TLEN、ZFN等
优势：高效、精 确、可重复性强
基因敲入技术
原理：通过基因编辑技术将目的基因插入到宿主细胞中实现基因表达 应用：基因治疗、基因工程、生物制药等领域 技术类型：ZFN、TLEN、CRISPR等 优点：高效、精确、可重复性高
基因编辑技术
基因编辑技术：CRISPR/Cs9技术 原理：利用Cs9蛋白对DN进行切割和编辑 应用：基因治疗、基因工程、农业育种等领域 优点：高效、精确、成本低 挑战：伦理问题、安全性问题、技术难题等
基因表达系统及技术
汇报人：
单击输入目录标题 基因表达系统概述 基因表达系统的组成 基因表达调控机制 基因表达技术及应用 基因表达系统研究展望
添加章节标题
基因表达系统概述
基因表达系统的定义
基因表达系统是指在生物体内基因通过转录和翻译过程将遗传信息 转化为蛋白质的过程。
基因表达系统包括转录和翻译两个阶段其中转录是指DN被复制为 RN的过程翻译是指RN被翻译为蛋白质的过程。
转录起始复合物
核心成分：RN聚合酶II、TFII、TFIIB、TFIIE、TFIIF、TFIIH 功能：启动基因转录 结构：由多个亚基组成包括核心酶、通用转录因子和特异性转录因子 作用机制：通过与DN结合形成转录起始复合物启动基因转录
基因的克隆与表达课件
----TAC -----TTG GAC CTT AAG GAT CCA---
DNA序列
AAT CGG AAG AAT TCA GAC CTA GGT TTA GCC TTC TTA AGT CTG GCT CCA
基因的克隆与表达课件
位相载体----含有3种读码框的系列载体
基因的克隆与表达课件
优点： • 表达效率高 • 产物稳定 • 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可
➢基因克隆(gene cloning) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
基因的克隆与表达课件
基因克 隆 Gene Cloning
基因的克隆与表达课件
➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程
基因的克隆与表达课件
一、概述
• 确定了遗传信息的携带者，即基因的盆 子载体是DNA而不是蛋白质
基因的克隆与表达课件
（二）体外重组 连接体系的建立： • 温度：粘末端连接：12-18℃
平末端连接：室温（低于30℃) • DNA量：载体分子数/目的基因分子数
=1：1-3 • 酶量：平端连接时需加大酶量
基因的克隆与表达课件
（三）转化—Cacl2法、电击法
（四）重组子的筛选及鉴定
1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）
基因的克隆与表达课件
二．原核生物基因结构和表达特点
基因的克隆与表达课件
• 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
• 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
基因的克隆与表达课件
3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
克隆表达与蛋白质纯化技术
克隆表达与蛋白质纯化技术在生物科学研究领域中，克隆表达与蛋白质纯化技术被广泛应用于蛋白质的生产和研究。
克隆表达是指利用重组DNA技术将目标基因导入宿主细胞，并使其在宿主细胞中表达出来。
蛋白质纯化则是指从克隆表达的细胞中提取和纯化目标蛋白质。
本文将介绍克隆表达与蛋白质纯化技术的基本原理和常用方法。
一、克隆表达技术克隆表达是将感兴趣的基因克隆到表达载体中，通过转染或转化的方式导入细胞中，从而使该基因在细胞内得以表达。
克隆表达技术可分为原核细胞系统和真核细胞系统两类。
1. 原核细胞系统原核细胞系统中，常用的宿主细胞包括大肠杆菌和酵母菌。
在克隆表达中，大肠杆菌是最常用的宿主细胞，其原因在于其繁殖速度快、易于培养和转化、表达效率高等优点。
酵母菌则常用于表达更复杂的蛋白质，因其能够进行糖基化等真核细胞系特有的修饰。
2. 真核细胞系统真核细胞系统中，常用的宿主细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞和植物细胞等。
哺乳动物细胞系统具有许多优点，如蛋白质修饰和折叠更接近自然情况、大容量表达等，然而其表达成本较高。
昆虫细胞和植物细胞则在表达规模较大的蛋白质时较为常用。
二、蛋白质纯化技术蛋白质纯化是将表达系统中产生的混合蛋白质与其他组分分离的过程，常用的方法有离子交换色谱、亲和层析、凝胶过滤、透析等。
1. 离子交换色谱离子交换色谱是根据蛋白质在离子交换柱中与其反离子交换作用力的不同而进行分离纯化的方法。
常用的离子交换介质有阴离子交换柱和阳离子交换柱。
对于不同电荷性质的蛋白质，可以选择合适的离子交换柱实现分离纯化。
2. 亲和层析亲和层析是利用相互作用力将目标蛋白质与其他组分分离的方法。
常见的亲和层析方法包括金属亲和层析、抗体亲和层析等。
通过对目标蛋白质与特定亲和剂的亲和力进行结合，实现其与其他蛋白质的分离。
3. 凝胶过滤凝胶过滤是利用凝胶材料的大小选择性分离蛋白质的方法。
将混合蛋白溶液经过凝胶柱时，大分子量的蛋白质会被阻滞在柱内，而小分子量的蛋白质则可以通过柱床。
几种表达系统的比较
几种表达系统的比较生物技术通报・综述与专论・BIOTECHNOLOGY BULLETIN2002年第2期几种表达系统的比较吴丹仇华吉童光志(中国农科院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,哈尔滨150001) 摘要: 随着蛋白质工程和DNA重组技术的发展,许多有应用潜力的蛋白分子有待开发。
不同蛋白在不同系统中表达水平有显著差异,所以选择一种合适的表达系统对蛋白表达水平非常关键。
对细菌、酵母、昆虫杆状病毒、哺乳动物细胞4种表达体系作一概述,并讨论各自优缺点及常见问题。
关键词: 表达系统大肠杆菌酵母昆虫细胞哺乳动物细胞ComparisonofSeveralExpressionSystemsWuDan QiuHuaji TongGuangzhi(NationalKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnologynVeteriResearchInstitute ChineseAcademyofAgricultSciencesAbstract: Withthedevelopmentofrecombinant,manytypesofproteinthathavepotential valuesneedtobeproduced.expressonlevelsamongdifferentproteinex2pressio nsystems.Soit’scriticaltosystemforproteinproduction.Thisreviewwillsum2m arizetheadvantagesand,insectandmammalianexpressionsystems,andalsodis cussthesolutionstoKeywords Ecoli Yeast Insectcells Mammaliancells 随着生物化学和分子生物学技术的发展,使人们得以更深入地了解蛋白质分子的一级和二级结构,这样就可以有目的的进行改造,创建新的有价值的蛋白质分子。
绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆及表达
绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆及表达摘要绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
采用PCR技术，对实验室提供的质粒pEGFP-N1中的目的基因进行扩增。
所得PCR产物和质粒pET-28b经过BamH I和Nde I双酶切后，用琼脂糖凝胶电泳法检测酶切产物的酶切情况并回收凝胶，再利用T4DNA连接酶将目的基因与载体连接起来，得到重组质粒。
将重组质粒导入克隆菌E. coli DH5a中培养扩增，提取阳性菌落质粒进行重组子鉴定，进而导入表达菌E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中，经IPTG诱导目的基因表达产生绿色荧光蛋白。
关键词：绿色荧光蛋白 PCR 基因克隆表达1.前言1.1绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光[1]。
1.2 GFP 的结构GFP中央是一个圆柱形水桶样结构，如图二。
长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-GLy自身环化和氧化形成。
1.3 GFP的研究应用GFP可标记细胞和蛋白质，具有广泛的应用前景。
GFP及其突变体已被广泛应用于基因表达调控、蛋白质空间定位、生物分子之间相互作用、转基因动物]2[等方面。
基于新型功能荧光蛋白的光学分子成像技术的发展，为在活细胞乃至活体动物内研究基因表达和蛋白质功能提供了更多的选择空间。
GFP还用于观察微生物、发育机理研究、细胞筛选、免疫学等方面。
本实验是利用实验室提供的质粒pEGFP-N1,其结构如图三所示。
其上有所用酶的酶切位点。
基因克隆主要载体系统
低分子量的质粒易于操作，克隆外源片断后 仍能有效的转化给受体细胞,同时低分子量的质粒 对限制酶具有多重识别位点的几率也较低；较高 的拷贝数可获得大量的克隆基因
a
11
(三)质粒载体的选择记号
新陈代谢特性； 对大肠杆菌素E1的免疫性； 抗菌素抗性； 四环素抗性、氨苄青霉素抗性、 链霉素抗性、卡那霉素抗性 大多数质粒本身带有抗菌素基因； 抗菌素抗性记号便于操作、易于选择。
a
8
a
9
(一) 质粒载体
质粒载体包括以下两种： 1.克隆的质粒载体
允许外源的DNA插入，储存。主要是 DNA水平上的操作。 2.基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、储存和表达。
a
10
(二) 质粒载体必须具备的基本条件
(1) 具有复制起点； 自我增值的基本条件，一般具一个复制子。
(2) 具有抗菌素抗性； 理想的质粒载体具有两种抗菌素抗性基因。
具尾部结构的二十面体型、 线状体型 核酸类型：最常见的是双链线性DNA、双链环形 DNA、 单链环形DNA、单链线形DNA、单链RNA。
a
17
噬菌体的溶菌生命周期
噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期
只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。 烈性噬菌体溶菌生长的基本过程： 1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
基因克隆主要载体系统
克隆载体与表达载体
分类
结构组成及表达兀件
特点或优点
备注
质 粒 表 达 载 体
原核表达载 体
1启动子、
2转录终止子（防止克隆的外源基因表达干
扰载体的稳定性）
（1）基因组大小；去除非必需区，建立 外源DNA片段的克隆或替换位点（2） 在DNA的非必需区插入选择标记：lacZ基因；基因cl失活（cl基因：溶源 过程控制基因）；Spi筛选（野生型人 噬菌体在带有P2原噬菌体的溶源性E.coli中的生长会受到限制的表型， 称作Spi+，即对P2噬菌体的干扰敏 感）
YAC的构建有比在细菌中克隆的一些优点，因为某些真核 细胞的序列，特别是重复序列是难以甚至不可能在细菌中 繁殖的，酵母细胞却具有这样的能力
5
色
体
细菌人工染色体 载体
BAC
是基于大肠杆菌 的F质粒构建 的，高通量低拷 贝的质粒载体
每个环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标 记，一个来源于大肠杆菌F因子（致育因子） 的严谨型控制的复制子oriS（Shizuya et al.
主要使用EcoR I
ColEl
天然质粒，属松弛型多拷贝型
6.3 kb
大肠杆菌素（colicin） E1和对E1免疫的 基因（immE1）
EcoR I位于E1内部，插入外源DNA会导致E1失活，使受体菌不能合成E1 （ColE1-），但仍然 表现出对E1免疫型（皿1^1+）
pBR322
兀件来源①复制起点orip
酵母人工染 色体载体YAC细菌人工染 色体载体BAC
P1噬菌体人 工染色体载 体PAC
质粒载体总结
质 粒 载 体
类型
长度
选择标记
克隆位点
pSC101
《分子生物学》复习指南
《分子生物学》复习指南《分子生物学》复习指南答案一、名解1、基因：是含有生物信息的DNA片段，根据这些生物信息可以编码具有生物功能的产物，包括RNA和多肽链。
(课件)2、分子伴侣(Molecular Chaperone)：又称为伴侣蛋白，是一类在序列上没有相关性但有共同功能的保守性蛋白质，在细胞内协助其它多肽结构完成正确的折叠、组装、转运和降解，在功能完成后与之分离，不构成这些蛋白质结构执行功能时的组份。
3、RFLP：即限制性片段长度多态性。
高度重复序列中的无间隔反向重复序列很容易形成限制性内切酶识别位点，也很容易由于突变产生或失去一个酶切位点，因而可以造成限制性片段长度多态性。
即用同一种限制性内切酶消化不同个体的同一段DNA时，由于碱基组成的变化而改变限制性内切酶识别位点，从而会产生长度不同的DNA片段，这种方法称为限制性片段长度多态性，简称RFLP技术。
4、DNA的复制（replication）：以构成基因组的全套核酸分子为模板，精确合成一套新的核酸分子的过程。
遗传信息通过亲代DNA 分子的复制传递给子代，在保持生物物种遗传的稳定性方面起着重要的作用。
5、反转录：又称逆转录（reverse transcription），是以RNA为模板，在逆转录酶的催化下，合成双链DNA的反应。
6、克隆载体：可携带插入的外源DNA片段并可转入受体细胞中大量扩增的DNA分子。
该分子中含有能够在受体细胞中自主复制的序列和筛选标记，常用于外源基因的克隆，如噬菌体或质粒。
7、功能基因组：细胞内所有具有生物学功能的基因。
表达一定功能的全部基因所组成的DNA序列，包括编码基因和调控基因。
8、核不均一RNA：即hnRNA,即前体mRNA，在真核生物中，最初转录生成的RNA,存在于真核生物细胞核中的不稳定、大小不均的一组高分子RNA之总称。
由外显子和内显子组成，需经过剪接加工及各种修饰后，形成成熟的mRNA。
9、分子杂交：由来源不同的两个脱氧核糖核酸单链或核糖核酸单链结合成双链分子的过程。
植物光合作用相关基因的克隆与表达
植物光合作用相关基因的克隆与表达植物光合作用是指在光的作用下，植物体内的叶绿素吸收光能，将其转化成化学能，从而产生能量和氧气的过程。
植物光合作用是生命的基础能量来源之一，也是维持生态系统平衡的重要过程。
植物光合作用的相关基因克隆和表达，是近年来植物学研究的热点之一。
这一研究方向主要集中在植物光合作用的细胞生物学、分子生物学和基因组学等方面。
细胞生物学角度，植物体内的光合细胞有两种类型：一种是负责光合作用的叶绿体细胞，另一种是负责运输产物的质体细胞。
这两种细胞在外形和功能上有所不同，其内部的基因表达和调控也存在差异。
因此，研究植物光合作用相关基因的克隆和表达，需要从细胞类型的角度进行分析。
分子生物学角度，植物光合作用相关基因的克隆和表达研究，主要探索基因的结构、功能和调控等方面。
例如，利用PCR技术和基因克隆技术，可以获得植物体内的光合作用相关基因，然后通过生物信息学工具对基因序列、编码蛋白质和表达谱进行分析。
另外，还可以应用转基因技术构建基因敲除或添加的重组植物株系，进一步揭示光合作用相关基因在植物体内的作用和机理。
基因组学角度，随着高通量测序技术的发展和基因组数据的丰富，研究人员可以在全局范围内分析植物光合作用相关基因的基因组学特征、进化关系和功能注释。
例如，通过对一些重要植物基因的全基因组序列比较，可以发现在多个物种中保守的部位和变异的部位，进而获得这些基因在植物演化中的起源和分化过程。
此外，研究人员也可以利用系统生物学的方法，将各个基因的作用和调控网络进行拼凑和模拟，从而模拟出更加细致的植物光合作用模型。
总之，植物光合作用相关基因的克隆和表达研究，对于理解植物生物学和解决环境保护和农业生产中的问题，具有重要意义。
希望未来能够有更多的研究成果和创新突破。
基因克隆主要载体系统
SV40病毒
SV40病毒，环状DNA，外壳蛋白由VP1、VP2、VP3 构成。 受纳细胞（permissive cell， 也称允许细胞 ）： 能使细胞裂解释放感染性病毒颗粒。 非受纳细胞（non permissive cell）：不产生 感染性病毒颗粒，但能整合到细胞染色体中产生 癌变。 基因结构:
3 、载体的共同特征（或应具备的条 件）：
①自主复制
②易于扩增分离纯化
③有单一酶切位点（多克隆位点） 单一酶切位点：一种酶在一个载体上只有一个酶切 位点 多克隆位点：一个载体上的某一个区域含有多个单 一酶切位点 ④有选择标记基因 ⑤表达载体还应有表达调控元件（启动子、增强子、 终止子,SD序列） ⑥具有较好的安全性，避免基因的非控制扩散
5.其他载体
（1）酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome, YAC） （2）细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC） （3）动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒、 腺病毒相关病毒、逆转录病毒）
三 真核细胞的克隆载体
二、植物表达载体
多数植物表达载体是质粒载体
最经典的植物表达载体是pBI121
植物表达载体与克隆质粒载体一样, 可以 克隆基因, 但还具备表达所克隆的基因的 特性
(15kb)
三、动物细胞基因克隆的载体
㈠SV40病毒 ㈡SV40病毒载体
(1)取代型重组病毒载体 ①晚期区段取代载体 ②早期区段取代载体 (2)重组的病毒-质粒载体
附加体型载体（YEP）
YEP型载体一般由大肠杆菌质粒、2µm质粒以及酵母染色 体的选择标记构成。 2µm质粒含有自主复制起始区（Ori）和STB区,STB序列 能够使质粒在供体细胞中维持稳定。利用2µm质粒，人们 已经构建出许多YEP型载体。 YEP型载体PYF92就是由酵母的2µm质粒、pBR322质粒 和酵母的His3+(组氨酸)基因构成的。 YEP型载体对酵母具有很高的转化活性，一般为103-105 转化子/微克DNA。比YRP型载体更稳定，拷贝数也高 （25-100个/细胞），是基因克隆中的常用载体。
克隆载体的名词解释
克隆载体的名词解释克隆载体是分子生物学实验中常用的工具，用于携带并负载外源DNA片段，以实现基因克隆和基因工程。
克隆载体可由天然或人工合成的DNA构建而成，广泛用于基础研究、基因表达、基因治疗等领域。
本文将从克隆载体的定义、组成结构、常见类型以及应用等方面对其进行解释。
一、克隆载体的定义克隆载体是指用于将目标外源DNA导入到宿主细胞或有机体中，并在其中进行自主复制、表达和传递的DNA分子。
克隆载体具有一系列特定的序列和功能元件，包括起始子、终止子、选择标记、荧光蛋白等，以确保成功实现目标DNA的克隆和表达。
二、克隆载体的组成结构克隆载体通常由一个或多个元件组成，包括DNA序列、选择标记、表达载体以及复制起源，具体结构如下：1. DNA序列：克隆载体内含有目标外源DNA的序列，其大小和类型因实验需求而异。
DNA序列通常具有特定的限制性内切酶切位点，以便于将外源DNA片段定向插入到载体中的特定位置。
2. 选择标记：为了筛选成功克隆和转入宿主细胞的载体，克隆载体通常携带有选择标记基因，如抗生素抗性基因或荧光蛋白基因。
这些标记基因在宿主细胞中可以提供对抗生素的耐药性或特定荧光表达，从而方便筛选出含有目标外源DNA的成功克隆载体。
3. 表达载体：对于需要进行表达的克隆载体，其内部还包含有启动子、终止子以及表达宿主基因的相关元件。
这些元件协同作用，使得克隆载体能够在宿主细胞中进行基因的转录和翻译，从而实现目标基因的表达。
4. 复制起源：为了保证克隆载体能够在宿主细胞中独立复制，克隆载体通常还含有复制起源序列。
复制起源序列可以与宿主细胞的复制系统相互配合，使得克隆载体能够被复制并遗传到下一代细胞中。
三、克隆载体的常见类型克隆载体具有多种类型，根据其应用和特性的不同，常见的克隆载体包括质粒、噬菌体、合成DNA以及病毒载体等。
1. 质粒（Plasmid）：质粒是环状的双链DNA分子，常见于细菌和真核生物中。
质粒通常具有小分子大小（约1-10 kb），较容易复制和操纵。
克隆载体与表达载体
克隆载体
基因间隔区（intergenic region, IG 区）基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区，内含有复制起始位点，是实施改造、构建人工载体的重点区域。
② IG区内只有一个Bsu I 切点。
（2）加入酶切位点，在IG区内加入单一内切酶位点。
M13mp1 在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ’（-肽序列)。
使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外，M13重组分子筛选简便，被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。
而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有 kb
考斯质粒是一类人工构建的含有λ-DNA cos序列和质粒复制子的的特殊类型载体。
能像
-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞；能像质粒那样在受体细胞中自主复制具有较高容量的克隆能力：45kb；具有与同源性序列的质粒进行重组的能力粘粒（cosmid）是带有 cos 序列的质粒。
cos序列是噬菌体 DNA 中将DNA 包装到噬菌体颗粒中所需的 DNA 序列。
黏粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（amp r），cos 位点，因而能象质粒一样转化和增殖。
克隆的最大 DNA 片段可达 45kb 。
有的粘粒载体含有两个cos 位点，在某种程度上可提高使用效率。
质粒载体总结
λ噬菌体载体
表达载体。
克隆载体与表达载体介绍
（二）质粒载体的构建
天然质粒载体不易直接作为克隆载体，需要改造：
（1）选择合适的复制起始位点，松散型质粒复制起始位点； （2）加入合适的选择标记基因，主要有LacZ基因和抗生素抗性基因； （3）增加或减少酶切位点，组装多个单一的限制酶切位点即多克隆位点
（MCS); （4）缩短长度，通常重组DNA分子越小，转化效率越高。
（三）常用的质粒载体
1. pBR322质粒载体
2. pUC18和pUC19质粒载体
3. TA载体
二、噬菌体载体
（一） λ 噬菌体载体 1 λ 噬菌体的性质
λ噬菌体Βιβλιοθήκη 外壳蛋白 线性，全长48502bp
λDNA 5’端含12bp的黏性末端
2 λ 噬菌体的构建 构建λ 噬菌体的依据：
a.λ 噬菌体能够包装原λDNA长度的75%－105%的DNA片段 （36.4~51kb） b.有20kb的区域对λ噬菌体生长非必需。
该λ 噬菌体载体的最大装载容量为: 4.9+5.5+2.6+(51-48.5)=15.5kb
2.6kb
3 代表性λ 噬菌体
(1) 插入型载体
装载容量为：0-10.18kb
(2) 置换型噬菌体载体载体 克隆外源DNA片段范围为：9-23kb
（二） M13 噬菌体载体
1.M13噬菌体的增值
M13噬菌体是单链丝状噬菌体； 长6407bp， 507bp基因间隔区，含复制起始位点，同时可用于改造； M13 DNA在宿主细胞中以双链或单链形式存在，但释放到细胞外的 M13 噬菌体颗粒以单链形式存在。
2.M13噬菌体载体 1) 插入选择标记基因； 2) 组装合适的多克隆位点。
三、噬菌体-质粒杂合载体
2第二章基因克隆载体的种类和特性 (1)
检测性标记基因。有的基因是不能用作选择性标记基因（lacZ等）。
2、 标记基因的种类
1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子）
主要是抗生素抗性基因: Ampr ，Tetr ， Cmlr，Kanr，Strr 2）生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应， 如lacZ
• 除了酵母的杀伤质粒(Killer plasmid)是RNA质粒外，所
有的质粒都是DNA质粒。关于质粒DNA的大小,
文献中有多种说法： 小的仅有103KD，仅能编码2-3种蛋白质； 大的可达105KD，两者相差上百倍。 1Kb～200Kb (Sambrok et al.) 5Kb～400Kb (Lehninger) MD(megadaltons)=106D (兆道尔顿)
2、质粒的相容性和不相容性(又称为亲和性与不亲和性)
①：在同一时间内从一个细胞中发现多个不同类型的质粒 ，只有当 不同的质粒是相容的时才能存在于同一个细胞中； ②：质粒的不相容性是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密 切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞中稳定共存的现象。不相容 的质粒一般都利用同一复制系统，拷贝多的复制更快，结果在细菌 繁殖几代之后，细菌的子细胞中绝大多数都含有占优势的质粒 。 ③：注意：只有当有确切的证据表明第二种B质粒已经进入含有A质 粒的寄主细胞，而且它的DNA不受寄主细胞限制体系的降解作用， 但这两种质粒却不能长期共存，只有在这种情况下，我们才能说A 和B是不亲和的质粒。 ④：不亲和群的概念： 彼此之间互不相容的质粒，属于同一不亲和群(incompatibility group)。彼此能够共存的质粒则属于不同的不亲和群。同一不亲和 群的质粒在亲缘关系上则比较接近。
严紧型复制控制的质粒（stringent plasmid）：质粒的复制
第四章克隆载体的特征及类型
内，插入外源片段不影响质粒的复制功能。 5. 能够导入寄主细胞，具备转化的功能。 6. 操作简单方便，可根据需要加装其它元件，构建不同用途的质
粒载体。
质粒人工构建的目的
天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点 少、遗传标记不理想等缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必 须对之进行改造构建： （1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择 （2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组 （3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量 （4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝 （5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件
质粒的构建
质粒
天然存在的两种质粒 colE1宿主细菌大肠杆菌，6.5kb，松弛型复制20-
30/cell
pSC101宿主细菌沙门氏菌，8.8kb，严谨型复制5/cell ，标记基因为Tcr
理想的质粒载体应具备的条件
1. 分子量较小。 2. 松驰型，在受体细胞中有较多的拷贝数。 3. 具有一个以上的选择标记基因，形成重组质粒后，至少还要有
黏性末端
cos
DNA合成控制基因
阻遏基因 早期控制基因
l - DNA
阻遏基因
重组基因
删除与整合基因
COS
3’
5’ TCCAGCGGCGGGG
头部合成基因
尾部合成基因
CCCGCCGCTGGA 5’
3’
COS
噬菌体或病毒DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体DNA
l 噬菌体生物学特性： 感染周期
E.coli
裂解
优点： 分子量小：4363bp, 容易纯化。 含有2个抗生素抗性基因Ampr和Terr，可以作为选择标记。而 且每一个标记基因都含有单一的酶切位点，可以插入DNA，
基因工程中的基因克隆与表达
基因工程中的基因克隆与表达基因工程是一门涉及分子生物学、遗传学、生物化学等多个学科的综合性科学。
其中，基因克隆和基因表达是基因工程研究的两个重要方面。
本文将就基因克隆和基因表达的原理、方法及应用进行探讨。
一、基因克隆1.原理基因克隆是指将目标基因从其天然基因组或其他来源中分离出来，并将其插入到另一个载体（如质粒）中，使其能够在宿主细胞内复制和表达。
基因克隆的原理是基于DNA序列特异性杂交的方法，利用限制性内切酶切割目标DNA和载体DNA，然后将它们黏合在一起，形成重组DNA。
通过转形或感染，使重组DNA 进入宿主细胞内，并复制和表达。
2.方法基因克隆的方法主要有限制性酶切与黏合（RE-Mediated Ligation）、PCR（聚合酶链反应）、TA克隆和基因文库等。
限制性酶切与黏合是一种常用的基因克隆方法。
该方法利用限制性内切酶切割DNA，然后通过T4 DNA连接酶黏合在一起。
这种方法操作简单、效率高，但存在限制内切酶的局限性，无法应用于不同酶切位点的DNA。
PCR是用于复制DNA片段的重要方法，也可以用于基因克隆。
PCR方法可以在不使用限制酶的情况下，从任何源提取DNA片段，扩增需要的基因段，并使用酶切和连接技术插入到载体中。
TA克隆是指用于从PCR产物中克隆DNA的一种方法。
该方法利用了Taq聚合酶不完全特异性合成3'-末端斜伸的性质，使产生的末端序列与T自带的A进行互补配对，从而使PCR产物能够被直接连接到TA克隆载体上。
基因文库是一种重要的基因克隆技术，可以将许多目标基因同时克隆入同一载体中。
基因文库分为cDNA文库和基因组文库。
通过荧光筛选或选择性培养，可以从文库中筛选出感兴趣的基因。
3.应用基因克隆技术广泛应用于基因工程、疫苗制备、药物研发、作物改良、动物遗传改良、环境污染治理等领域。
例如，利用基因克隆技术可以创造出超级细菌、工业用酶、新型药物、高产优质作物等。
二、基因表达1.原理基因表达是指基因通过转录和翻译的过程，将DNA序列转化为蛋白质的过程。
抗草甘膦基因的克隆及在原核表达系统中的功能分析
ｏ ｉ ｘ ｒ ｓｉ ｎｖ ｃｏ ｐ ｔｃｅ ｐ ｅｓｏ ｅ ｔ ｒ（ ＥＴ－ ）ｗａ ｒ ｎ ｆ ｒ ｔ ｄ ｉｔ ． ｃ ｌ ＢＬ２ （ Ｇ６ ｓｔａ ｓｏ ｍａｅ ｎ ｏ Ｅ ｏｉ １ ＤＥ３ ）．Ａ ｕ ｉｎ ｐ ｏ ｅｎ ｏ ｂ ｕ ６ｋ ｆ ｓｏ ｒ ｔｉ ｆａ ｏ ｔ４ ｕ
草甘膦 的抑制 。本研 究结果表 明 克隆到 的 Ｇ ６基 因具有 一定 的抗 草甘 膦 活性， 对抗 草甘膦 作物 的培 育具 有 实践
意 义。
关键词
抗 草 甘 膦 ； １Ｓｒ Ｎ 克 隆 ； 原 核 表 达 ６ Ｄ Ａ； 文 献 标 识 码 ： Ａ Ｄ ： １ ．９ ９ ｊｉ ｎ ０ ２ —１４ ． ０ ２ ０ ．０ ＯＩ ０ ３ ６ ／．ｓ ． ５ ９ ５ ２ ２ １． ３０ ２ ｓ
２ ．河 南 农 业 大 学 植 物 保 护 学 院 ，郑 州 ４ ００ ） ５ ０ ２
３０ ５ ； １ ０ ８
摘要
为了克隆抗草甘膦基 因并在原核表达 系统 中分析其抗性 水平 ， 利用 ２０／ ｌＩ草甘膦平板从草甘膦严重污 ０ ｚ ／ ｍｏ
染的土壤 中筛选到 １株抗草甘膦菌株 Ｇ６ Ｐ 经电镜 和 １Ｓｒ ＮＡ鉴定为恶 臭假单胞茵 ； Ｐ ， ６ Ｄ 以该 菌株基 因组 ＤＮ 为模 Ａ 板， 通过 Ｐ Ｒ方 法扩增 出 ５烯醇丙酮莽草酸一一 Ｃ 一 ３磷酸 酯合成酶 （ Ｐ Ｐ ） 因， Ｅ ｓ Ｓ基 该基 因编码 ４ ０个氨基酸 ， ４ 亚克隆到原 核表达载体 ｐ Ｅ －８ Ｅ Ｔ ２ ａ中构建原核表达 载体 ｐ Ｔ Ｇ６ 将 重组表 达 载体转化 大肠杆 菌 Ｂ ２ Ｄ ３ 中， ＩＴ Ｅ－ ； Ｌ １（ Ｅ ） 经 Ｐ Ｇ诱 导， 表达 出 ４ ｕ的融合蛋 白； ６ｋ 携带 ｐ Ｔ Ｇ６质粒的大肠杆菌 Ｂ ２ ＤＥ ） Ｅ － Ｌ １（ ３在液体 Ｍ６ ３培养基 中能耐受 １０￣ ｌＬ ５ ｍｏ／
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
克隆基因的表达： 指的是外源基因在宿主细胞中表达。
外源基因 表达载体
重组载体
导入宿主细胞
提取蛋白
在宿主细胞中 表达出蛋白质
宿主细胞：
原核细胞或真核细胞。
一
、 原核生物 大肠杆菌表达系统
常 见
基因表达 系统
芽孢杆菌表达系统 链霉菌表达系统
表
达
系
酵母表达系统
统
真核生物 丝状真菌表达系统
（2）SD序列与起始密码子之间的距离的影响：
SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA 在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处 于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的 前提条件。
在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约7个碱基 处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会 导致翻译起始效率不同程度的降低。
避免前期表达目的产物对菌株生长的影响； 减少细菌蛋白酶对目标基因产物的降解。
诱导型工作的典型例子： 乳糖操纵子模式
乳糖操纵子：乳糖启动子lac，来自大肠杆菌
用乳糖或其类似物IPTG充当诱导物，与阻遏蛋白 结合，解除抑制。
乳糖启动子Plac的可控性：
加入乳糖类似物： 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 （IPTG）诱导作用
的 类 型
基因表达 昆虫表达系统
系统
哺乳动物细胞表达系统
植物生物反应器
二、表达体系的组成： 表达载体 受体细胞
表达载体的构成
启动子 终止子 核糖体结合位点（SD序
列） 筛选标记 复制子（质粒拷贝数） 多克隆位点
启动子 操纵子 S-D序列 目的基因 终止子
1、启动子
启动子是一段提供RNA聚合酶识别和结合 的DNA序列，位于基因的上游，长度因生物 种类而异，具有如下特征：
周质内含有种类繁多的内毒素。
3、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位
1）. 细胞质中表达 表达蛋白常以包涵体（inclusion body）
形式存在。 包涵体是存在于细胞质中的一种不溶 性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。
形成原理未知。
2）. 在周质（periplasm）中表达
在这 啊！
周质：格兰氏阴性大肠 杆菌位于内膜和外膜之间 的细胞结构部分。
三、大肠杆菌表达系统
1、大肠杆菌表达外源基因的优势： 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架； 基因克隆表达系统成熟、完善； 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定； 被FDA批准为安全的基因工程受体生物。
2、大肠杆菌表达外源基因的劣势：
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能； 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统； 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白；
tac lacP lac O S-D/ATG GST 插入位点 TGA
（1）SD序列与起始密码子之间的序列对表 达的影响：
Ⅰ、SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU， 翻译效率最高；
Ⅱ、碱基若为CCCC或GGGG的翻译效率则分别 是最高值的50%和25%。
Ⅲ、紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有 影响，对于大肠杆菌β-半乳糖苷酶的mRNA而言， 在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如 果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平 低20。
3、核糖体结合位点（ RBS） （ribosome binding site） 也叫SD序列 ：Shine-Dalgarno sequence 是mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列
✓ 即位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列 5’ UAAGGAGG 3’，它通过识别大肠杆菌核糖体小 亚基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与 之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启 动翻译。
序列特异性：具有保守序列筐
位置特性：位于基因的上游或基因内的前端
方性
种属特异性
如常见的启动子：
启动子
PL PrecA PtraA Ptrp Plac Ptac
-35区序列 TTGACA
TTGATA TAGACA TTGACA TTTACA TTGACA
-10区序列 GATACT
TATAAT TAATGT TTAACT TATAAT TATAAT
蛋白质从细胞质转运到周质的复 杂机理目前不完全清楚。
优点：容易被浓缩和纯化、有利于正 确折叠、被降解的少。
3）. 胞外表达
使在大肠杆菌细胞中表达 的外源蛋白分泌到细胞外的 培养基中。
通常用溶血素（hemolysin）基因构建分 泌性融合蛋白，或与细菌素释放蛋白 （bacteriocin release protein)共表达。
在这
结构，存于细胞质或细胞周质中，
啊！
无正确的空间构象，一般无生物
活性。
、包涵体表达形式的优点： 外源基因表达产物易于分离纯化； 能在一定程度上保持表达产物的结构稳定； 能表达对宿主有毒或有致死效应的目标蛋白。
、包涵体型蛋白表达形式的缺点：
§、包涵体用变性溶剂溶解、复性后， 不 一定能恢复生物学活性，回收的蛋白
生物活性差 ； §、复性成本较高。
2）、分泌型异源蛋白的表达
分泌异源蛋白通过运输或分泌方式定位于 细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。 蛋白产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分 泌的前提条件。
❖启动子从转录模式上分为：
组成型启动子和诱导型启动子
❖表达系统启动子必须具备的条件：
① 必须是一种强启动子 能使外源基因的蛋白产量达到细胞
总蛋白的10%-30%以上。 ② 应呈现低水平的基础转录
便于表达毒性蛋白等。 ③应是可诱导型的
用温度或化学试剂诱导。
注意 了！
• 表达系统常选用 诱导型 启动子 原因？
3、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位 由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只
能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果 都不太理想。
4、外源基因在大肠杆菌中的表达形态
➢表达蛋白按溶解特性通常包括：不溶性蛋白 和可溶性蛋白两类，具体包括如下几种结构形 态：
包涵体型蛋白
融合型蛋白
分泌型蛋白
1）包涵体型蛋白：
蛋白聚集成致密无膜的裸露
色氨酸启动子Ptrp的可控性
2、终止子
启动子 操纵子 S-D序列 目的基因 终止子
❖作用：防止转录过头。
过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基 因的表达，其原因如下： 转录产物越长，外源基因本身的转录效率下降； 增加工程菌无谓的能量消耗； 影响重组质粒的不稳定性； 过长的转录物往往不能形成理想的二级结构， 从而大大降低基因编码产物的翻译效率