定点突变protocol
stratagene品牌的点突变试剂盒的Protocol
Hieff Clone TM One Step Pcr Cloning Kit一步法（快速/无缝）克隆试剂盒是一款简单、快速、高效的DNA定向克隆产品，该试剂盒可以将PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点，可高效克隆50 bp～10 kp 片段。
将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物5’端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列(15 bp～20 bp)。
将这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合，在重组酶Exnase的催化下，仅需反应30 min即可进行转化，完成定向克隆。
克隆阳性率可达95%以上。
克隆载体酶切产物或PCR产物和插入片段PCR产物可以不进行DNA纯化直接用于重组克隆，极大的简化了实验步骤。
试剂盒中包含有重组反应所需缓冲液和重组酶Exnase，Exnase中添加了独特的重组增强因子，显著提高重组克隆效率，即便使用低效率感受态细胞 (107 cfu/μg)也可实现高效克隆 (100 cfu/ng Vector)，而且Exnase还兼容常规酶切、PCR反应体系。
一步法（快速/无缝）克隆试剂盒可用于快速克隆、高通量克隆、无缝克隆和DNA定点突变。
产品组分运输与保存方法冰袋（wet ice）运输。
产品-20 ºC保存。
实验流程实验流程概览1)线性化克隆载体制备；2)插入片段扩增引物设计；3)插入片段PCR扩增；4)进行重组反应；5)反应产物转化、涂板；6)克隆鉴定。
图一实验流程概览注：插入片段PCR扩增时，引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列 (图中以蓝色和橙色标记)，使得扩增产物5’和3’最末端序列分别和线性化克隆载体两末端序列完全一致。
1.制备线性化克隆载体选择合适的克隆位点，并对克隆载体进行线性化。
推荐您尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆。
当载体克隆位点上下游20 bp区域内GC含量均在40%～60%范围之内时，重组效率将达到最大。
基因定点突变全攻略
基因定点突变全攻略一、定点突变得目得把目得基因上面得一个碱基换成另外一个碱基.二、定点突变得原理定点突变就是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目得DNA片段（可以就是基因组，也可以就是质粒)中引入所需变化（通常就是表征有利方向得变化）,包括碱基得添加、删除、点突变等。
定点突变能迅速、高效得提高DNA所表达得目得蛋白得性状及表征，就是基因研究工作中一种非常有用得手段。
体外定点突变技术就是研究蛋白质结构与功能之间得复杂关系得有力工具，也就是实验室中改造/优化基因常用得手段。
蛋白质得结构决定其功能,二者之间得关系就是蛋白质组研究得重点之一。
对某个已知基因得特定碱基进行定点改变、缺失或者插入,可以改变对应得氨基酸序列与蛋白质结构，对突变基因得表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构与功能得关系,探讨蛋白质得结构/结构域。
而利用定点突变技术改造基因：比如野生型得绿色荧光蛋白（wtGFP)就是在紫外光激发下能够发出微弱得绿色荧光,经过对其发光结构域得特定氨基酸定点改造,现在得GFＰ能在可见光得波长范围被激发（吸收区红移),而且发光强度比原来强上百倍,甚至还出现了黄色荧光蛋白,蓝色荧光蛋白等等。
定点突变技术得潜在应用领域很广,比如研究蛋白质相互作用位点得结构、改造酶得不同活性或者动力学特性,改造启动子或者DNＡ作用元件,提高蛋白得抗原性或者就是稳定性、活性、研究蛋白得晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面．通过设计引物,并利用ＰCR将模板扩增出来,然后去掉模板，剩下来得就就是我们得PCR 产物,在PCＲ产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆，再测序确定就行了．三、引物设计原则引物设计得一般原则不再重复.突变引物设计得特殊原则:(1）通常引物长度为2５~４5 bp,我们建议引物长度为3０~35 bp。
一般都就是以要突变得碱基为中心,加上两边得一段序列,两边长度至少为1１—12 bｐ。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要１1-1２个ｂp才能与模板搭上,而这种突变ＰＣR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补得引物。
定点突变技术——从单点突变到多点突变
定点突变技术——从单点突变到多点突变体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。
蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。
对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于我们了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。
而利用定点突变技术改造基因，相信大家也非常熟悉：比如野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。
定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。
对于单点突变，Stratagene公司的QuikChange Site-directed Mutagenesis kit是不错的选择，通过巧妙设计，将质粒定点突变技术变得简单有效。
准备突变的质粒必须是从常规E.coli中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。
设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。
)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。
DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。
定点突变
1.1.1 基因定点突变简介（INTRODUCTION ）定点突变（site-directed mutagenesis ）是指通过聚合酶链式反应（PCR ）等方法向目的DNA 片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变（单点/多点）等。
定点突变能迅速、高效的提高DNA 所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
原理上分两种：1. 搭桥法（重叠PCR ）2. 一步法（全质粒PCR ） ► 搭桥法（重叠PCR ）定点突变搭桥法共需要两对引物（两端引物，中间引物）,三次PCR ，其中前两次PCR 可同时完成，原理如图一所示：两次PCR 的产物回收，作为模板加上两端引物primer F 和primer R 进行PCR3。
PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增实验步骤（PROCEDURE ）1. 两对引物的Tm 值都应相当。
两端PCR 引物参照普通引物设计并无特殊要求。
所需引入突变包含在中间引物互补区域内 （需要在两条引物上均引入点突变），请勿将突变位点置于引物3’ 末端且突变位点距离3’ 端最少要有15个碱基，因为有非匹配碱基的存在，太短会导致引物与模板无法结合。
2. 对于一对中间引物的设计，如左图所示（高亮处是突变碱基），两引物间可以是完全互补，也可是部分互补。
但两引物间互补部分的Tm 值不能太低（太低导致PCR3无法配对延伸）。
搭桥法定点突变一对中间位置的点突变引物设计 3.PCR ：PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增；PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增。
两次PCR 的产物回收，作为模板加上两端引物primer F 和primer R 进行PCR3。
（注意前两次不能使用taq 聚合酶，因为taq 在产物3’ 端多加一个A ，导致后续的PCR3出现移码突变）4. 克隆：回收PCR3产物，酶切，连接，转化。
定点突变
1.1.1基因定点突变简介（INTRODUCTION）定点突变（site-directed mutagenesis）是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变（单点/多点）等。
定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
原理上分两种：1. 搭桥法（重叠PCR）2. 一步法（全质粒PCR）►搭桥法（重叠PCR）定点突变搭桥法共需要两对引物（两端引物，中间引物）,三次PCR，其中前两次PCR可同时完成，原理如图一所示：两次PCR的产物回收，作为模板加上两端引物primer F和primer R 进行PCR3。
搭桥法定点突变PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增实验步骤（PROCEDURE）1.两对引物的Tm值都应相当。
两端PCR引物参照普通引物设计并无特殊要求。
所需引入突变包含在中间引物互补区域内（需要在两条引物上均引入点突变），请勿将突变位点置于引物3’ 末端且突变位点距离3’ 端最少要有15个碱基，因为有非匹配碱基的存在，太短会导致引物与模板无法结合。
2.对于一对中间引物的设计，如左图所示（高亮处是突变碱基），两引物间可以是完全互补，也可是部分互补。
但两引物间互补部分的Tm值不能太低（太低导致PCR3无法配对延伸）。
5’-NNNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’完全互补5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNN-5’部分互补5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNNNNNNNNNNNNNNT-5’部分互补一对中间位置的点突变引物设计3.PCR：PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增；PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增。
基因定点突变
基因定点突变一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
二、定点突变的原理通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。
三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复。
突变引物设计的特殊原则：（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。
一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。
（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。
（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。
（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
（5）最好使用经过纯化的引物。
Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。
四、引物设计实例以G CG→A CG为例：5’-CCTCCTTCAGTATGTAG G CGACTTACTTATTGCGG-3’（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。
Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC-3’Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG-3’（2）引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。
Site-Directed Mutagenesis基因定点突变step by step protocol
Site-Directed Mutagenesis本贴先讲最简单的一个点的定点突变技术，其它较长片段的突变，删除，插入技术以后会慢慢奉上：在做实验之前，我们首先要搞清楚实验的目的和实验的原理。
实验的目的应该比较明确吧：就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做：第一：我们吊出来的基因有点突变，相信这可能是大家经常会遇到的问题。
基因好不容易吊出来，并装进了自己的载体，却发现有一两个碱基跟自己的预期序列或所有的公共数据库不匹配，然后暴昏。
大家实验室里面还是用Taq酶为主吧，Pfu这样的高保真酶大家应该用得不多吧，Taq酶的优点和缺点都很明显：优点就是扩增效能强，缺点就是保真性差，其错配机率是比较高的，相关数字忘了，大家可以去网上查那个数字，不过感觉如果是2000bp的基因，如果扩四五十个循环的话，很大机率会出现点突变，当然这也跟具体PCR体系里的Buff er有很大关系，详细情况这里就不讨论了。
第二：要研究基因的功能，在基因上自己选定位置更换碱基的保守序列，或者改造成不同的亚型，总之就是要人工改造碱基序列符合自己的实验需要，相信这也是那些研究基因的人经常的一种思路吧。
对于第一种情况：我们首先要分析出现碱基不匹配的位置是不是重要的位置，如果不是很重要，大可不必管它，比如说是三联密码子的最后一位，碱基的改变并没有引起相应氨基酸的改变，那么一般情况下也可以不去理它。
另外，在NCBI上人类的基因的版本一直在变化，也就是说同一个基因有不同的版本，或者称不同的亚型，其碱基序列有些许的差异，只要自己克隆出来的碱基序列与其中一个相匹配，一般也就可以不做定点突变了。
如果有时间没钱，那干脆重新PCR然后再克隆进自己的载体了，不过最好换个保真性好一点的酶如PFU，或者PCR循环数低一点，不过这些东西有时候也得靠运气啦。
实在不行的话再来做定点突变。
对于第二种情况：这种情况下一般也就只能做定点突变了。
定点突变pcr具体流程
定点突变pcr具体流程定点突变PCR可是分子生物学实验里超有趣的一个部分呢！那我就跟你唠唠它的具体流程吧。
一、前期准备。
做定点突变PCR之前，咱得先把要用的东西都准备好。
这就像出门旅行得先收拾行李一样。
首先是引物，这个引物可太重要啦。
它得是根据你要突变的位点精心设计的，就像是给特定的小伙伴发专属邀请函。
引物设计的时候要考虑好多东西呢，比如说长度啦，GC含量啦，这些因素就像给引物设置的小密码，只有都合适了，它才能在PCR反应里大展身手。
然后就是模板，模板就像是一个大仓库，里面存着我们要修改的基因信息。
这个模板得保证质量好，纯度高，要是模板不好，后面的实验就像是在烂地基上盖房子，肯定不稳当。
再就是各种酶啦，像Taq酶之类的，这可是PCR反应里的小工匠，专门负责按照模板合成新的DNA链呢。
酶就像有魔法一样，在合适的条件下，就能把我们想要的DNA一点点变出来。
还有各种缓冲液，这些缓冲液就像是酶的小助手，给酶创造一个舒服的工作环境，让酶能更好地发挥自己的本领。
二、PCR反应。
东西都准备好了，就可以开始PCR反应啦。
把引物、模板、酶、缓冲液还有dNTP这些东西按照一定的比例混合在一个小管子里，这个小管子就像是一个小小的魔法实验室。
然后把这个小管子放到PCR仪里面。
PCR仪可是个很神奇的机器，它可以给这个小管子里的反应体系设置不同的温度。
先高温变性，这时候DNA双链就像两个好朋友突然被分开了，各自变成单链。
然后温度降低一点，这就是退火的过程，引物就像小磁铁一样，准确地吸附到模板链上它该在的位置。
再升高温度，延伸就开始啦，酶就开始按照模板链和引物的引导，一个一个地把核苷酸连接起来，形成新的DNA链。
这样循环好多轮，就像搭积木一样，一点点地把我们想要的突变后的DNA链给搭起来了。
三、验证。
PCR反应结束之后，可不能就这么结束了。
咱们得看看是不是真的得到了我们想要的突变产物。
这时候就可以用琼脂糖凝胶电泳来验证啦。
把PCR产物放到琼脂糖凝胶里，然后给它通上电。
基因定点突变简介
基因定点突变一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
二、定点突变的原理定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。
定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是实验室中改造/优化基因常用的手段。
蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。
对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。
而利用定点突变技术改造基因：比如野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。
定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。
通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。
三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复。
突变引物设计的特殊原则：（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。
一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp 才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。
《分子实验》基因定点突变
基因定点突变一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
二、定点突变的原理通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。
三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复。
突变引物设计的特殊原则：（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。
一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。
（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。
（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。
（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
（5）最好使用经过纯化的引物。
Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。
四、引物设计实例以G CG→A CG为例：5’-CCTCCTTCAGTA TGTAG G CGACTTACTTATTGCGG-3’（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。
Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC-3’Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG-3’（2）引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。
基因定点突变
基因定点突变一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
二、定点突变的原理通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。
三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复。
突变引物设计的特殊原则：（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。
一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。
（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。
（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。
（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
（5）最好使用经过纯化的引物。
Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。
四、引物设计实例以G CG→A CG为例：5’-CCTCCTTCAGTATGTAG G CGACTTACTTATTGCGG-3’（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。
Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC-3’Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG-3’（2）引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。
基因定点突变的原理和应用
基因定点突变的原理和应用1. 引言基因定点突变是指基因组中特定位置上的突变事件，它在遗传学研究、分子生物学研究以及生物工程等领域中具有重要的应用。
本文将介绍基因定点突变的原理和应用，并探讨其在科学研究和生物技术领域的潜力。
2. 基因定点突变的原理基因组中的定点突变可以通过多种机制产生，包括点突变、缺失、插入和替换等。
下面将介绍几种常见的基因定点突变的原理。
2.1 点突变点突变是指基因组中发生的单个碱基的改变。
它可以包括碱基替换、碱基插入和碱基缺失等不同类型。
点突变的原因可以是DNA复制时的错误、环境暴露以及基因组重组等。
2.2 缺失和插入缺失和插入是指基因组中发生的多个碱基的改变。
缺失是指某个区域的碱基突然丧失，而插入则是指某个区域多出了一个或多个碱基。
缺失和插入的原因可以是DNA复制过程中的错误、环境暴露以及基因组重组等。
2.3 替换替换是指基因组中的某个碱基被另一个碱基替换的现象。
替换可以是同义替换，即被替换的碱基编码的氨基酸与替代后的碱基编码的氨基酸一致；也可以是非同义替换，即被替换的碱基编码的氨基酸与替代后的碱基编码的氨基酸不同。
替换的原因可以是DNA复制时的错误、环境暴露以及基因组重组等。
3. 基因定点突变的应用基因定点突变在科学研究和生物技术领域有着广泛的应用。
下面将介绍几个常见的应用领域。
3.1 基因功能研究基因定点突变可以用来研究基因的功能。
通过人为地引入特定的突变，可以观察到这些突变如何影响基因的表达或功能，从而揭示基因的作用机制。
这对于理解基因与疾病之间的关系以及探索基因功能具有重要意义。
3.2 遗传疾病研究基因定点突变对于遗传疾病的研究也具有重要意义。
通过研究疾病相关基因的突变情况，可以了解突变对基因功能的影响，进而揭示疾病的发生机制。
这对于预防和治疗遗传疾病具有重要的指导意义。
3.3 基因工程基因定点突变在基因工程中有着广泛的应用。
通过引入特定的突变，可以改变目标基因的功能或表达水平，从而实现对生物体的改造。
定点突变
基因定点突变一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
二、定点突变的原理通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。
三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复。
突变引物设计的特殊原则：（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。
一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。
（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。
（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。
（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
（5）最好使用经过纯化的引物。
Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。
四、引物设计实例以G CG→A CG为例：5’-CCTCCTTCAGTA TGTAG G CGACTTACTTATTGCGG-3’（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。
Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC-3’Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG-3’（2）引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。
基因定点突变技术.
在酶工业方面：
一般通过定点突变技术获得突变的酶的稳定性效果不 显著，因为酶的稳定性与活性有关。从酶的稳定性与影响 酶活性的条件相关性我们可以得出：蛋白的变性是由高温、 极端ｐＨ、有机溶剂或去污剂的存在诱导而产生的。基于 这些理论，有利于人们选择高稳定性的突变体来改变酶的 结构和功能。
在医药方面：
通过在蛋白质工程中使用定点突变技术，筛选影响抗 生素耐性增强的突变子，对于研发更高效的抗生素具有非 常重要的指导意义。
1、突变技术在蛋白质工程中的应用
突变技术在蛋白质工程中的应用 非常广泛和成功。此技术不仅是蛋白 质定向改造的强有力工具，而且也是 研究蛋白质结构和功能关系的重要方 法。
在农业方面：
利用基因某一位点的改变进而来改变蛋白质的一级结 构，以此来改良或改造毒蛋白的活性。同时，还可以利用 突变技术改变结构域中的氨基酸残基，使突变毒蛋白与新 的昆虫受体相结合来扩大杀虫的范围，可以取代具有有机 磷污染 民用杀虫剂。
２、ＤＮＡ缺失改造
心钠素（ＡＮＰ）和干扰素（ＩＦＮ）在临床上 有着非常诱人的应用前景。这两产物在大肠杆菌和酵 母系统中都能以融合蛋白的形式表达出来。但由于在 克隆过程中不可避免地引进了一些没有用的核苷酸序 列，这样表达出来的产物就与天然产物存在着一定的 差异。为了使克隆表达的产物与天然的产物一样，人 们便采用寡核苷酸指导的定点突变技术，成功地对这 些多余的核苷酸进行了缺失改造，以期得到正确的产 物。
基因定点突变
基因定点突变一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
二、定点突变的原理通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。
三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复。
突变引物设计的特殊原则：（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。
一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。
（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。
（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。
（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
（5）最好使用经过纯化的引物。
Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。
四、引物设计实例以GCG→ACG为例：5’-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3’（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。
Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3’Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3’（2）引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。
定点突变技术：从单点突变到多点突变
定点突变技术：从单点突变到多点突变体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。
蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。
对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质…体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。
蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。
对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于我们了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。
而利用定点突变技术改造基因，相信大家也非常熟悉：比如野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。
定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。
对于单点突变，Stratagene公司的QuikChange Site-directed Mutagenesis kit是不错的选择，通过巧妙设计，将质粒定点突变技术变得简单有效。
准备突变的质粒必须是从常规E.coli中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。
设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。
基因定点突变
基因定点突变一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
二、定点突变的原理通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。
三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复。
突变引物设计的特殊原则：（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。
一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。
（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。
（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。
（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
（5）最好使用经过纯化的引物。
Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。
四、引物设计实例以GCG→ACG为例：5’-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3’（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。
Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3’Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3’（2）引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。
定点突变技术：从单点突变到多点突变
定点突变技术：从单点突变到多点突变体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。
蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。
对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质…体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。
蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。
对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于我们了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。
而利用定点突变技术改造基因，相信大家也非常熟悉：比如野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。
定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。
对于单点突变，Stratagene公司的QuikChange Site-directed Mutagenesis kit是不错的选择，通过巧妙设计，将质粒定点突变技术变得简单有效。
准备突变的质粒必须是从常规E.coli中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。
设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。
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基因定点突变试剂盒产品简介：碧云天生产的基因定点突变试剂盒(Site-directed Gene Mutagenesis Kit)可以用于点突变，多个邻近密码子的突变，单个或多个邻近密码子的缺失(deletion)或插入(insertion)。
本试剂盒是一个利用目前最新的基因点突变技术设计而成的试剂盒。
只需通过基于PCR的突变质粒的合成，和基于Dpn I的模板质粒的消化，转化培养以及后续的酶切或测序鉴定，即可得到预期的突变质粒(参考图1)。
累计操作时间不足2小时即可完成基因的定点突变。
参考图1，使用本试剂盒时需要先设计长度通常为30个碱基以上的互补的两个引物，在引物中含有预期的突变位点。
然后以待突变的质粒为模板，用这两个引物进行PCR扩增反应。
这样可以产生含有预期的突变位点的双链质粒，但这个双链质粒中有两个nick位点。
待突变的质粒通常来源于大肠杆菌等细菌，在细菌中会被甲基化修饰，而在体外通过PCR扩增得到的质粒不会被甲基化。
这样用甲基化酶Dpn I处理，可以消化掉待突变的质粒模板，而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择性地保留下来。
这样把Dpn I处理过的产物转化细菌后，质粒中有两个nick位点可以被大肠杆菌修复，得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。
本试剂盒提供了DH5α甘油菌，可用于感受态细菌的制备。
本试剂盒共可以进行十次基因定点突变反应。
图1. 基因定点突变试剂盒原理图保存条件：-20℃保存，一年有效。
注意事项：需自行配制LB液体培养基和LB平板以用于细菌的培养。
需自行设计和合成用于基因定点突变的引物。
需自备用于细菌转化的试剂。
使用本试剂盒前请先阅读后面的常见问题。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：1. 引物设计：用于特定基因突变的引物需要单独设计，请参考如下一些基本原则进行设计：(1) 共需设计两条互补的引物。
可以先集中设计一条，然后就可以得到互补的另一条引物。
(2) 引物的长度通常为25-45个碱基。
(3) 引物中突变位点任何一侧都必需满足 4X(GC碱基数)＋2X(AT碱基数) ≥45。
但引物也不宜过长，否则通常会形成非常稳定的二级结构。
通常把突变位点两侧的碱基数控制在15个左右，且使两侧按照上述计算得到的数值相近。
例如引物为agtcaggccaattcg aag cagtcgaattgccaag，其中蓝色的aag为突变位点，则左侧：4X(GC碱基数)＋2X(AT碱基数)＝4X8＋2X7＝46≥45右侧：4X(GC碱基数)＋2X(AT碱基数)＝4X8＋2X8＝48≥45(4) 在可能的情况下，尽量把引物的GC含量控制在40％-60％。
(5) 在可能的情况下，尽量使引物不要产生非常稳定的二级结构和引物二聚体。
二级结构和二聚体可以通过一些软件进行分析。
(6) 最好使用经过PAGE纯化的引物或更高纯度的引物。
2. 引物的配制：如果合成得到的一个引物A的量是20nmol，另外一个互补引物B的量是19nmol。
在引物A中加入200微升水，配制成浓度为100µM，在引物B中加入190微升水也配制成浓度为100µM。
吸取20微升100µM引物A和20微升100µM引物B到一新的离心管中，再加入160微升水，混匀后即可得到可以直接用于基因定点突变反应的引物(10µM each)。
3. 待突变模板质粒的选择：选择GC含量在40-55％的待突变模板质粒，并且每一个50bp左右的局部GC含量最好也不超过70%。
如果GC含量过高，请先把目的基因克隆到其它合适的载体上，再进行基因定点突变反应。
另外目的基因GC含量最好也在40-55％的范围，并且每一个50bp左右的局部GC含量最好也不超过70%。
如果目的基因GC含量过高，而突变位点不在高GC含量区域，可以先把该基因的不含高GC含量的一个区域克隆出来，进行定点突变，然后再把突变后的片断克隆回原基因中。
如果必需使用高GC含量的质粒模板，或者有局部高GC含量的质粒模板，请另外使用专门用于高GC含量模板的PCR反应试剂。
必需使用从dam＋的大肠杆菌(这类菌中质粒可以被甲基化)中抽提得到的质粒用于基因定点突变。
常用的大部分大肠杆菌都是dam＋的，包括DH5α、JM109等。
4. 基因定点突变反应：(1) 如下设置基因定点突变反应体系：Nuclease-Free Water ?µlReaction Buffer (10X) 5µl引物 (10µM each) 2µldNTP Mix (2.5mM each) 4µl待突变模板质粒(0.5µg) ?µl总体积 49µl按照上面的顺序依次加入各种试剂。
在上述反应体系中，根据待突变模板质粒的量，计算出需加入的Nuclease-Free Water 的量，使总体积为49微升。
适当混匀后，加入 1 ul Pfu DNA Polymerase，混匀。
如果用的PCR仪没有热盖，在反应体系上加入一滴矿物油(mineral oil)以防止蒸发。
说明：上面表格中1分钟/kb表示，如果待突变的质粒为6kb，那么68℃的延伸时间为6分钟。
5.Dpn I消化：PCR反应后，直接在PCR反应体系中加入1微升Dpn I，混匀后37℃孵育1小时。
37℃孵育可以在PCR仪上进行，也可以在水浴锅中进行。
Dpn I消化完毕后可以直接用于转化，或者-20℃保存备用。
6. 转化、挑克隆鉴定：感受态细菌的转化效率必需至少在107以上，否则很难得到克隆。
根据所使用的感受态细菌，加入尽量多的经过Dpn I消化后的突变产物用于转化。
通常每100微升感受态细菌中可以加入5-10微升经过Dpn I消化后的突变产物。
按照所使用的感受态细菌的操作方法进行操作，在涂板前通过离心浓缩的办法，把所有被转化后的细菌，全部涂布到含有适当抗生素的平板上，培养过夜。
通常会得到50个以下的克隆。
如果发现克隆有上千个，那么肯定是有什么地方出了问题。
对于得到的克隆，可以先挑克隆小抽酶切鉴定。
以确认得到的质粒的大小和质粒中插入片断的大小与预期结果是否相符。
取3-5个酶切鉴定正确的克隆去测序，以最终确认得到的克隆是否是预期的突变克隆。
通常大约每2个克隆中会得到一个预期的突变克隆。
但有时也可能会因为随机因素，会测序了3-5个克隆才得到一个预期的突变克隆。
常见问题：1.转化后没有克隆或克隆数极少：(1)感受态细菌效率不够高，请检测一下感受态细胞的效率，确保转化效率在107以上，当然高一些更好。
(2)把Dpn I消化后的产物用常规的乙醇沉淀方法进行沉淀，然后溶解在较小的体积中。
这样就可以把所有的产物全部用于转化。
(3)优化基因定点突变中的PCR参数。
可以把最初的95℃变性时间延长为2分钟，循环中95℃变性的时间延长至1分钟，把循环中的68℃的延伸时间改为1.5分钟/kb 至2分钟/kb，退火可以改为60-55℃或65-55℃等的touch down，退火时间也可以适当延长。
(4)引物设计有问题。
通过突变反应中的PCR没有很好地扩增出预期的突变质粒。
(5)如果使用矿物油(mineral oil)，在转化时如果把矿物油带入感受态菌，会严重影响转化效率。
2.有克隆，但没有或很难检测到预期的突变克隆：(1)Dpn I消化效果不佳。
一种可能是加入Dpn I后，由于该酶在甘油中，会迅速下沉，如果没有混匀就会严重影响Dpn I的消化作用。
另一种可能是Dpn I由于保存不当或保存时间过长等原因导致活性下降，这时可以适当延长消化的时间至1.5-2小时。
(2)使用的待突变的模板质粒量过多，导致Dpn I消化时不完全。
我们这里推荐的模板质粒用量0.5微克，已经是模板质粒用量的上限，不能再使用更多的模板质粒了。
(3)尽量避免多次反复冻融dNTP。
可以把dNTP适当分装后再使用。
3.有突变克隆，但突变位点不是预期的位点：(1)引物设计不佳，并且PCR反应中退火温度过低，导致引物退火到错误的地方。
(2)引物质量较差，没有经过PAGE纯化。
这样引物中通常会含有比设计的引物要短的特异性较差的引物，容易导致非预期的突变。
使用本产品的文献：1. Song ZB, Bao YL, Zhang Y, Mi XG, Wu P, Wu Y, Yu CL, Sun Y, Zheng LH, Huang YX, Liu B, Li YXTestes-specific pro tease 50 (TSP50) promotes cell proliferation through the activation of thenuclear factor κB (NF-κB) signalling pathway.Biochem J. 2011 Jun 1;436(2):457-67.2. Li YY, Bao YL, Song ZB, Sun LG, Wu P, Zhang Y, Fan C, Huang YX, Wu Y, Yu CL, Sun Y, Zheng LH, Wang GN, Li YX.The threonine protease activity of testes-specific protease 50 (TSP50) is essential for its functionin cell proliferation.PLoS One. 2012;7(5):e350303. Fei X, Qi M, Wu B, Song Y, Wang Y, Li T.MicroRNA-195-5p suppresses glucose uptake and proliferation of human bladder cancer T24 cellsby regulating GLUT3 expression.FEBS Lett. 2012 Feb 17;586(4):392-7.4. Li F, Jiang Z, Wang K, Guo J, Hu G, Sun L, Wang T, Tang X, He L, Yao J, Wen D, Qin X, Zhang LTransactivation of the human NME5 gene by Sp1 in pancreatic cancer cells.Gene. 2012 Jul 25;503(2):200-7.5. Qin Y, Fang Z, Pan F, Zhao Y, Li H, Wu H, Meng XSignificance of Tyr302, His235 and Asp194 in the α-amylase from Bacillus licheniformis.Biotechnol Lett. 2012 May;34(5):895-9.。