植物激活蛋白对番茄防御酶活性的影响
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收稿日期：2008-03-10 基金项目：国家“973”项目(2003CB114204) 作者简介：李 丽(1978-)，女，湖南娄底人，硕士，湖 南文理学院讲师．*通讯作者：dewenqiu@．
的 病 程 相 关 蛋 白 (pathogenesis-related protein ， PR)[1,4].植物激活蛋白[5-6]是从真菌中分离提取的一 类具有促进植物生长[7-8]和提高植物抗性的蛋白激 发子，它对灰霉病菌(Botrytis cinerea)等多种植物病 原真菌有较好的防效，防效达71.03%以上[9]．笔者 以2 µg/mL植物激活蛋白和灰霉病菌孢子悬浮液分 别处理番茄叶片，比较番茄叶片防御酶活性的变化， 以期从诱导抗性的角度分析植物激活蛋白的诱导抗 病性，为植物激活蛋白诱导抗性机理的研究提供参考.
536
湖南农业大学学报(自然科学版)
2008 年 10 月
POD 活性比对照增加 118.72%，PPO 增加 101.79%； 6 d 时 2 种酶活性下降，但 POD 仍比对照高 98.25% ，PPO 比对照高 58.06%．植物激活蛋白与 病菌同时处理植株，叶片中 POD 和 PPO 活性均显 著高于对照，且变化趋势与植物激活蛋白单独诱导 处理基本一致．病菌单独接种也能诱导 POD 和 PPO 活性增加，但与植物激活蛋白诱导处理相比，POD 活性增加幅度较小，第 6 天时 2 种酶活性下降比较 快(图 3、图 4)．
李 丽 1，2，刘 峥 1，杨秀芬 1，邱德文1*
(1.中国农业科学院 农业环境与可持续发展研究所，北京 100081；2 湖南文理学院 生命科学系，湖南 常德
415000)
摘 要：用 2 µg/mL 植物激活蛋白处理番茄叶片，测定番茄叶片内苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、
POD 同工酶、多酚氧化酶(PPO)和超氧化物歧化酶(SOD)含量．结果表明：经植物激活蛋白诱导处理后，防御酶 活性明显增强．诱导 1 d 后，PAL 活性最大，是对照的 3.93 倍，8 d 后仍为对照的 3.4 倍；POD 和 PPO 诱导后 4 d 活性最高，分别比对照增加 118.72% 和 101.79%，8 d 后仍比对照高；SOD 活性诱导后 4 d 达高峰，8 d 后稍高 于对照．POD 同工酶活性诱导后 3 d 比对照增加了 88.96%，同时还出现了新的酶带．
关 键 词：植物激活蛋白；番茄；诱导抗性；防御酶；灰霉病菌
中图分类号：Q554+.9
文献标识码：A
Effect of plant activator protein on tomato defence enzyme
LI Li1，2，LIU Zheng1，YANG Xiu-fen 1，QIU De-wen1* (1.Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculture，Chinese Academy of Agricultural Science，Beijing 100081，China；2.Department of Life Sciences，Hunan University of Arts and Science，Changde，415000 China）
2.2 植物激活蛋白对番茄POD同工酶的诱导作用
图 5(a)显示，2 µg/mL 的植物激活蛋白作用于 番茄品种中蔬 6 号，POD 同工酶谱带出现新的条带 和条带亮度的变化．处理后第 3 天，POD 同工酶谱 带与空白对照具有极显著性差异(P<0.01)，b1(Rf＝ 0.49)，b2(Rf=0.53)条带加强，分别比对照增加了 88.96%、43.16%．水杨酸处理从第 1 天开始出现新 的条带和条带亮度的变化.
植物激活蛋白诱导处理后第 2、4、6 天，各处 理株 SOD 活性与对照相比均有不同程度升高，8 d 后仍高于对照，且每处理株第 4 天达高峰，但处理 1 上升幅度低于病菌单独处理或植物激活蛋白与病 菌同时处理(处理 3、4)，可能有利于活性氧短暂积 累，激发诱导抗性产生(图 2).
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处理1
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性迅速上升．第 4 天达最大值，为对照的 3.93 倍； 第 6 天仍保持较高的水平，为对照的 3.65 倍；第 8 天仍为对照的 3.4 倍．植物激活蛋白和灰酶病菌同 时接种时，PAL 活性第 2 天为对照的 2.45 倍, 第 4 天达高峰值，为对照的 3.34 倍；4 d 后开始下降， 但下降幅度较小，第 8 天仍为对照的 2 倍以上．病 菌单独接种后叶片中 PAL 活性的增加幅度小于植 物激活蛋白及植物激活蛋白和灰酶病菌同时接种 处理，第 6 天和第 8 天 PAL 活性比植物激活蛋白诱 导处理分别低 50.0%和 66.67%(图 1).
POD活性/(U·g－1·min－ 1)
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接种后时间/d
图 3 植物激活蛋白对番茄叶片 POD 活性的影响
Fig.3 The activities of POD in tomato leaves induced by plant activator protein
1.2 方 法
1.2.1 诱抗试验
设 4 种处理．处理 1：清水对照；处理 2：用 毛笔将 2 µg/mL 植物激活蛋白液涂抹于番茄植株下 部第 2 叶位叶片，3 d 后进行 1 次加强处理．处理 3： 植物激活蛋白加强处理后，立即以病菌 BC-1 菌丝 贴叶接种；处理 4：未经任何处理直接贴叶接种灰 霉病病菌．每处理 10 株，重复 3 次．试验植株 25 ℃ 下保湿 24 h. 1.2.2 防御酶活性测定
Abstract：The induced resistance was studied in tomato leaves treated with 2 µg/mL plant activator protein. The phenylalanine ammonia-lyase(PAL), peroxidase(POD) and its isozyme,polypenoloxidase(PPO) and superoxide dismutase(SOD)concentration of tomato were tested. Results show the activities of defense enzyme in tomato leaves increased obviously. The activities of PAL peaked 1 day after the treatment while the activities of SOD, POD and PPO reached their maximum 4 days after the treatment．Compared with control, PAL, POD, PPO and SOD in treated leaves kept higher activities for 8 days during the experiment．Peroxidase isozyme in treated leaves reached the peak 3 days after inoculation 88.96% higher than that in the contro1,which could induce the thickening of the original isozyme bands and the expression of some new isozyme bands．
分别在诱导处理后1、2、4、6、8 d取样．称取 0.50 g样品，置于5 mL 50 mmoL/L pH 7.0的磷酸缓 冲液(含1%的聚乙烯吡咯烷酮)中冰浴研磨匀浆，在 0～4 ℃下12 000 r/min离心20 min，上清即为粗酶 液，－20 ℃ 冰箱中保存备用．PAL、POD、PPO 活性测定参照文献[11]、[12]方法进行．SOD活性测 定参照文献[13]方法稍作修改：5 mL反应液中含25 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.8)、13 mmol/L 甲硫氨酸， 75 µmol/L氮蓝四唑(NBT)、10 µmol/L EDTA-Na2、2 µmol/L核黄素，加入83 µL酶液．SOD以抑制NBT 光化还原50%作为一个酶活单位；PAL、POD、PPO 酶活性单位采用以U/(g ·min)表示. 1.2.3 POD同工酶
PPO活性 /(U·g－1·min－1)
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图 4 植物激活蛋白对番茄叶片 PPO 活性的影响
Fig.4 The activities of PPO in tomato leaves induced by plant activator protein
1 材料与方法
1.1 材 料
植物激活蛋白提取自链格孢菌(Alternaria sp.)
第 34 卷第 5 期
李 丽等 植物激活蛋白对番茄防御酶活性的影响
535
(由中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所 蛋白质药物工程实验室制备)[10]；番茄品种为中蔬6 号，在25~28 ℃、自然光周期的温室内培育至4~6 叶期供试验用．番茄灰霉病菌孢子悬浮液的制备： 在PDA培养基上培养番茄灰霉病菌7~9 d，收集孢子 制成孢子悬浮液．
第 34 卷第 5 期 2008 年 10 月
湖南农业大学学报(自然科学版) Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences)
文章编号：1007-1032(2008)05-0534-04
Vol.34 No.5 Oct．2008
植物激活蛋白对番茄防御酶活性的影响
提取 POD 粗酶液．采用垂直板聚丙烯酰胺凝 胶电泳法分析 POD 同工酶．电泳参照文献[14]方 法，染色 2 min，用自来水缓慢冲洗脱色直到颜色 不发生变化为止．同工酶浓度由凝胶成像系统软 件得出.
2 结果与分析
2.1 植物激活蛋白对番茄叶内防御酶活性的影响
植物激活蛋白诱导处理后，番茄叶片中 PAL 活
Key words：plant activator protein；tomato；induced resistance；defense enzyme；Botrytis cinerea
诱导植物抗性的生物因子有非致病菌、弱毒菌 株及蛋白激发子等，这些诱导抗性通常为系统获得 抗性(system acquired resistance，SAR)或诱导系统抗 性(induced system resistance，ISR)[1-3]. 苯丙氨酸解 氨酶PAL、过氧化物酶POD、多酚氧化酶PPO和超 氧化物歧化酶SOD是植物体内重要的防御酶，其活 性高低与植物抗病性相关，PAL是植物体内莽草酸 途径中的关键酶，其活性高低直接影响木质素、植 保素等抗菌物质的合成，许多研究者发现，在诱导 抗性特别是系统获得抗性中能产生具有抗菌能力
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图 2 植物激活蛋白对番茄叶片 SOD 活性的影响
Fig.2 The activities of SOD in tomato leaves induced by plant activator protein
植物激活蛋白诱导处理第二叶位叶片后，叶片 POD 和 PPO 活性显著增加．与对照相比，1 d 后 POD 和 PPO 活性开始上升；第 4 天时达最大值，此时
PAL活性/(U·g-1 ·min-1)
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图 1 植物激活蛋白对番茄叶片 PAL 活性的影响
Fig.1 The activities of PAL in tomato leaves induced by plant activator protein
的 病 程 相 关 蛋 白 (pathogenesis-related protein ， PR)[1,4].植物激活蛋白[5-6]是从真菌中分离提取的一 类具有促进植物生长[7-8]和提高植物抗性的蛋白激 发子，它对灰霉病菌(Botrytis cinerea)等多种植物病 原真菌有较好的防效，防效达71.03%以上[9]．笔者 以2 µg/mL植物激活蛋白和灰霉病菌孢子悬浮液分 别处理番茄叶片，比较番茄叶片防御酶活性的变化， 以期从诱导抗性的角度分析植物激活蛋白的诱导抗 病性，为植物激活蛋白诱导抗性机理的研究提供参考.
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湖南农业大学学报(自然科学版)
2008 年 10 月
POD 活性比对照增加 118.72%，PPO 增加 101.79%； 6 d 时 2 种酶活性下降，但 POD 仍比对照高 98.25% ，PPO 比对照高 58.06%．植物激活蛋白与 病菌同时处理植株，叶片中 POD 和 PPO 活性均显 著高于对照，且变化趋势与植物激活蛋白单独诱导 处理基本一致．病菌单独接种也能诱导 POD 和 PPO 活性增加，但与植物激活蛋白诱导处理相比，POD 活性增加幅度较小，第 6 天时 2 种酶活性下降比较 快(图 3、图 4)．
李 丽 1，2，刘 峥 1，杨秀芬 1，邱德文1*
(1.中国农业科学院 农业环境与可持续发展研究所，北京 100081；2 湖南文理学院 生命科学系，湖南 常德
415000)
摘 要：用 2 µg/mL 植物激活蛋白处理番茄叶片，测定番茄叶片内苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、
POD 同工酶、多酚氧化酶(PPO)和超氧化物歧化酶(SOD)含量．结果表明：经植物激活蛋白诱导处理后，防御酶 活性明显增强．诱导 1 d 后，PAL 活性最大，是对照的 3.93 倍，8 d 后仍为对照的 3.4 倍；POD 和 PPO 诱导后 4 d 活性最高，分别比对照增加 118.72% 和 101.79%，8 d 后仍比对照高；SOD 活性诱导后 4 d 达高峰，8 d 后稍高 于对照．POD 同工酶活性诱导后 3 d 比对照增加了 88.96%，同时还出现了新的酶带．
关 键 词：植物激活蛋白；番茄；诱导抗性；防御酶；灰霉病菌
中图分类号：Q554+.9
文献标识码：A
Effect of plant activator protein on tomato defence enzyme
LI Li1，2，LIU Zheng1，YANG Xiu-fen 1，QIU De-wen1* (1.Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculture，Chinese Academy of Agricultural Science，Beijing 100081，China；2.Department of Life Sciences，Hunan University of Arts and Science，Changde，415000 China）
2.2 植物激活蛋白对番茄POD同工酶的诱导作用
图 5(a)显示，2 µg/mL 的植物激活蛋白作用于 番茄品种中蔬 6 号，POD 同工酶谱带出现新的条带 和条带亮度的变化．处理后第 3 天，POD 同工酶谱 带与空白对照具有极显著性差异(P<0.01)，b1(Rf＝ 0.49)，b2(Rf=0.53)条带加强，分别比对照增加了 88.96%、43.16%．水杨酸处理从第 1 天开始出现新 的条带和条带亮度的变化.
植物激活蛋白诱导处理后第 2、4、6 天，各处 理株 SOD 活性与对照相比均有不同程度升高，8 d 后仍高于对照，且每处理株第 4 天达高峰，但处理 1 上升幅度低于病菌单独处理或植物激活蛋白与病 菌同时处理(处理 3、4)，可能有利于活性氧短暂积 累，激发诱导抗性产生(图 2).
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处理1
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性迅速上升．第 4 天达最大值，为对照的 3.93 倍； 第 6 天仍保持较高的水平，为对照的 3.65 倍；第 8 天仍为对照的 3.4 倍．植物激活蛋白和灰酶病菌同 时接种时，PAL 活性第 2 天为对照的 2.45 倍, 第 4 天达高峰值，为对照的 3.34 倍；4 d 后开始下降， 但下降幅度较小，第 8 天仍为对照的 2 倍以上．病 菌单独接种后叶片中 PAL 活性的增加幅度小于植 物激活蛋白及植物激活蛋白和灰酶病菌同时接种 处理，第 6 天和第 8 天 PAL 活性比植物激活蛋白诱 导处理分别低 50.0%和 66.67%(图 1).
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图 3 植物激活蛋白对番茄叶片 POD 活性的影响
Fig.3 The activities of POD in tomato leaves induced by plant activator protein
1.2 方 法
1.2.1 诱抗试验
设 4 种处理．处理 1：清水对照；处理 2：用 毛笔将 2 µg/mL 植物激活蛋白液涂抹于番茄植株下 部第 2 叶位叶片，3 d 后进行 1 次加强处理．处理 3： 植物激活蛋白加强处理后，立即以病菌 BC-1 菌丝 贴叶接种；处理 4：未经任何处理直接贴叶接种灰 霉病病菌．每处理 10 株，重复 3 次．试验植株 25 ℃ 下保湿 24 h. 1.2.2 防御酶活性测定
Abstract：The induced resistance was studied in tomato leaves treated with 2 µg/mL plant activator protein. The phenylalanine ammonia-lyase(PAL), peroxidase(POD) and its isozyme,polypenoloxidase(PPO) and superoxide dismutase(SOD)concentration of tomato were tested. Results show the activities of defense enzyme in tomato leaves increased obviously. The activities of PAL peaked 1 day after the treatment while the activities of SOD, POD and PPO reached their maximum 4 days after the treatment．Compared with control, PAL, POD, PPO and SOD in treated leaves kept higher activities for 8 days during the experiment．Peroxidase isozyme in treated leaves reached the peak 3 days after inoculation 88.96% higher than that in the contro1,which could induce the thickening of the original isozyme bands and the expression of some new isozyme bands．
分别在诱导处理后1、2、4、6、8 d取样．称取 0.50 g样品，置于5 mL 50 mmoL/L pH 7.0的磷酸缓 冲液(含1%的聚乙烯吡咯烷酮)中冰浴研磨匀浆，在 0～4 ℃下12 000 r/min离心20 min，上清即为粗酶 液，－20 ℃ 冰箱中保存备用．PAL、POD、PPO 活性测定参照文献[11]、[12]方法进行．SOD活性测 定参照文献[13]方法稍作修改：5 mL反应液中含25 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.8)、13 mmol/L 甲硫氨酸， 75 µmol/L氮蓝四唑(NBT)、10 µmol/L EDTA-Na2、2 µmol/L核黄素，加入83 µL酶液．SOD以抑制NBT 光化还原50%作为一个酶活单位；PAL、POD、PPO 酶活性单位采用以U/(g ·min)表示. 1.2.3 POD同工酶
PPO活性 /(U·g－1·min－1)
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图 4 植物激活蛋白对番茄叶片 PPO 活性的影响
Fig.4 The activities of PPO in tomato leaves induced by plant activator protein
1 材料与方法
1.1 材 料
植物激活蛋白提取自链格孢菌(Alternaria sp.)
第 34 卷第 5 期
李 丽等 植物激活蛋白对番茄防御酶活性的影响
535
(由中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所 蛋白质药物工程实验室制备)[10]；番茄品种为中蔬6 号，在25~28 ℃、自然光周期的温室内培育至4~6 叶期供试验用．番茄灰霉病菌孢子悬浮液的制备： 在PDA培养基上培养番茄灰霉病菌7~9 d，收集孢子 制成孢子悬浮液．
第 34 卷第 5 期 2008 年 10 月
湖南农业大学学报(自然科学版) Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences)
文章编号：1007-1032(2008)05-0534-04
Vol.34 No.5 Oct．2008
植物激活蛋白对番茄防御酶活性的影响
提取 POD 粗酶液．采用垂直板聚丙烯酰胺凝 胶电泳法分析 POD 同工酶．电泳参照文献[14]方 法，染色 2 min，用自来水缓慢冲洗脱色直到颜色 不发生变化为止．同工酶浓度由凝胶成像系统软 件得出.
2 结果与分析
2.1 植物激活蛋白对番茄叶内防御酶活性的影响
植物激活蛋白诱导处理后，番茄叶片中 PAL 活
Key words：plant activator protein；tomato；induced resistance；defense enzyme；Botrytis cinerea
诱导植物抗性的生物因子有非致病菌、弱毒菌 株及蛋白激发子等，这些诱导抗性通常为系统获得 抗性(system acquired resistance，SAR)或诱导系统抗 性(induced system resistance，ISR)[1-3]. 苯丙氨酸解 氨酶PAL、过氧化物酶POD、多酚氧化酶PPO和超 氧化物歧化酶SOD是植物体内重要的防御酶，其活 性高低与植物抗病性相关，PAL是植物体内莽草酸 途径中的关键酶，其活性高低直接影响木质素、植 保素等抗菌物质的合成，许多研究者发现，在诱导 抗性特别是系统获得抗性中能产生具有抗菌能力
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图 2 植物激活蛋白对番茄叶片 SOD 活性的影响
Fig.2 The activities of SOD in tomato leaves induced by plant activator protein
植物激活蛋白诱导处理第二叶位叶片后，叶片 POD 和 PPO 活性显著增加．与对照相比，1 d 后 POD 和 PPO 活性开始上升；第 4 天时达最大值，此时
PAL活性/(U·g-1 ·min-1)
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