第四章 酶生物传感器

（二）电位型酶电极
电位型酶电极是将酶促反应所引起的物
质量的变化转变成电位信号输出，电位信号
大小与底物浓度的对数值呈线性关系。
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电位型酶电极所用的基础电极是对 某种离子有选择性或对气体有选择性的电极
离子选择 性电极
气敏电极
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⑴尿素电极 1773年，伊莱尔· 罗埃 尔（Hilaire Rouelle）发现 尿素。 1828年，德国化学家
H2O2 O2 2H 2e
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（2）改进的葡萄糖传感器 为消除环境中氧对测定的干扰，用 四硫富瓦烯、二茂铁等容易在电极上氧化 还原的介体来代替氧的电子传递作用。电 子介体是酶氧化还原活性中心与电极表面 之间的电子传递中介物，在电流型酶电极 中起着关键性作用。 各种电子传递介体的使用，使得电流 型酶传感器的响应速度、检测灵敏度和选 择性都得到了很大的提高。
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酶动力学测定的是初速度，是指酶 在反应过程中底物初始浓度被消耗在5% 以内的速度。目的是排除酶反应过程中 出现的各种干扰因素，以便测得准确的 酶反应速度。
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⑴底物浓度对酶促反应速度的影响
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⑵酶浓度对酶促反应速度的影响 若底物初始浓度固定时，酶反 应速度与酶浓度呈线性关系。
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⑶温度对酶促反应速度的影响
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方法：将葡萄糖氧化酶和电子介体 同时包埋于聚合物膜中，或直接修饰于 电极的表面构成葡萄糖酶传感器。
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在葡萄糖氧化酶（ GOX ）的催化下， 葡萄糖被氧化为葡萄糖酸，再由二茂铁离 子将还原型葡萄糖氧化酶（ GOD ）氧化 为氧化型葡萄糖氧化酶（ GOX ），然后二 茂铁在电极上氧化成二茂铁离子，通过二 茂铁在电极上产生的氧化电流来实现葡萄 糖含量的检测。
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传感器的类型
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4.1 酶电极传感器 Enzyme electrode sensor
酶电极是由固定化酶与电流型电极 或电位型电极组合而成的生物传感器。 具有酶的分子识别和选择催化功能， 又有电化学电极响应快、操作简便的特 点，能快速测定试液中某一给定化合物 的浓度，且需很少量的样品。
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㈠电流型酶电极 电流型酶电极是将酶促反应产生的物 质在电极上发生氧化或还原反应产生的电
醉酒驾车：指驾驶员血液中的酒精含量大于或
等于80 mg/100 mL的驾驶行为。 1400 mL(约相称于3瓶500 mL)啤酒或一两半 白酒(80mL)
C2H5OH +
NAD+
醇脱氢酶
CH3CHO + NADH
NADH + [Fe(CN)6]4-
NAD+ + [Fe(CN)6]3- + H+ + e-
O2 2 H 2O 4e 4OH
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使用最多的是封闭式的Clark氧电极
铂电极与Ag电极组合在一起置于参比
溶液中，与被测溶液之间用透氧膜隔开。
被测溶液中的溶解氧通过膜扩散到电解质 溶液薄层，再扩散到铂电极表面进行还原 产生电流。
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H2O2电极
H2O2电极基本测量电路和电压-电流曲线
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（3）血糖仪测试片
血糖仪测试片
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手表式的葡萄糖传感器
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手表式无创血糖仪是近年来出现的一 种无创、无痛，能连续测定血糖的设备。它 通过电化学传感器和电渗透原理来检测皮下 组织液中的葡萄糖浓度，无需针刺采血。 手表式血糖仪测定的是组织间液葡萄糖 值，因此要略滞后于指血血糖值。
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(2)乳酸电极
ENFET将酶膜复合在ISFET的栅极。
测量时，酶的催化作用使待测分子反应
生成ISFET能够响应的离子。
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介体传感器的特点：
• 仅用较低的电压就能使介体氧化。 • 传感器对氧不敏感，能在缺氧和氧浓度 变化的条件下使用。
• 二茂铁离子与还原GOD之间的电子传递 快，电极响应迅速。
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采用场效应晶体管和微电极做换能器， 以缩小传感器的体积； 利用电子技术、改善信号放大和显示方 法，使其易于商品化； 改善采样方法，使患者使用方便或更易 于临床应用。 最重要的改进是使用化学电子传递中间 介体代替作为自然电子受体的氧，使酶催化 反应不再受到溶解氧含量的制约。
2CO2 + 甲酸
（3）腺苷电极
♫ 参与心肌能量代谢
♫ 扩张血流量
♫ 合成ATP、腺苷酸的重要 中间体
腺嘌呤脱氨基酶
腺苷
肌苷 + NH3
（4）苯丙氨酸电极
♫ 哺乳动物的必
需氨基酸
♫ 是甜味剂阿斯
巴甜的主要原料
苯丙氨酸
苯丙氨酸 胺裂解酶
反式肉桂酸盐+ NH3
4.2 酶场效应晶体管传感器(ENFET)
流作为测量信号，在一定条件下，利用测
得的电流信号与被测物活度或浓度的函数 关系，来测定样品中某一生物组分的活度 或浓度。
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制作生物传感器最常用的是氧化酶：
底物+O2 产物+H2O2
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基础电极可采用氧、过氧化氢电极，还 可采用近年开发的介体修饰的炭、铂、钯和 金等固体电极或介体修饰电极。
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氧电极：是一个通过测定电解电流来测定 溶液中氧含量的电解池。 工作时，在铂阴极和 Ag阳极之间施加0.6V 的电压。当E=-0.2V时 电极开始电解，产生还 原电流，其还原反应式 为：
第四章 酶生物传感器
Enzyme Biosensor
一、酶的本质与特征
㈠ 酶的本质 酶是生物体内产生的、具有催化活性 的一类蛋白质。 根据化学组成分为两大类，即单纯蛋 白酶与结合蛋白酶。 根据酶的催化反应类型分为氧化还原 酶、转移酶、水解酶、异构酶等。
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㈡ 酶的基本特征 酶的高效催化性 酶的催化效率通常比一般催化剂 高106-1012倍。酶之所以能高效催化，
胆固醇电极是一种用于临床测定 血清胆固醇含量的电流型酶传感器。
胆固醇脂酶 胆固醇 H 2O 游离胆固醇 RCOOH
胆固醇氧化酶 游离胆固醇 O2 胆甾烯酮 H 2O2
结合型酶电极
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根据反应过程中消耗的氧，产生的过 氧化氢，用相应的电极组成胆固醇传感器 测定电流的变化量，在一定条件下，电流 变化量与胆固醇浓度呈线性相关。
血液中乳酸的浓度是反映人体体力 消耗程度的重要指标。在体育运动训练中 乳酸的检验是极为必要，国际上乳酸传感 器已经有成熟的商品仪器。
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还可采用介体修饰的方法制备 乳酸传感器。 在电极上滴介体四硫 富瓦烯(TTF)浆液，晾干后，将乳酸 氧化酶固定在该电极表面修饰层上 面，即构成乳酸传感器。
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测量氧消耗量的葡萄糖传感器：
Clark氧电极用于测定酶促反应中氧 的消耗量(电流降低的量)来计算样品中葡 萄糖的含量，最低检测限为10-4 mol／L 。
O2 2 H 2O 4e 4OH
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测量H2O2生成量的葡萄糖传感器： 葡萄糖氧化产生H2O2， H2O2通过选择 性透气膜，在Pt电极上氧化，葡萄糖的含量 与生成的电流成正比，由此可测出葡萄糖的 浓度。 检测H2O2的方法的本底电流小，灵敏 度高，其最低检出限为10-8mol／L。
●
是通过降低反应所需的活化能实现的。
2
●
酶的高度特异性
酶不仅具有一般催化剂加快反应 速度的作用，而且具有高度的特异性。 绝对特异性 相对特异性 立体异构特异性
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㈢酶促反应动力学 酶促反应动力学是研究酶反应速度及 各种因素对酶反应速度影响的科学。 主要影响因素包括有：底物浓度、酶 浓度、 pH值、温度、抑制剂与激活剂等。
在乳酸氧化酶的催化下，乳酸被氧化 为丙酮酸，再由四硫富瓦烯离子将还原型 乳酸氧化酶氧化为氧化型乳酸氧化酶，然 后四硫富瓦烯在电极上氧化成四硫富瓦烯 离子，通过四硫富瓦烯在电极上产生的氧 化电流来实现乳酸含量的检测。
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(3)胆固醇电极
胆固醇电极是一种用于临床测定 血清胆固醇含量的电流型酶传感器。血 液中胆固醇约有2／3以酯型存在，1／3 以游离型存在。
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(4）肌酸和肌酸酐电极
脱水
肌酸
肌酸酐
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血清肌酸肝含量测定是衡量肾功能的一 个很好的基准。 血清肌酸酐浓度不会因食物的种类而受 影响，所以做为判断肾脏机能的依据较血清 尿素可靠。 血清肌酸酐浓度与肌肉的量有关，因此
肌肉多的排放的尿肌酸酐浓度会比肌肉少的
多。
肌酸酐水解酶 肌酸酐 H 2O 肌酸 脒基肌酸水解酶 肌酸 H 2O 肌氨酸 脲
肌氨酸 H 2O O2 甘氨酸+HCHO H 2O2
肌氨酸氧化酶
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肌酸和肌酸酐微传感器
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（5）磷酸盐电极
佝偻病 软骨病
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葡萄糖-6-磷酸盐
酸性磷酸酯酶 葡萄糖 + 磷酸
葡萄糖氧化酶
葡萄糖 + O2
葡萄糖酸 + H2O2
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（6）淀粉电极
淀粉酶 淀粉 葡萄糖氧化酶 葡萄糖
葡萄糖 + O2
葡萄糖酸 + H2O2
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（7）乙醇电极
♫ 可用乙醇来制造醋酸、
CH3CH2OH
饮料、香精、染料、
燃料等。
♫ 医疗上也常用体积分
数为70-75%的乙醇作
消毒剂等。
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酒后驾驶
饮酒驾车：指驾驶员血液中的酒精含量大于或 等于20 mg/100 mL小于80 mg/100 mL的驾驶行 为。 350 mL(约相称于1小瓶)啤酒或半两白酒(20 mL)
弗里德里希· 维勒首次使用
无机物质氰酸氨（由氯化 铵和氯酸银反应制得）与
弗里德里希· 维勒 （Friedrich Wohler）
硫酸铵人工合成了尿素。
增高：急性或慢性肾小 球肾炎、肾功能衰竭、 尿路阻塞、尿路肿瘤、 高蛋白质饮食等。
尿素的分子模型
减低：妊娠后期、蛋白 质摄入不足、营养不良 等。
尿素在脲酶作用下发生水解反应
包括药物、抗生素、毒物、抗代谢物以及
酶促反应产物等。
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凡能激活酶活性的物质，均称激活剂。
某些酶必须有激活剂存在，才能进行酶促反
应。激活剂大部分为某些无机离子，也有一
些有机分子。
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二、酶传感器
酶传感器是应用固定化酶作为敏感元 件与各种信号转换器组合而成的生物传感 器。 依据信号转换器的类型，酶传感器大 致可分为酶电极、酶场效应管传感器、酶 热敏电阻传感器、酶压电晶体型、光纤光 学型等。
脲酶 (NH 2 ) 2 CO+H 2 O 2NH 3 +CO 2
可用氨气敏电极、二氧化碳电极等作为基 础电极测定尿素的含量。
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（2）草酸电极
生物体内草酸的来源：
♫ 维生素C代谢
♫ 甘氨酸代谢 ♫ 草酰乙酸水解 ♫ 异柠檬酸降解 草酸（乙二酸）结构式 ♫ 食物摄入：菠菜、茶叶
草酸脱羧酶 草酸
各种型号的血糖仪产品
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（1）早期的葡萄糖传感器 早期的葡萄糖传感器是由葡萄糖氧化 酶膜和电化学电极组成的。在电化学电极 的透气膜上固定葡萄糖氧化酶。
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当葡萄糖溶液与酶膜接触时，发生如下反应：
葡萄糖氧化酶 C6 H12O6 2 H 2O O2 C6 H12O7 2 H 2O2
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自然界中的胆固醇主要存在于动物性食
物之中，植物中没有胆固醇。
兽肉的胆固醇含量高于禽肉，肥肉高于瘦
肉，贝壳类和软体类高于一般鱼类，蛋黄、 鱼子、动物内脏的胆固醇含量非常高。
降低胆固醇的食物：
§ 含膳食纤维丰富的食物
§ VC 与 VE
§ 饮酒可能使血中的高密度脂蛋白升高，
加强防治高胆固醇血症的作用。葡萄酒较合适， 但必须严格限制摄入量。
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葡萄糖氧化酶 C6 H12O6 2 H 2O O2 C6 H12O7 2 H 2O2
故葡萄糖浓度测试方法有三种： 生成的葡萄糖酸 消耗的氧 生成的H2O2
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测量葡萄糖酸Baidu Nhomakorabea葡萄糖传感器：
pH电极和离子敏场效应管测定葡萄糖酸 的量来计算样品中葡萄糖的含量，最低检测 限为10-3 mol／L，灵敏度较低；
两极间外加一定电压，实际测量时，外加 电压控制在电压-电流曲线的平滑部分，即0.70.9V，此时输出电流就与浓度成比例。 阳极反应 H O O 2 H 2e
2 2 2
阴极反应
1 2e 2 H O2 H 2O 2
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1.葡萄糖传感器 葡萄糖传感器是研究最早、开发最成 熟并已市场化的生物传感器，即血糖仪。
每一种酶的催化反应都有适宜的温度 范围和最适温度。
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⑷pH对酶促反应速度的影响 每一种酶都有适宜的pH值范围 和最适pH值。在一定的pH下，酶促 反应具有最高的反应速度，此pH称 为该酶的最适pH。
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⑸抑制剂、激活剂对酶促反应速度的影响 凡能降低酶的活性甚至使酶完全失活 的物质称为抑制剂，抑制剂的种类很多，