细菌染色体DNA G+Cmol%含量测定方法研究进展

动物医学进展,2003,24(1):50-52

Progr ess in Veterinary M edicine

细菌染色体DNA G+C mol%含量测定方法研究进展

李　琳,李槿年,余为一

(安徽农业大学畜牧水产学院,安徽合肥230036)

中图分类号:S852.6 文献标识码:A文章编号:1007-5038(2003)01-0050-03

摘　要:生物体的遗传物质DNA中四种碱基G、C、A、T的排列和比例是DNA特性的决定因素。染色体DNA G+C mol%含量即DNA的碱基组成具有种特异性且不受菌龄和外界因素的影响,成为细菌分类和菌种鉴定的重要指标,其测定方法不断被改进和创新,主要包括纸层析法、浮力密度法、高效液相色谱法、热变性温度测定法(Tm法)和荧光法等,其中T m法操作简便、精确度高、重复性好,最为常用,此法在国外早已发展,在国内也引起越来越多的重视,此法利用DNA的增色效应求T m值(热变性温度), G+C mol%含量与Tm值呈正比例关系。简略比较了测定细菌染色体DN A G+C mol%含量的五种主要方法,具体介绍了Tm法测定细菌染色体DNA G+C mol%含量的原理、测定程序、操作注意事项、G+C mol%含量测定的意义和应用局限性及G+C mol%含量测定方法的前景展望。

关键词:细菌;G+C mol%;测定方法;T m法细菌分类是对细菌进行鉴定、分群、归类、命名。传统的细菌系统分类法主要依据其形态、生理生化特性、抗原性、生态特性等进行表型分类,它存在表达不稳定、敏感性不高等问题。从60年代至今分子遗传学分类法日趋成熟和完善,主要包括DNA碱基组成测定(即G +C%含量测定)、核酸杂交、16Sr RNA测序、PCR指纹图分析、质粒图谱分析和脉冲场凝胶电泳分析等[1-3],此类分类方法直接对细菌染色体DNA或质粒DNA进行分析,使未知细菌属种定位和细菌间种属亲源关系判别由表型指征深化为基因型特征鉴定。

Charg aff等人在50年代发现DNA碱基组成具有种特异性且不受菌龄和外界环境因素影响。据此,Lee 和Belozersky等首先把G+C m ol%作为细菌鉴定的一个重要遗传指标。60～70年代初,国外对细菌的G+C mol%进行了大量研究和报道[4-6],Sto rck系统测定了真菌DNA G+C m ol%,确定G+C mo l%作为真菌分类鉴定的遗传学参考标准之一[7]。国内主要从70年代开始对细菌[8-10]、真菌等微生物的DNA G+C mol%进行了测定,80年代中期至90年代初人们又分别对衣原

收稿日期:2002-07-15

作者简介:李　琳(1978-),女,安徽省合肥市人,安徽农业大学畜牧水产学院预防兽医学研究生,主要从事微生物与免疫学研究工作。体、立克次氏体和蚤类等的DNA G+C mol%进行了研究。目前DNA G+C mo l%含量测定已广泛用于微生物鉴定中,测定方法也不断加以改进,现将其研究进展综述如下。

1　G+C mol%含量测定方法

1.1　纸层析法

纸层析法是最早测定DNA G+C mol%的方法,它是利用层析滤纸上吸附的水作固定相,有机溶剂作流动相,不同碱基在两相间分配系数不同,因此在滤纸上移动距离不同而得以分离,但该法准确度低。

1.2　浮力密度法

60年代初人们开始使用浮力密度法测定G+C mol%含量,其原理是:CsCl超速离心时形成密度梯度区带,DNA在其中的浮力密度与其G+C mol%含量呈正比[11],利用公式 =1.66+0.098%(G+C)即可求DNA G+C mo l%含量,但此法需使用超速冷冻离心机作长达44h的离心且CsCl试剂昂贵。

1.3　高效液相色谱法

高效液相色谱[12-14]是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次的交换过程,它借溶质在两相间分配系数、亲和力、离子交换或分子大小不同使不同溶质分离。高效液相色谱的流动相叫冲洗剂、洗脱剂或载液,样品随流动相进入色谱柱,分配系数小的不易被流动相滞留,流出色谱柱较早,分配系数大的在固定相上滞留时间长,较晚流出色谱柱,因此一个多组分混合物按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱得以分离。高效液相色谱按固定相性质的不同分为六类:体积排阻色谱(又称凝胶过滤色谱)、离子交换色谱、亲合色谱、高效聚焦液相色谱和化学键合相色谱,化学键合相色谱又分两类:正相液相色谱和反相液相色谱,前者固定相为极性基团(氰基、氨基、双羟基等),流动相为非极性或极性较小的溶剂,极性小的组分先出峰,极性大的后出峰;后者固定相为非极性基团,如十八烷基(C18)、辛烷基(C8)、甲基、苯基等,流动相为强极性溶剂,如水、醇、乙腈或无机盐缓冲液,极性大的组分先出峰,极性小的后出峰,DNA、RNA、蛋白质、多肽等的分离和制备多采用反相液相色谱,它是高效液相色谱中应用最广的一种分离模式。高效液相色谱从70年代开始用于DNA 碱基的分离,DNA样品随流动相进入色谱柱后,四种碱基A、T、C、G依次分离形成四个峰,每种标准碱基的保留时间作为谱峰自动识别的依据,根据每种待测碱基的光吸收强度和谱峰面积分析结果。高效液相色谱法快速、灵敏、准确、所需样品少,但仪器精密、昂贵且所提细

菌DNA必须高度纯化,限制了普通实验室应用。高效液相色谱法是根据多组分混合物在固定相和流动相分配系数不同先后流出色谱柱而得以分离,此法在DNA 高度纯化的基础上测定的G+C m ol%准确可靠,结果稳定,适于细菌分类研究。

1.4　热变性温度(T m)测定法

1961年国外学者M armur J最先使用T m法进行G+C mo l%含量的测定,该法是最普遍使用的G+C mol%含量测定方法,具有稳定、重复性好、准确度高、仪器较易解决(只需带加热装置的紫外分光光度计即可)等优点。

1.4.1　T m法测定G+C mol%的原理　DNA双螺旋在一定离子强度和pH缓冲液中不断加热时,碱基对间的氢键断裂使DNA双链(天然构型)打开逐渐变成单链(变性构型),导致核苷酸在260nm处的紫外光吸收值明显增加(增色效应),当双链完全变成单链后,紫外光吸收值停止增加,紫外光吸收值增加的中点所对应的温度即为热变性温度(m elting temperature,Tm)。DNA由A-T和G-C两碱基对组成,具有三个氢键的G-C比具有两个氢键的A-T碱基对结合更牢,热变性过程中打开氢键所需的温度更高,因此DNA样品的Tm值直接取决于样品中G-C碱基对的绝对含量。利用增色效应测定T m值,带入特定公式可求出不同细菌DNA的G+C mol%含量。

1.4.2　Tm法测定细菌DNA G+C m ol%的基本程序和注意事项　细菌扩大培养、细菌破壁、细菌染色体DNA提取、DNA纯度和含量检测、测定T m值、计算G +C mol%。

1.4.

2.1　细菌的扩大培养　主要采用LB培养液振荡培养(200r/min)24h扩大培养细菌。

1.4.

2.2　细菌破壁方法　细菌破壁是成功提取DNA 的关键步骤之一。革兰氏阳性菌的肽聚糖层构成坚韧的三维立体结构,而阴性菌肽聚糖层构成疏松的二维结构,因此不同种类细菌的破壁方法不同。目前破壁方法有十二烷基磺酸钠(SDS)裂解法、溶菌酶法、反复冻融法、研磨法、超声波法等。不同细菌对溶解剂有不同的抗性,溶解细菌前需先取少量菌悬液,加一定浓度的溶解剂,看是否能溶解菌体。若SDS和溶菌酶均能溶解菌体,最好使用既廉价又能抑制DNase的SDS;若需用溶菌酶应加入SDS促进溶菌;如果60℃溶菌过程缓慢,可将温度提高到70～75℃;有些菌也可用脱氧胆酸盐破裂细胞膜溶解菌体。对溶解剂有抗性的菌类,可在含青霉素或甘氨酸的培养基中培养,使其不形成细胞壁。如SDS和酶破壁效果不理想,可同时用反复冻融、超声波或氧化铝和玻璃粉研磨辅助破壁。

1.4.

2.3　细菌染色体DNA提取和纯化　提取细菌染色体DNA常采用苯酚氯仿混合提取法。纯化DNA有密度梯度离心、羟基磷灰石柱层析、凝胶电泳及分子杂交等方法。提取DNA过程中应注意: 提取DN A时溶菌液浓度要合适。如浓度太低,提取过程中DNA损失较大;浓度太高,第一次脱蛋白的混悬液中出现凝块,离心时进入中间层而丢失。 乙醇沉淀出的DNA再溶解时,缓冲液浓度要合适。浓度过低,引起DNA降解,浓度过高,处理和分散均有困难。 有些菌含大量多糖,溶菌液粘度特别高,则需在脱蛋白前或在DNA提取的最后步骤用异丙醇(选择性沉淀DNA)将多糖除去。 如提取过程必须暂时中断,最好在脱蛋白时将未离心的混悬液放入冰箱中; 如使用溶菌酶破壁,可用玻棒搅出DNA丝状沉淀,如使用超声波破壁,须离心收集DNA 沉淀; 提取DNA最少用菌量为2g湿菌体,菌体量增多时,所用试剂应相应增加。

1.4.

2.4　DNA纯度和含量检测　提取的DNA采用紫外分光光度法测定其OD260、OD230、OD280比值,结合琼脂糖凝胶电泳检测其纯度;DNA含量测定使用紫外分光光度法。

1.4.

2.5　测定T m值和计算G+C mol%[15-16]　DNA 适当稀释后置带加热装置的紫外分光光度计中完成热变性,根据变性过程中各温度和对应的相对吸光度绘制成DNA热变性曲线,热变性曲线中点的温度即为T m 值;所测T m值带入特定公式即可计算出细菌染色体DNA G+Cmol%含量。实验室常使用的参比菌株是大肠杆菌K12[17](51.2%G+C),若测定的大肠杆菌K12 Tm值为90.5℃,使用公式:

1SSC%G+C=(Tm-69.3)×2.44

0.1SSC%G+C=(T m-53.9)×2.44

若Tm值为其它时,使用公式:

1SSC%G+C=

51.2+2.44(T m未知菌-T m大肠杆菌K12)

0.1SSC%G+C=

51.2+2.08(T m未知菌-T m大肠杆菌K12)

对T m值的主要影响因素是溶液中的离子强度。测定T m值必须精确配制缓冲液的浓度,测定高T m值(92℃以上)时,可通过改变缓冲液浓度,如由1SSC改用0.1SSC(T m约降低16℃),或使用不同的缓冲液,如磷酸盐缓冲液(约降低20℃)来克服测定的困难。

1.5　连续荧光检测法(荧光法)

90年代发展起来的连续荧光检测法(荧光法)[18-19]也是T m测定法的一种,它是应用双股DNA结合染料(SYBR Green1)和能够快速升降温度的连续荧光检测仪测定细菌染色体的T m值,根据相应公式算出G+C mol%,此法简便快速且不受DNA纯度影响,适用于临床微生物的快速诊断。

2　DNA G+C mol%含量测定法在细菌分类鉴定中的意义

生物体的遗传物质DNA中四种碱基G、C、A、T的比例和排列顺序是决定DNA特性的关键因素,它代表着生物的遗传信息,决定生物的种类,每种生物都有其特定的G+C mol%含量,动植物的G+C m ol%集中在35%～40%,细菌的G+C m ol%变动幅度达25%～75%,因此G+C mo l%含量测定更适合于细菌的分类

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李　琳等:细菌染色体DN A G+C mol%含量测定方法研究进展