蛋白质的分离纯化1

这些影响因素在蛋白(包括表达蛋白)纯 化的整个过程中必需给予足够的重视.
pH值

缓冲液的pH对于成功提纯蛋白尤为重要

缓冲液可以抗衡蛋白质溶液中pH值的改变
一般地，纯化过程中的pH值要远离其等电点pI
的稳定范围内 酸性的蛋白 pH > 7可溶;
碱性蛋白组pH < 7可溶; 中性蛋白在偏离其等电点时可溶
可加速蛋白的失活.
二硫苏糖醇(DTT) 储液—— -20℃
0.5-5.0mmol/L
Tris (2-carboxyethyl) phosphine
TCEP
蛋白酶抑制剂 （Protease inhibitors）

蛋白酶在动物组织及微生物中很普遍。 分离蛋白在较低的温度条件下（如4℃ ） 抑制剂的选择取决于何种蛋白酶的存在， PMSF(苯甲基磺酰氟)——对抗丝氨酸蛋白酶;

蛋白的溶解性依赖于离子强度

高离子强度可造成蛋白的聚集或沉淀 低离子强度能影响酶的稳定性


一些蛋白对一定的离子(Na+, K+, Cl-, SO42-)有选择性（偏好性） 0.1-0.2mol/L NaCl or KCl模拟生理状 况下的离子强度.
还原剂(Reducing agents)

细胞碎片
Total Proteins
非目的蛋白
Analytical Tests
理论上, 盐析时需要的盐的量直接与蛋白表面的电荷及非离 子的极性氨基酸相关. 沉淀想要的蛋白,必需的(NH4)2SO4的浓度源于实验的经验值. 一般地, 蛋白越大, 需要沉淀蛋白的盐浓度越低.
有机溶剂沉淀
(Precipitation With Organic Solvents)
•极性的有机溶剂,如:脂肪族的 醇类及酮类, 降低蛋白的溶解性. 方式 1. 减少蛋白表面的水化层和增加疏水性的表面 促进聚集. 2.降低溶液的介电常数 降低蛋白的溶解性. •最常用的有:甲醇, 乙醇, 丙酮及聚乙二醇.
1.1 蛋白质(Proteins)的概念 1.2 蛋白质的理化特性 1.3 其它
1.1 蛋白质 （Proteins）

蛋白质由二十种标准氨基酸组成. 所有的氨基酸均有一共同的中心结构（α-碳原子）,并由
肽单位形成蛋白质的骨架.

氨基酸的侧链可以是非极性的，极性的，或者带电荷的.
Ala Val Ile Pro Phe Trp Met Gly Ser Thr Cys Tyr Asn Gln Lys Arg His Asp Glu
去污剂能使蛋白变性而且 在细胞破碎以后必需除去.
压力破碎 （French Press）
细胞放在不锈钢的容器
中.压力破碎器配有一
合适的活塞,其在高压
下迫使细胞挤破后通过
底部的小孔.
匀浆(Homogenization)
细胞被置于一密闭的容器中
(常为玻璃).匀浆器配有一
非常合适的插头,通过其上
下及左右的往复运动来破碎
3. 蛋白质分离、纯化方法





离心(Centrifugation) 过滤(Filtration) 沉淀(Precipitation) 色谱(Chromatography) 电泳(Electrophoresis)∯
∯: 常用于小规模（分析目的）制备
策
略
从有机体中获得纯的蛋白 尽可能的用较少的步骤 尽可能少的丢失活力
此，必须小心，以免发生错误或变性你的蛋白。

应当在buffer所使用的温度下调节溶液的pH值
eg. Tris buffer
25℃
0℃
Biblioteka Baidu
pKa
pKa
8.06
8.85
•保证缓冲液能与后续的过程（比如色谱）相容
•已知较好的非常有用的缓冲液(HEPES, PIPES, etc)。
离子强度（Ionic strength）

虽然很多蛋白质（水溶性的球蛋白）其大部分的 极性侧链基团（亲水基团）折叠在外部，但是其 表面仍有部分的疏水性区域。
1.3 其它
蛋白质是细胞生物功能的执行者 酶
细胞内外物质的运输
结构支撑物
免疫系统
细胞与细胞以及细胞与外界环境信息传递
2. 蛋白质分离、纯化的目的






活力的生化分析 蛋白的翻译后修饰（Post-translational modifications) 相互作用和蛋白的装配(Interactions and assembly) 三维结构(3-dimensional structure) 生物功能分析(Analysis of biological function) 药物开发(Drug development) ------
破碎细胞 沉淀 (丢弃)
上清 离心
细胞裂解
细胞裂解物： 蛋白,核酸及小分子
不需要的分子
多步纯化
纯蛋白
从组织细胞中进行蛋白分离流程图
组织破碎(Tissue disruption)


除去不要的组织 搅碎 匀浆（homogenization） 研磨(vessel for extraction)



有关组织提取的影响因素



Buffer（缓冲液）pH值 inoic strength（离子强度） reducing agents（还原剂） protease inhibitors（蛋白酶抑制剂） Temperature（温度） tissue disruption（组织的破碎方式）

当一个水溶性的混合物在受到离心力时,较 大的及密度较重的成份沉淀得较快
F = m ω2r

低速离心常用于分离完整的细胞 高速离心能用于分离亚细胞成份 冷冻高速离心机常用于分离蛋白成份.

离心机(尤其是可控低温高速离心机)价格 昂贵,且运行时有一定的危险性,请小心使 用!
固定角度离心机 (Fixed-Angle Centrifugation)
•丙酮,乙醇及甲醇也是非常好的脂溶性的溶剂
而被经常用在脱脂处理, 这些脱脂处理常常先
于蛋白的纯化.
•主要的不足之处——常导致蛋白的变性 • 聚乙二醇的运用可以克服这一不足.
等电点及pH沉淀
(Isoelectric Point and pH Precipitation).
•蛋白在与其pI相同 的pH环境中有最低的 溶解性

避免极端的pH

造成蛋白化学成分的改变

高pH

一些氨基酸残基（Gln and Asn）的脱氨作用 丝氨酸及苏氨酸（Ser and Thr）残基的β－消去反应 肽键的部分水解 引起蛋白的沉淀及变性。 修饰的磷酸基团丢失.

低pH

缓冲液

选择一种缓冲液使其可以有效的覆盖想要pH范围。 一些缓冲液（如Tris-HCl）的pH可以发生改变。对

重组蛋白基因在大肠杆菌， 昆虫细胞， 哺乳动物细胞 或植物细胞中表达。

也用差速离心及色谱方法纯化。

在重组的蛋白中可以添加‘Tags’以便于纯化。
3.1
蛋白质粗分离:(I)从细胞和组织
——提 取
了解有关蛋白的必备知识
哪个物种合适？ 丰度及活力特点 大小，成本及物种的可获得状况 哪个组织合适? 对于特定的细胞哪个组织丰富 组织中哪种细胞中有这类蛋白 纯化过程中的作为应该与特定的方案相关 非常有益的信息 大小 组成
细胞.
超声(Sonication)
超声波发生器可直接浸 入到细胞悬浮物中,超 声波发生器会经振动发 出高频率的声波而使细 胞破碎.
3.2
初步纯化
热
•不同的蛋白有 不同的热稳定 性,且有些蛋白 可以在热变性 以后再复性.
天 然 结 构
变
性
一般蛋白
钙调蛋白是能通过热变性而获得纯化的一个很好例子
(%) 0
等电点沉淀能富集特定pI值的蛋白

相同pI值的分子可以聚集 反应由两个因素引发

疏水相互作用 偶极子相互作用
通过透析从而到达溶质交换-除去沉淀剂
•有各种不同截留分子量的透析膜——(3-100 kDa cut off).
•商业上也有到达脱盐及浓缩的离心透析装置
离心(Centrifugation)
盐析 ——在高浓度时, 由于盐与H2O竞争结合蛋 白,添加盐常降低蛋白的溶解性 高盐会除去球形蛋白的溶剂分子从而造 成盐析(蛋白沉淀).

硫酸铵沉淀 （Ammonium sulfate precipitation ）
利用盐破坏离子相互 作用,且促进蛋白表面 的疏水相互作用
盐溶、盐析 (Salting in / Salting out)
钙调蛋白
温度 (℃)
100
•一般的, 较小的, 荷电较高的蛋白比较大的, 疏水性较高的蛋白在较高的温度下更稳定.
盐溶、盐析
(Salting in / Salting out)

盐溶

在低浓度时, 由于盐能屏蔽蛋白之间的电荷
-电荷相互作用,添加盐通常会增加荷电分子
的溶解性。
低盐防止蛋白的沉淀,聚集.
每个蛋白与盐浓度的相关溶解性曲线不尽相同 : Log S(mg/ml) = - Ks(ionic strength/2) ——Ks and are constants.
盐溶、盐析 （Salting In and Salting Out）
不同的盐对于蛋白的溶解性会有不同
(NH4)2SO4是蛋白盐析时最常用的试剂.
细胞破碎(Cell Disruption)

化学破碎: 碱, 有机溶剂,去污剂 酶学手段: 溶菌酶, 葡聚糖酶,几丁质酶(常 适用于含细胞壁的细菌及植物细胞) 物理方法: 渗透压震荡, 冻溶 机械方法: 超声,匀浆,湿磨,压力

化学破碎（Chemical Disruption）
去污剂,如: Trition X100 能溶解细胞膜而使蛋 白透过细胞.
水平离心机 (Swinging-Arm Centrifugation)
差速离心(Differential Centrifugation)
For example:
超滤(Ultrafiltration)
离心超滤
压滤
3.2 蛋白质(粗)分离:(II)表达蛋白
用生物信息学方法选定目标蛋白 及相应的DNA文库或cDNA文库 设计,合成PCR引物并从相应文库中进行PCR N
从哪儿开始?

细胞与组织(材料来源有限，但是蛋白是天然 的状态)。

折叠均一, 可溶（主要指非膜蛋白）； 可通过差速离心分离细胞组份； 纯化可用色谱方法（chromatography）。
从哪儿开始?

cDNA克隆（为目前蛋白来源的主要方法，但是蛋白 易形成包涵体（inclusion body））
高级生物化学
——蛋白质的分离纯化（I）
邱晓挺
qiuxiaoting@nbu.edu.cn
1. 蛋白质的背景介绍
2. 蛋白质分离、纯化的目的
3. 蛋白质(粗)分离:
(I)从细胞和组织 ——天然蛋白的提取
(II)表达蛋白的提取 4. 蛋白质的纯化－色谱(液相) Chromatography
1. 背景介绍
EDTA ——对抗金属蛋白酶;
pepstatin ——对抗胃蛋白酶; 巯基蛋白酶用较高浓度的还原剂来封阻.
温度(Temperature)

蛋白质在低温（0 ℃ ）时最稳定。 提升温度 升高10 ℃, 酶反应速度会增加一倍.超
过30-40 ℃, 蛋白质极不稳定,大多数蛋白质易失
活.

一般地，蛋白在20-40 ℃较之于低的温度有更高 的溶解性。

氧化作用会发生.半胱氨酸,甲硫氨酸及 色氨酸的氧化. 巯基还原剂经常被应用(1-10mM)



β-巯基乙醇（ β-mercaptoethanol） 二硫苏糖醇(DTT) 还原型的谷胱甘肽（Glu-Cys-Gly） TCEP
β-巯基乙醇: 5-20mmol/L , 储存液——4℃ !! 在加入buffer中24h内, β-巯基乙醇被氧化.其后
回收PCR产物并将基因克隆至表达载体
提取表达载体进行酶切鉴定是否含目的基因
Y 将表达载体转化至表达菌株 诱导表达目的蛋白
Harvest Cells
培养介质
Cell Disruption
Centrifugation Filtration Enzymatic Chemical Physical
Purification Steps Pure Protein

蛋白可以折叠为一特定的形状或者保持一定的 柔性。

多数蛋白的密度在1.3－1.4g/cm3 细胞经常添加磷酸基团,糖基及酰基等到侧链 上以改变蛋白的形状及活性。

1.2 蛋白质的理化特性

每个蛋白质均有特定的等电点. 由其可解离的侧链基团所决定——在一定的pH值 下，每个蛋白的荷电状况不尽一致