基因表达系统大肠杆菌表达系统
大肠杆菌表达系统
大肠杆菌表达系统总结随着分子生物学和蛋白组学的迅猛发展，外源基因表达的遗传操作技术日趋成熟。
表达系统是外源基因表达的核心，常用表达系统一般为模式生物，包括真核表达系统和原核表达系统，其中真核系统包括了哺乳动物细胞表达系统、植物体表达系统、昆虫杆状病毒表达载体系统以及酵母表达系统，原核表达系统则主要为大肠杆菌表达系统。
大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统，也是最早进行研究的外源基因表达系统，其遗传学背景清晰、生长快、较易实现高密度培养、成本低、产量高，相较于其它表达系统具有难以比拟的优越性，是商业生产中应用最广泛的表达系统，取得了巨大的科研价值和经济效益。
大肠杆菌表达系统目前广泛应用于表达生产多种蛋白质/多肽类药物和生物化学产品，包括：重组人胰岛素、a2b型干扰素、兰尼单抗、紫色杆菌素和牡丹皮葡萄糖苷等。
据统计，1986-2018年由美国FDA和欧洲EMA批准上市的重组蛋白类药物中有26%来自于大肠杆菌。
与此同时，目前通过大肠杆菌表达的基因工程疫苗也进入市场或处于临床实验阶段，如戊型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、流感A型疫苗等。
常见的大肠杆菌表达系统有BL21系列、JM109系列、 W3110系列和K802系列等，其中大肠杆菌 BL21（ DE3）菌株是目前应用于重组蛋白表达研究最广泛的菌株之一，BL21（DE3）是由大肠杆菌B系列与K-12系列的衍生菌株通过 P1 转导等遗传突变获得的。
该类菌株通常为宿主蛋白酶缺失型，以保证外源蛋白在表达过程中不被降解，维持表达的稳定性。
大肠杆菌表达系统在商业生产中具有巨大的优越性和价值，但建立高效匹配的表达系统是实现商业价值的关键，包括宿主菌、外源基因、载体的选择与匹配。
宿主菌的选择是第一步，对表达活性和表达量影响很大，理想的宿主菌株是蛋白酶缺陷型，避免蛋白酶过多引起的产物不稳定，常见的蛋白酶缺陷型菌株为BL21系列菌株。
其次是外源基因，外源基因决定了是否可获得目的产物，原核基因可在大肠杆菌中直接表达，而真核基因不能再大肠杆菌中直接表达。
真核基因在大肠杆菌中表达
增强子：特殊的序列元件，能显著增强外源 基因的表达效率。
翻译终止子：必须存在终止密码子。
✓ 构建表达载体时通常装上全部的三个终止密码子 (UAA,UGA,UAG)，以阻止核糖体的跳跃现象。
✓ 大肠杆菌最偏爱的密码子：UAA ✓ 当为四联核苷酸UAAU时，终止效率进一步增强。
真核基因在大肠杆菌中表达
翻译起始序列：决定mRNA翻译起始效率。
未鉴定出其保守结构，只能采取一些方法降 低mRNA 5’-末端二级结构的形成，增加RBS中A、 T含量，碱基定点突变等。
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中表达
目前常用的表达系统
细菌（大肠杆菌）、酵母、昆虫细胞、植物 和哺乳动物细胞等
真核基因在大肠杆菌中表达
大肠杆菌表达系统的优越性
➢ 背景清楚，特别是对其基因表达调控的分子机 理研究的比较深入。
➢ 安全(被FDA批准为安全的基因工程受体生物)， 且有多种不同的菌株和质粒载体。
➢ 已有许多真核基因在大肠杆菌中实现高效表达。 ➢ 培养方便、操作简单、成本低廉，因此易于进
物使外源基因获得表达，如IPTG、温度等。
真核基因在大肠杆菌中表达
转录终止子（TT）
✓ 上游启动子会抑制下游启动子 的转录功能(启动子封堵作用)， 因此需要在克隆基因编码区的 3’-末端接上一个有效的转录终 止子。
✓ 转录终止子能增强mRNA分子 的稳定性，从而提高蛋白质产 物的水平。
真核基因在大肠杆菌中表达
真核基因在大肠杆菌中的表达
真核基因在大肠杆菌中表达
内容提纲
第4章 基因在大肠杆菌和酵母中的表达
降低包含体形成的措施： 降低培养温度；诱导物浓度； 培养基中加入添加剂；培养基组分、pH等。
包含体复性方法： 尿素； 透析、稀释和超滤复性法； PEG、TritonX、肝素、人工伴侣等
原核表达系统的优点与不足
优点：
产量高、表达高效； 操作简单（可调控表达、方便纯化）； 可大规模发酵生产； 成本低。
不足：
缺乏真核中的修饰系统，产物有时缺乏活性。 表达产物易形成包含体。
第二节 真核表达——目的 基因在酵母中的表达
酵母菌表达外源蛋白的优点：
遗传背景清楚 属真核模式生物，具备蛋白质翻译后加 工系统 可发酵生产 不产生内毒素，属安全的表达系统
2
ü 优点： 1. 由于周质中蛋白质种类比较少，因此目标
蛋白质的纯化就比较简单
2. 蛋白质酶解的程度不甚严重
3. 促进了二硫键的形成及蛋白质的折叠作用 （氧化环境）
4. 蛋白质的N-末端结构真实
正确折叠的蛋白质，在转运过程中，在 体内对信号肽进行切割
五、包含体及复性
包含体（inclusion body）：蛋白质在大肠杆菌中 大量表达时，在胞内聚集形成不可溶的、没有生物 活性的固体颗粒。
T7 RNA聚合酶/T7启动子的优点：
合成RNA的速度高；
只识别T7启动子，不启动其它基因的转录；
对利福平（能抑制大肠杆菌RNA聚合酶）等抗 生素有抗性，能表达一些大肠杆菌RNA聚合酶 不能转录的序列；
产物量大，可达总蛋白的25％以上。
1
94kDa 67 kDa 43 kDa
大肠杆菌中的基因表达
PL 和 PR 表达系统
宿主菌中没有 cI 基因产物，PL、PR 启动子的高强度直接转录，带有PL
或 PR 启动子的表达载体在普通大肠杆菌中相当不稳定。
对宿主菌的要求
用溶源化 l 噬菌体的大肠杆菌作 PL、PR 启动子表达载体的宿主菌
N4830-1，POP2136 等菌株已经溶源化 cI 857(ts) l 噬菌体， 可用作表达外源基因时的宿主菌。 把 cI 857(ts) 基因组装在表达载体上 宿主菌选择范围更大
cAMP激活CAP，CAP–cAMP复合物与 lac 操纵子上专一位点结合
后，能促进 RNA 聚合酶与 –35、–10 序列的结合，进而促进 Plac
介导的转录。
基因工程中使用的 lac 启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即 Plac UV5
cAMP
CAP lacI
RNRANA 聚聚合合酶酶
Plac
二、大肠肝菌中的基因表达
2. 影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素
（3）表达产物的稳定性： 组建融合蛋白； 利用信号肽； 特异性突变； 位点特异突变，改变二硫键位置； 宿主蛋白酶缺陷。
二、大肠肝菌中的基因表达
2. 影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素
（4）细胞的代谢负荷： 细胞大量生长时，抑制外源基因的表达； 宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开；
二、大肠肝菌中的基因表达
2. 影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素
（1）外源基因的拷贝数：与载体在宿主中的拷贝数直接相关。 （2）外源基因的表达效率：启动子的强弱，SD序列和ATG的间距等。
A、启动子的强弱：目的基因插入表达载体启动子的下游，可增加
基因的表达。lac、trp、 tac、bla。
B、核糖体结合位点的有效性 C、SD与ATG的间距：影响非融合蛋白的合成水平 D、密码子组成：设计引物或合成基因时选择大肠杆菌“偏爱”的密码
基因工程3大肠杆菌表达系统
生物农药实例
利用基因工程3大肠杆菌表达系统生产Bt蛋白 （Bacillus thuringiensis），该蛋白对多种
鳞翅目害虫具有毒杀作用，可有效防治棉花、 水稻和玉米等农作物的虫害。
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物燃料领域的应用
生物燃料
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物燃料领域的应用主要涉及生产生物柴油、生物氢等 可再生能源。通过在大肠杆菌中表达特定的外源基因，可以获得具有催化活性的酶，用
安全性问题
针对安全性问题，应加强监管和规范操作，确保基因工程3大肠杆菌表达系统的安全性 和可靠性。
基因污染
为避免基因污染，应加强基因工程3大肠杆菌表达系统的封闭式生产，并采取有效的检 测手段，确保产品的安全性和可靠性。
基因工程3大肠杆菌表达系统在未来的应用前景
生物制药
基因工程3大肠杆菌表达系统有望在生物制 药领域发挥重要作用，用于生产重组蛋白、 抗体、疫苗等生物药物。
利用基因工程3大肠杆菌表达系统生产重组 人胰岛素、生长激素、干扰素等蛋白质药物， 这些药物在临床治疗中发挥了重要作用。
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物农药领域的应用
生物农药
基因工程3大肠杆菌表达系统在生物农药领 域的应用主要涉及生产具有杀虫、杀菌或除 草功能的蛋白质。通过在大肠杆菌中表达特 定的外源基因，可以获得具有生物活性的蛋 白质，用于防治农作物病虫害和杂草。
工业生产
基因工程3大肠杆菌表达系统在工业生产领域具有 广泛的应用前景，可用于生产酶、生物材料、生物 燃料等产品。
农业领域
基因工程3大肠杆菌表达系统在农业领域的 应用前景广阔，可用于改良作物品种、提高 抗逆性、增加产量等方面。
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原核大肠杆菌蛋白表达
原核大肠杆菌蛋白表达系统是一种常用的表达系统，它基于细菌细胞（通常为大肠杆菌）对外源基因的转录和翻译过程。
在表达载体中，包含有启动子、激活子和选择子等元件，这些元件使得外源基因能够被细菌细胞识别、转录成mRNA，并通过翻译过程合成目标蛋白。
大肠杆菌表达载体的要求如下：
1. 操纵子以及相应的调控序列，因为外源基因产物可能会对大肠杆菌有毒害作用。
2. SD序列，即核糖体识别序列，一般SD序列与起始密码子之间间隔7\~13bp翻译效率最高。
3. 多克隆位点以便目的基因插入到适合位置。
此外，目的基因在大肠杆菌表达体系中要表达的基因即外源基因，包括原核基因和真核基因。
原核基因可以在大肠杆菌中直接表达出来，但是真核基因含有内含子不能直接表达，大肠杆菌不能对mRNA进行剪切，从而形成成熟的mRNA，所以真核基因一般以cDNA的形式在大肠杆菌表达系统中表达。
同时还需要提供大肠杆菌能识别的且能转录翻译真核基因的元件。
以上内容仅供参考，如需更多信息，建议查阅相关文献或咨询生物学家。
分子生物学研究策略-基因表达技术
2）理想乳酸菌表达载体的特征： 1、稳定的遗传、传代能力（复制子） 2、具有显性的转化筛选标记（Emr ） 3、启动子的转录是可以调控 4、具有多克隆酶切位点
3）研究进展 （1）食品发酵方面的应用
（2）乳酸菌菌种鉴定 REA （Restriction Endonuclease Analysis） 16S rRNA （PCR ）
真核基因在不同表达系统的表达
表达白细胞介素IL-3(成熟蛋白)
大肠杆菌表达系统
20-30u
地衣芽孢杆菌表达系统 250-300u
酵母菌表达系统
20u
哺如动物细胞
2u
2、芽胞杆菌表达系统（Gene
Expression system in Bacillus）
1）特点
枯草芽孢杆菌是非致病的土壤微生物，严格生 长在有氧条件下。
SDS-PAGE
（3）抗微生物和食品腐败
（4）细胞表面层和外多糖
利用生物异构化方法从亚油酸生产具有生理活性的共轭 亚油酸（CLA）异构体单体。筛选到一株产生9顺,11反 共轭亚油酸的乳杆菌L1，建立了亚油酸制备技术，CLA 小试发酵工艺，共轭亚油酸的HPLC纯化分离和毛细管 电泳鉴定技术。
蛋白的转位和穿膜
链霉菌中蛋白的转位与穿膜机制尚未搞 清，如将IL-2与tendamistat信号肽融合， 在链霉菌中只有1/20翻译产物转位 （translocation）至培养基和积累在胞内。
5）影响链霉菌中基因表达的因素
（1）启动子对外源基因表达的影响 （2）信号肽对外源蛋白分泌的影响 A、信号肽N末端氨基酸序列正电荷数对
3、选择性标记不得选用各种抗生素抗性标记。 应选用食品级的标记基因，如糖类利用标记、 营养缺陷型标记等；
基因工程3大肠杆菌表达系统
• 制备用于电转化的感受态细胞相对容易。 当细菌长到对数中期，冷却、离心，然后用
冷却的去离子水反复清洗，最后用10%甘油重 悬细胞，使其浓度为31010细胞/毫升，在干冰 或液氮中速冻后置于-70 ℃贮存。
• 转化必须在0-4 ℃下进行。 如果在室温下操作，转化效率会大大降低。
四、克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达
大肠杆菌中表达体系的不足：
1. 真核基因，在结构上同原核基因之间 存在着很大的差别。
2. 真核基因的转录信号同原核的不同。
细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启 动子；外源基因可能含有具大肠杆菌转 录终止信号功能的核苷酸序列。
3. 真核基因mRNA的分子结构同细菌的 有所差异，影响真核基因mRNA稳定性。
操作步骤： （1）将处于对数生长期的新鲜培养物（0.5-0.6OD)，于4℃, 4000转/分钟离心10分钟，回收细菌细胞； （2）将细胞用0℃的2溶液重新悬浮细胞沉淀，以诱导细胞 感受态产生； （3）加入适量的DNA后，于42 ℃热处理90秒； （4）将混合物快速转移到冰浴中，是细胞冷却1-2分钟，加 入适当的培养基在37 ℃培养45分钟，使细胞复苏，并表达 质粒所携带的转化基因； （5）选择培养基培养，选择转化体。
§ 重组操作时， N-端增加一个增加稳定性的氨基酸
（3）表达天然的蛋白质
以形成融合蛋白的形式在大肠杆菌细胞中 表达外源真核基因具有许多方面的优越性。 例如，产物比较稳定，可以免受胞内蛋白酶 的降解作用，可以获得较高的产率。
Tacon等人在80年代初期，使用大肠杆菌的 trp启动子和与之相连的SD序列，构建了两种 有利于表达天然蛋白质的质粒载体。pWT551 和pWT571
（2）结构决定因子与蛋白质的稳定性
大肠杆菌表达系统的研究
大肠杆菌表达系统的研究大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早，目前应用最广泛的经典表达系统。
大肠杆菌表达系统的发展历史可追溯到二十年前，Struhl等（1976）、Vapnek等（1977）和Chang等（1978）分别将酿酒酵母DNA片段、粗糙链孢霉DNA片段和哺乳动物cDNA片段导入大肠杆菌，引起其表型的改变，证明了外源基因在大肠杆菌中可以使现有功能的活性表达。
这些研究工作为大肠杆菌表达系统的发展奠定了理论基础。
Guarante等（1980）在Science杂志上发表了以质粒、乳糖操纵子为基础建立起来的大肠杆菌表达系统，这一发展构成了大肠杆菌系统的雏型。
随着80年代后期分子生物学技术的不断发展，大肠杆菌表达系统也不断得到发展和完善。
与其它表达系统相比，大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点。
在基因表达技术中占有重要的地位，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。
1 表达载体大肠杆菌质粒是一类独立于染色体外自主复制的双链、闭环DNA分子，大肠杆菌质粒可分为结合转移型和非结合转移型两种，非结合转移型质粒在通常培养条件下不在宿主间转移，整合到染色体上的频率也很低，具有遗传学上的稳定性和安全性。
又因其大小一般在2－50kb范围内，适合于制备和重组DNA的体外操作，因此几乎所有的大肠杆菌表达系统都选用非结合转移型质粒作为运载外源基因的载体，这些表达载体通过对天然质粒的改造获得。
理想的大肠杆菌表达载体要求具有以下特征：（1）稳定的遗传复制、传代能力，在无选择压力下能存在于大肠杆菌细胞内。
（2）具有显性的转化筛选标记。
（3）启动子的转录是可以调控的，抑制时本底转录水平较低。
（4）启动子的转录的mRNA能够在适当的位置终止，转录过程不影响表达载体的复制。
（5）具备适用于外源基因插入的酶切位点。
复制子、筛选标志、启动子、终止子和核糖体结合位点是构成表达载体的最基本元件。
大肠杆菌表达系统课件
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3
使用表达优化后的载体，提高表达效率
改进方案提出与实施效果评估
01
02
03
优化培养条件和诱导策 略
调整诱导剂浓度、诱导 时间和温度等参数
使用分阶段诱导策略， 降低蛋白表达速度，促
进正确折叠
改进方案提出与实施效果评估
01
引入伴侣蛋白和辅助因子
02
共表达伴侣蛋白，促进蛋白正确折叠和组装
03
添加辅助因子，提高蛋白稳定性和溶解度
大肠杆菌表达系统实例分析
成功案例展示及经验分享
案例一：高效表达目 标蛋白
优化诱导条件和培养 参数
选择强启动子和合适 载体
成功案例展示及经验分享
目标蛋白表达量高，纯度高 案例二：实现复杂蛋白表达
利用伴侣蛋白和辅助因子
成功案例展示及经验分享
调整诱导时间和温度 成功表达具有生物活性的复杂蛋白
失败案例剖析及原因探讨
学Hale Waihona Puke 实践操作指点实验前准备指点学生熟悉实验器材、 试剂和操作方法，确保实 验顺利进行。
实践操作注意事项
强调实验过程中的安全、 卫生和规范操作，避免误 操作导致实验失败或影响 实验结果。
数据记录与分析
指点学生记录实验数据， 学会分析和解读实验结果 ，培养科学思维和实验技 能。
问题解答与互动讨论
实验原理解答
优化培养温度和时间
降低培养温度、延长培养时间有助于蛋白正确折叠。
改进纯化流程提高效率
选择合适纯化方法
根据蛋白性质选择亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方 法组合使用。
优化纯化条件
调整洗脱液成分、pH值及盐浓度等条件，提高纯化效果。
大肠杆菌表达系统使用指导
体系选择
研究基因功能: 研究基因功能: 大肠杆菌, 裂殖酵母,昆虫细胞, CHO细胞 大肠杆菌, 裂殖酵母,昆虫细胞, CHO细胞 多肽药物生产: 多肽药物生产: 大肠杆菌, 毕氏酵母, CHO细胞 细胞, 大肠杆菌, 毕氏酵母, CHO细胞, 乳腺组织 疫苗: 大肠杆菌, 酵母, 疫苗: 大肠杆菌, 酵母, 大多数沿用细胞培养产物进行灭毒 单抗生产: 单抗生产: 杂交瘤细胞 工业酶生产: 工业酶生产: 各种微生物
的优点，包括： 人血清白蛋白融合技术具有明显 的优点，包括：HSA与目 与目 标蛋白在胞内经蛋白翻译系统通过肽键连接， 标蛋白在胞内经蛋白翻译系统通过肽键连接， 不需额外的体 外处理；HSA表达水平较高， 融合后可以提高目的蛋白的表 外处理； 表达水平较高， 融合后可以提高目的蛋白的表 表达水平较高 是一个稳定的“ 达水平； 达水平；HSA是一个稳定的“ 惰性” 蛋白， 融合后可以提高 是一个稳定的 惰性” 蛋白， 融合后可以提高 融合蛋白具有比PEG修饰的蛋白药 融合蛋白具有比 修饰的蛋白药 目的蛋白的稳定性 ； HAS融合蛋白具有比 物更长的半衰期 。
（二）融合蛋白技术的内容
• 构建融合蛋白的基本原则是， 将第一个蛋白的终止密码子删除， 构建融合蛋白的基本原则是， 将第一个蛋白的终止密码子删除 终止密码子删除， 再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，以实现两个基因的共同 再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，以实现两个基因的共同 带有终止密码子的第二个蛋白基因 表达。具体步骤有： 表达。具体步骤有： 1.进行目的基因的克隆：根据基因序列互补原则 ，设计合适的引物序 进行目的基因的克隆： 进行目的基因的克隆 为模板， 技术扩增不同的目的DNA片段。 片段。 列，以cDNA为模板，利用 为模板 利用PCR技术扩增不同的目的 技术扩增不同的目的 片段 2.在载体中进行重组：通过限制内切酶将两个 在载体中进行重组： 在载体中进行重组 通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回 片段进行酶切并回 收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行 体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。 体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。
大肠杆菌表达体系的特点
大肠杆菌表达体系的特点
大肠杆菌表达体系是一种广泛应用于生命科学领域的基因表达系统。
大肠杆菌表达体系的主要特点包括以下几个方面。
首先，大肠杆菌表达体系具有高效的表达能力。
大肠杆菌是一种常见的细菌，具有快速繁殖和高表达的特点，使其成为一种理想的表达宿主。
此外，大肠杆菌中有许多表达小分子的系统，在外源基因表达后能够迅速转录和翻译，使其具有高度的表达效率。
其次，大肠杆菌表达体系具有方便的操作性。
在大肠杆菌表达体系中，外源基因通常以质粒的形式存在于大肠杆菌细胞中。
这种质粒可以通过大肠杆菌的经典转化方法，如热激转化、电转化等，便捷地进行基因克隆。
此外，大肠杆菌表达体系在诱导表达等方面也具有简单可行的特点，使其在实验室中得到广泛的应用。
第三，大肠杆菌表达体系具有良好的调控性能。
大肠杆菌表达体系可以通过调控诱导体的种类、浓度和诱导时间等条件来控制外源基因的表达水平。
因此，可以根据需要调节目标蛋白的表达水平，实现定量和定向表达等目的。
最后，大肠杆菌表达体系具有广泛的适用范围。
大肠杆菌表达体系适用于各种规模的实验，从小规模酶活性测定到大规模蛋白制备均可。
此外，大肠杆菌表达体系还可以用于生产大量细胞因子、酶及其他蛋白质，以用于制药及其他领域的应用。
综上所述，大肠杆菌表达体系是一种高效、方便、可调控和广泛适用于生命科学研究的基因表达系统，其表达方式的特点为基因克隆简便、操作方便、表达率高、表达水平可调节、适用范围广泛等。
大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化
⼤肠杆菌表达系统与蛋⽩表达纯化8.⼤肠杆菌表达系统与蛋⽩表达纯化⼤肠杆菌表达系统遗传背景清楚，⽬的基因表达⽔平⾼，培养周期短，抗污染能⼒强等特点, 是分⼦⽣物学研究和⽣物技术产业化发展进程中的重要⼯具。
因此熟练掌握并运⽤⼤肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每⼀个研究⽣来说是⾮常必要的。
本章节介绍了实验室常⽤的⼤肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利⽤⼤肠杆菌表达系统纯化重组蛋⽩的基本流程和详细操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。
8.1⼤肠杆菌表达系统的选择与构建8.1.1表达载体的选择根据启动⼦的不同这些载体⼤致可以分为热诱导启动⼦，如λPL，cspA 等和另外⼀类就是⼴泛使⽤的IPTG诱导的启动⼦，如lac，trc，tac，T5/lac operator，T5/lac operator等。
根据表达蛋⽩质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。
融合表达是在⽬标蛋⽩的N端或C端添加特殊的序列，以提⾼蛋⽩的可溶性，促进蛋⽩的正确折叠，实现⽬的蛋⽩的快速亲和纯化，或者实现⽬标蛋⽩的表达定位。
常⽤的⽤于亲和纯化融合标签包括 Poly-Arg，Poly-His, Strep-Tag Ⅱ，S-tag，MBP等。
其中His-Tag 和GST-Tag 是⽬前使⽤最多的。
His Tag ⼤多数是连续的六个His 融合于⽬标蛋⽩的N端或C端，通过His 与⾦属离⼦：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+ 的螯合作⽤⽽实现亲和纯化，其中Ni2+是⽬前使⽤最⼴泛的。
His 标签具有较⼩的分⼦量，融合于⽬标蛋⽩的N端和C端不影响⽬标蛋⽩的活性，因此纯化过程多不需要去除。
⽬前常使⽤的表达载体主要是由Novagen 提供的pET 系列和Qiagen 公司提供的pQE 系列。
除了His 标签外，还原性⾕胱⽢肽S-转移酶是另⼀种实验室常⽤的融合标签。
它可以通过还原性⾕胱⽢肽琼脂糖亲和层析⽽快速纯化。
重组DNA技术2之表达系统
大肠杆菌表达载体分类
按蛋白质类型分
• 单纯表达: pJLA系列, 用NcoI/NdeI导入AUG的载体 • 融合表达: 融合各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc 分泌表达: pel/ompT分泌肽
按启动子分
• • • • • lac及衍生的tac , trc, pac, rac等启动子 IPTG诱导 lamda phage PL和PR 启动子 热诱导 T7 启动子 IPTG诱导 T5 启动子 IPTG诱导 ara启动子 阿拉伯糖诱导
3 、原核体外翻译系统（ S30 原核体外翻译系 统）， E.coli S30提取物由 OmpT内切酶和 Lon蛋白酶缺陷的E.coli B菌株制备，所以在 S30 系统中表达基因可以增加产物的稳定性。
目前多家公司有商业化产品，常见的有：
RTS E.Coli 系统;
RTS100 wheat germ CECF系统 (Roche)
常见的大肠杆菌商业化表达系统有： 1、pET system and pETBlue™ system（Novagen公司）， 是原核蛋白表达中应用最多的系统。具有可溶性蛋白 生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体 和宿主菌。目前共有包括 40 多种载体、 15 种不同宿主 菌和配套齐全的用于有效检测和纯化目标蛋白的相关 产品。 基本结构由T7启动子、核糖体结合位点、信号肽序 列、多克隆位点、T7转录终止信号、氨苄青霉素抗 性基因核质粒复制位点等 有可以表达N端融合、C端融合和非融合蛋白的不同 质粒。也可以表达非分泌性蛋白 2 、 pBAD 表达系统（ Invitrogen 公司），可控制蛋白质的 生产水平低于其成为不溶性蛋白的域值。通过与硫氧 还蛋白的融合来增加溶解度 3、QIAexpress Expression System（Qiagen公司 ）。
基因表达系统—大肠杆菌的定义
的管中， 每管加 11 μl DMSO（-70度） ，混匀，液氮 快速冷冻， -70°C保存。
1. Pichia pastoris 的表达载体
胞内表达载体
胞外表达载体
P. pastoris没有稳定的附加体质粒基，因表所达以系一统—般大用肠杆整菌合的型定义载体作为外源基因的表达载体
Alcohol oxidase ,醇氧化酶, 将甲醇氧化成甲醛 • 通过高表达来补偿酶活性不足,因此有强启动子
酵母表达系统
优点
1 属于真核生物,可进行翻译后修饰,如糖基化 2 操作容易 3 4 快速
基因表达系统—大肠杆菌的定义
酵母细胞结构
基因表达系统—大肠杆菌的定义
两种酵母表达系统
酿酒酵母表达系统
Saccharomyces cerevisiae 过去常用
毕赤酵母
Pichia pastoris 现在多用
基因表达系统—大肠杆菌的定义
单交换
同源重组基因转移法 ：是将外源基因定位导人受体细胞染色体 上的方法，因为在该座位有与导人基因同源的序列，通过单一 或双交换，新基因片段可替换原有基因片段。
基因表达系统—大肠杆菌的定义
pAO815和pPIC9K 在Bgl
5 AOX1
II双切：
Bgl II
在5AOX1位点和
3AOX1双交换，替换
Buffer A: 1.0 M Sorbitol (山梨醇), 10 mM Bicine（N-二 羟乙基甘氨酸 ）, pH 8.35 (Sigma), 3% (v/v) ethylene glycol (乙二醇 )
大肠杆菌基因表达系统
必须用cDNA或者是化学合成的基因。 外源基因不能带有内含子。
除了具备克隆载体具备的条件外，还应具备以下条件： 强启动子、强转录终止子 可诱导性 合适的核糖体结合位点和起始密码ATG等
理想原核表达载体具备的基本特征
1
2
5
4
3
A dividing E. coli
原核或噬菌体启动子
MCS
SD序列
终止子
条件：
组成结构：
必须选择一个有lacI的宿主菌。
tac P
Lac O
S导物： IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）
阻遏物
IPTG
2.分泌型表达载体
如：pIN III系列： 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。 pIN III-A1, pIN III-A2, pIN III-A3,
EcoR I
BamH I
凝血酶
Ile Giu Gly Arg Gly Ile Pro Gly Asn Ser Ser
EcoR I
BamH I
Xa因子
pGEX-3X的插入区：
Sma I
Sma I
其他融合蛋白系统
His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。
细胞质
外膜
内膜
周间质
质粒
染色体
“外排”： 蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。 “分泌”： 蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。
01
碱性氨基酸
Leu、Ile
Arg、Lys
02
N
04
疏水氨基酸核心区
07
AlaGlySer
简述基因工程中常用的的表达系统及其优缺点
简述基因工程中常用的的表达系统及其优缺点
常用的的表达系统：
大肠杆菌表达体系
酵母表达体系
哺乳动物细胞表达体系
优点：
遗传背景清晰、成本低廉、可选载体及宿主多
细胞生长快、易于培养、遗传操作简单、使用穿梭质粒载体、能对蛋白质进行正确加工、修饰、合理的空间折叠
产物最接近于天然蛋白、易纯化、扩增和表达能力高、耐较高的剪切力和渗透压力、内源蛋白分泌少
缺点：
缺乏翻译后修饰加工，信号肽不能切掉，不能分泌表达、不能糖基化产物蛋白质不均一、信号肽加工不完全、内部降解、易形成多聚体技术要求高、生产成本高、生产规模小。
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转化宿主细胞
组氨酸缺陷平板 筛选重组子
22
G418 筛选pIC9K 多拷贝
pAO815和pPIC9K
PCR检测 转化细胞中的基因插入
诱导表达 SDS-PAGE检测
23
酵母菌转化
PEG 1000 Transformation Method for Pichia
Buffer A: 1.0 M Sorbitol (山梨醇), 10 mM Bicine（N-二 羟乙基甘氨酸 ）, pH 8.35 (Sigma), 3% (v/v) ethylene glycol (乙二醇 )
• It is critical to add DNA to frozen cell samples.
• To perform multiple transformations, it is recommended to process them in groups of six at a time.
可以在完全培养基YPD和含组氨酸的基础培养基上生长 在表达质粒转入后才能在组氨酸缺陷培养基上生长
本身的回复突变为1/108。Байду номын сангаас
16
转化后细胞的甲醇利用能力
GS115
AOX1正常，Mul+
KM71
AOX1被破坏， MulS
转化后对甲醇的利用
KM
AOX
Bgl II Sal I Stu I
甲 醇 、高 利 用
24
制备感受态细胞
1. 划线接种酵母菌，YPD平板， 30°C for two days. 2. 挑菌落于 10 ml YPD 30°C 摇过夜. 3. 转培养到 100 ml YPD，starting OD600 of 0.1 and
grow at 30°C to an OD600 of 0.5 to 0.8. 4. 3000 x g 收集细胞， 用50 ml of Buffer A洗细胞，室
温. 5. 细胞悬浮在 4 ml of Buffer A 中，分装成0.2 ml于灭菌
的管中， 每管加 11 μl DMSO（-70度） ，混匀，液 氮快速冷冻， -70°C保存。
25
保持感受态细胞在冰冻状态作转化！
• Cell competence decreases very rapidly after the cells thaw even when held on ice.
Bgl II双切：
Bgl II
在5AOX1位点和
3AOX1双交换，替
换掉了宿主的AOX1
基因，
gene
转化后GS115产生
AOX1
His +/Muts
His4
3AOX1
His4
20
21
技术路线
选择合适的内切酶位点 将基因插入载体
pAO815 体外构建多拷贝
线性化质粒
注:pAO815 和pIC9K是穿梭载 体, 可在大肠杆菌中 操作
8
2. CONSTRUCTION OF THE VECTOR
9
胞内表达载体, pAO815
10
胞外表达载体, pIC9K
11
pPIC9k, 胞外表达载体
12
3. 多拷贝产生，pIC9K, 体内形成多拷贝
因为未线性化的环状质粒之间发生同源 重组的几率非常低
未线性化的环状质粒发生同源 重组的几率非常低
Buffer B: 40% (w/v) Polyethylene glycol 1000 (Sigma), 0.2 M Bicine, pH 8.35
Buffer C: 0.15 M NaCl, 10 mM Bicine, pH 8.35
Filter sterilize and store at -20°C.
Alcohol oxidase ,醇氧化酶, 将甲醇氧化成甲醛 • 通过高表达来补偿酶活性不足,因此有强启动子
AOX1 是主要的酶 受甲醇严格控制 启动子用来驱动外源基因表达
AOX2 利用甲醇的能力低
生长慢
7
histidinol dehydrogenase gene (his4)
宿主His4突变，不能合成组氨酸， 在His缺陷培养基上不能生长； 质粒上有His4, 可合成组氨酸， 用His缺陷平板筛选转化菌株。
26
Transformation
• 1. 10-50 μg DNA（20 μl液体中）， 直接加到 still-frozen tube of competent cells（40 μg of denatured and sonicated salmon sperm DNA）；
13
pAO815 可体外构建多拷贝
14
BamH I：GGATCC CCTAGG
Bgl II：AGATCT TCTAGA
15
4. 宿主细胞 Pichia Strain 基因型
GS115
AOX1正常，Mul+
KM71
AOX1被破坏， MulS
宿主的histidinol dehydrogenase gene (his4) 突变
• 易操作,培养容易 • 表达量高, 可达培养液中10 g/L • 可以有真核生物的翻译后修饰, 如糖基化 • 避免了酿酒酵母的过糖基化问题
4
5
1. Pichia pastoris 的表达载体
胞内表达载体
胞外表达载体
6
P. pastoris没有稳定的附加体质粒，所以一般用整合型载体作为外源基因的表达载体
酵母表达系统
优点
1 属于真核生物,可进行翻译后修饰,如糖基化 2 操作容易 3 经济 4 快速
1
酵母细胞结构
2
两种酵母表达系统
酿酒酵母表达系统
Saccharomyces cerevisiae 过去常用
毕赤酵母
Pichia pastoris 现在多用
3
Pichia pastoris 表达系统
• Pichia pastoris 是甲醇利用型酵母,可以用甲醇作为唯 一的碳源.
切
甲 醇 切低 利 用
GS115取决于质粒在宿主细胞基因组上 交换的位置是否破坏宿主的AOX1
没低交
有 1
利 用 ， 因 为 宿 主
换 ， 只 能 是 甲 醇
71
无 论 在 那 里
17
质粒线性化后转化宿主细胞
线性化位点
线性化质粒发生同源 重组的几率提高
18
pAO815和pPIC9K
在Sal I 、Stu I 单切,
在his 4插入（单交换）， 不破坏宿主的AOX1，转 化GS115后产生： His +/Mut+
单交换
同源重组基因转移法 ：是将外源基因定位导人受体细胞染色体
上的方法，因为在该座位有与导人基因同源的序列，通过单一 或双交换，新基因片段可替换原有基因片段。
19
pAO815和pPIC9K 在
5 AOX1