MISEQ数据处理步骤
miseqfgx法医基因组二代测序原理
miseqfgx法医基因组二代测序原理一、引言法医基因组二代测序（miseqfgx）是一种重要的生物技术，广泛应用于法医鉴定、遗传学研究等领域。
本文将介绍法医基因组二代测序的原理、实验流程及其在法医学中的应用。
二、原理法医基因组二代测序的基本原理是基于高通量技术。
其基本步骤包括：DNA 提取、模板制备、测序反应、数据解析等。
首先，从样本中提取出DNA，将其打断成小片段后加入接头，再进行PCR扩增。
接下来，通过高通量测序仪对经过处理的DNA模板进行测序，得到大量的序列数据。
最后，通过生物信息学分析，将这些序列数据转化为基因组信息，从而实现对样本的鉴定。
三、实验流程1. 样本采集：收集含有DNA的样本，如血液、精液、毛发等。
2. DNA提取：对样本进行提取，得到较为纯净的DNA。
3. 模板制备：将DNA打断成小片段，并加入接头。
接头的目的是为了稳定片段并增加序列信息。
4. 测序反应：将带有接头的DNA片段加入测序仪进行测序，得到序列数据。
5. 数据解析：对测序仪得到的原始数据进行处理，包括去除噪音、拼接序列、注释基因等步骤，以获得基因组信息。
四、应用法医基因组二代测序在法医学中的应用主要体现在以下几个方面：1. 亲子鉴定：通过比较样本和疑似父亲的基因组信息，可以确定是否存在亲子关系。
2. 遗传疾病研究：通过对患病家系的基因组信息进行分析，可以研究遗传疾病的发病机制和基因变异。
3. 法医案件分析：通过比较犯罪现场的生物样本和嫌疑人的基因组信息，可以进行个体识别和种属鉴定。
4. 种群遗传学研究：通过对不同群体基因组信息的分析，可以研究种群的遗传结构和生活史。
五、结论法医基因组二代测序作为一种重要的生物技术，具有高通量、高灵敏度、高精度等优点，在法医鉴定、遗传学研究等领域发挥着越来越重要的作用。
随着技术的不断进步，法医基因组二代测序将在更多领域得到应用，为人类健康和科学发展做出更大的贡献。
六、参考文献（此处省略参考文献）七、致谢感谢各位读者对法医基因组二代测序的支持和关注，希望能为大家提供有益的信息和帮助。
二代dna测序技术数据的处理流程
二代dna测序技术数据的处理流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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MIQE指南
Bulletin CN 5859
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ᆀྪዐ႐ 702 ࣆۉǖ010 - 8267 5748 دኈǖ010 - 6252 9800 ᆰՊǖ100086
Fleige S and Pfaffl MW (2006). RNA integrity and the effect on the real-time qRTPCR performance. Mol Aspects Med 27, 126-139.
Garson JA et al. (2009). Unreliable real-time PCR analysis of human endogenous retrovirus-w (HERV-W) RNA expression and DNA copy number in multiple sclerosis. AIDS Res Hum Retroviruses 25, 377-378; author reply 379-381.
Bio-Rad’s real-time thermal cyclers are licensed real-time thermal cyclers under Applera’s United States Patent 6,814,934 B1 for use in research, human in vitro diagnostics, and all other fields except veterinary diagnostics. This product is covered by one or more of the following U.S. patents or their foreign counterparts owned by Eppendorf AG: U.S. Patent Nos. 6,767,512 and 7,074,367.
基因组测序仪MiSeqDx使用手册说明书
MiSeq TM Dx使用手册MiSeqDx 使用手册文件号1000000039320 v04 | 1 2020年12月Material # 20030132引言本文档及其内容是Illumina，Inc.及其附属公司（“Illumina”）所有，并且仅供与所述产品相关的合同约定的客户使用，无其他用途。
未经Illumina事先书面同意，本文件及其内容不得以其他方式传播、披露或转载和/或用于任何其他目的。
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MiSeqDx 使用手册文件号1000000039320 v04 | 2 2020年12月Material # 20030132修订历史MiSeqDx 使用手册文件号1000000039320 v04 | 3 2020年12月Material # 20030132目录引言 (2)修订历史 (3)目录 (4)第一章概述 (6)产品名称 (6)预期用途 (6)产品结构及组成 (6)第二章设备安装及环境要求 (14)运输和储存 (14)运输和安装 (14)实验室要求 (15)电气要求 (17)环境要求 (18)网络要求 (18)用户自备耗材和设备 (19)第三章工作原理 (21)工作原理 (21)需要但不提供的设备和材料 (21)第四章性能指标 (22)仪器技术指标 (22)仪器使用期限 (23)产品合规性和监管声明 (23)第五章运行操作 (26)P ART וL OCAL R UN M ANAGER（本地运行管理） (26)本地运行管理 (26)登陆信息管理 (26)操作界面概述 (27)管理设置和任务 (31)工作流程概述 (37)P ART װM I S EQ O PERATING S OFTWARE (M I S EQ操作软件) (41)启动和开机 (41)MiSeqDx 使用手册文件号1000000039320 v04 | 42020年12月Material # 20030132测序运行 (43)结果分析 (54)质量控制 (55)文件夹管理 (55)MOS软件界面图标 (56)第六章局限性和注意事项 (58)使用局限性 (58)警告和注意事项 (58)第七章危害及标志 (60)安全考虑和标志 (60)通用标志 (62)第八章设备维护 (63)维护频率 (63)维护清洗 (63)待机清洗 (65)关机步骤 (67)重启步骤 (68)所需磁盘空间 (68)杀毒软件 (68)第九章故障排除 (69)附件 (78)MiSeqDx 使用手册文件号1000000039320 v04 | 52020年12月Material # 20030132第一章概述产品名称中文名称：基因测序仪英文名称：MiSeq TM Dx Instrument型号：MiSeq TM Dx预期用途用于体外诊断。
MISEQ数据处理步骤
一、数据读出（通过“fasta”文件生成“classification”和“txt”文件）1、下载Java：for64位。
2、cmd进入DOS界面，进入数据所在的文件夹，逐个分析并命名数据，见下行。
Java-Xmx4g-jar..\rdp_classifier_2.6\dist\classifier.jarclassify-c0.8-ffi lterbyconf-h hier_output.txt–o samplename.classification.txt input.f asta注意：刚开始时输入“cd..”（cd空格加两点）即退回上一级目录，直到回到C盘，fasta原始数据也必须放在C盘。
手打指令，适用本机。
3、用Excel打开目标文件txt文本，“筛选”，选择不同的分类单位进行数据整理和分析。
Class:纲Domain:域Family:科Genus:属Order:目Phylum:门Kingdom:界Species:种二、删除chloroplast（叶绿体）1、将原始文件（“fasta”和“classification”文件）拷贝至与程序“mothur”相同的目录下；2、找到后缀名为“H1.classification”的数据原文件（以样品H1为例），用Excel打开；3、选中“Class”对应的物种列，“筛选”，在下拉框中勾掉物种“chloroplast（叶绿体，非细菌）”，“确定”；复制第一列到粘贴板；4、新建“H1.accnos”的txt文件，将第一列（物种序列）粘贴，保存、退出；将后缀名改为“.accnos”（窗口界面“组织”、文件夹和搜索选项、查看、勾掉“隐藏已知文件类型的扩展名”）；5、打开程序“mothur”，输入：get.seqs(accnos=H1.accnos,fasta=H1.fasta)，回车，即从原始的物种序列中选出了去除chloroplast以外的新序列，系统会自动生成一个新的fasta文件“H1.pick.fasta”。
MiSeq平台相关技术
MiSeq平台相关技术MiSeq平台简介MiSeq系统是Illumina公司推出的测序平台，测序原理和HiSeq基本相同，即基于DNA 单分子簇的边合成边测序技术和可逆终止化学反应原理。
其拥有不同测序读长模式，测序质量可与HiSeq相媲美。
性能参数如下截图所示。
图 1 MiSeq测序性能参数目前可以支持500-600bp的读长，堪与罗氏454平台读长媲美，但是通量却远高于454平台，2*250读长一个run可产出7-9G左右数据量，2*300读长一个run可产出12G左右数据。
MiSeq测序平台同时拥有较长的读长和较高的数据量产出的特点，是HiSeq和454都无法比拟的优势，是应用于分子生态和基因组测序的最佳平台。
相对于HiSeq系统，具有更长读长，可使拼装结果更加准确完整。
相对于454平台，高数据量产出，加大了测序深度和覆盖度，使测序得到的变异信息更加准确。
技术特点■读长及通量优势：读长优势可得到更准确拼装结果，通量高，PE250高达9G通量，PE300高达15G的通量；■样本制备便捷，试验周期短：最低50ng DNA模板，短时间几个小时的自动化操作就可以完成全部样品制备工作。
■最精确的测序原理: 沿用GA和HiSeq平台的边合成边测序的化学原理■最完整的整合功能:独立完成簇生成、双向测序及数据分析工作。
■数据产出均一性好:对每个样品的DNA量进行严格定量，提高了数据产出的均一性。
适用项目■宏基因组16S RDNA测序：美国Earth Microbiome Project已将该方法作为16S RDNA测序与环境群落结构多样性研究的标准方法，已有多名权威学者的研究成果在ISME J、Cell、Nature 和等顶尖期刊上发表。
■转录组测序：通过该平台测序可相对于Illumina HiSeq平台，可获得更长更准确的转录本拼装信息。
■微生物基因组（重）测序：Illumina MiSeq非常适用于对微生物基因组（重）测序，可得到更准确基因拼装结果的同时可大量准确检出SNP和indel信息。
Miseq操作流程及报价须知
一、最简单快速到建库方法Illumina为研究者提供了最简单快速到建库方法，使用Illumina Nextera转座子酶技术，在试管内即可完成DNA片段化，不需要物理剪切或者酶切步骤，一步完成DNA片段化，末端补平和加接头步骤，整个操作流程只需要90分钟，手动操作步骤不超过20分钟，起始DNA只需要50ng。
整合的高度自动化的系统，点击触摸屏即可开展测序Miseq提供了最简单的新一代测序流程。
通过直观的触摸屏界面开展简单的仪器操作，即插即用的试剂带有RFID 追踪，具有自动化的便利。
小巧、一体化的Miseq平台整合了簇生成，边和成边测序和完整的数据分析，不再需要其他辅助性设备。
整个簇生成和测序过程手动操作不超过20分钟。
经验证的数据质量以Illumina久经考验的边合成边测序技术为基础，通过专利的可逆终止法对数百万个片段进行大规模并行测序，在单个碱基掺入增长DNA链时检测它们。
由于每个检测循环中四种可逆终止子结合的dNTP都存在，所以自然竞争让掺入偏差最小化，与其他技术相比大大降低了原始错误率。
最终结果是高度准确的每个碱基的测序信息，即使是重复序列区和同聚物都确保了可靠的碱基检出。
文库构建：剪切，加接头二、整合的高度自动化的系统，点击触摸屏即可开展测序Miseq 提供了最简单的新一代测序流程。
通过直观的触摸屏界面开展简单的仪器操作，即插即用的试剂带有RFID 追踪，具有自动化的便利。
小巧、一体化的Miseq 平台整合了簇生成，边和成边测序和完整的数据分析，不再需要其他辅助性设备。
整个簇生成和测序过程手动操作不超过20 分钟。
三、经验证的数据质量以Illumina 久经考验的边合成边测序技术为基础，通过专利的可逆终止法对数百万个片段进行大规模并行测序，在单个碱基掺入增长DNA 链时检测它们。
由于每个检测循环中四种可逆终止子结合的dNTP 都存在，所以自然竞争让掺入偏差最小化，与其他技术相比大大降低了原始错误率。
seqMiSeq下的测序步骤DS故胺AI肽DoEarn等
seqMiSeq下的测序步骤DS故胺AI肽DoEarn等测序技术是一种分析DNA或RNA序列的方法，能够帮助研究人员了解生物体的基因信息和生物过程。
其中，seqMiSeq是一种常用的高通量测序技术，被广泛应用于生物学和医学领域。
在进行seqMiSeq测序时，有几个关键的步骤需要注意，包括DS故胺AI肽和DoEarn等。
下面将对这些步骤进行详细介绍。
首先，我们来了解一下DS故胺AI肽的概念。
DS故胺AI肽（Dual-Indexed Adapter Primers）是一种测序接头引物，用于在测序前对DNA样品进行处理。
DS故胺AI肽主要有两个作用：一方面，它能够将引物与样品中的DNA分子连接起来，从而实现对DNA序列的扩增；另一方面，DS故胺AI肽还包含了用于标记和识别样品的测序索引序列。
通过引入DS故胺AI肽，我们可以同时测序多个样品，并将不同样品的测序数据进行区分和分析。
除了DS故胺AI肽，测序库的构建还需要用到AI肽（Adapter-Indexed Primers）。
AI肽是一种特殊的引物序列，能够与DS故胺AI肽中的索引序列相互匹配。
通过AI肽引物的作用，我们可以将DS故胺AI肽中连接的DNA序列进一步扩增和准备，在测序过程中提供足够的DNA模板。
在测序前的准备步骤中，DoEarn起着关键的作用。
DoEarn是一种DNA片段耦合反应，主要用来将引物和样品中的DNA序列连接起来。
通过DoEarn反应，我们可以将DS故胺AI肽和AI肽引物与DNA样品中的DNA序列连接起来，形成测序库。
在DoEarn反应中，需要注意的是反应温度、时间和酶的浓度等因素，以确保反应的效率和准确性。
完成了测序库的构建后，我们就可以进行seqMiSeq测序了。
seqMiSeq是一种高通量测序技术，通过短读长度和并行测序的方式，大幅度提高了测序的速度和效率。
在seqMiSeq测序中，测序仪会对构建好的测序库进行碱基的识别和记录。
核磁数据处理方法
核磁数据处理方法引言概述：核磁共振（NMR）是一种重要的分析技术，广泛应用于化学、生物学、医学等领域。
在核磁实验中，获取的数据需要经过一系列的处理方法才能得到有用的信息。
本文将介绍核磁数据处理的方法和步骤。
一、数据预处理1.1 去除基线漂移基线漂移是核磁数据中常见的问题，会影响信号的准确性和可读性。
去除基线漂移的方法包括多项式拟合、小波变换等。
多项式拟合方法通过拟合基线的曲线来消除漂移，而小波变换则是通过将信号分解为不同频率的子信号，再去除漂移。
1.2 峰识别与积分在核磁数据中，峰表示不同的化学物质或分子的信号强度。
峰识别是核磁数据处理中的关键步骤，常用的方法有阈值法、波峰拟合法等。
峰积分则是计算峰的面积，可以用于定量分析。
积分方法包括峰高积分、曲线拟合积分等。
1.3 信号增强信号增强是核磁数据处理中的一项重要任务，可以提高信号的信噪比和分辨率。
常用的信号增强方法有峰值增强、小波变换增强等。
峰值增强方法通过增加峰的幅度来提高信号的强度，而小波变换增强则是通过变换信号的频域表示来增强信号。
二、数据分析2.1 化学位移的确定化学位移是核磁数据中的一个重要参数，可以用于分析化学物质的结构和性质。
确定化学位移的方法包括参考物质法、内标法等。
参考物质法是通过参考物质的化学位移来确定样品的化学位移，而内标法则是通过加入内标物质来确定样品的化学位移。
2.2 峰的归属在核磁数据中，不同的峰代表不同的化学物质或分子。
峰的归属是核磁数据分析的关键步骤，常用的方法有数据库比对法、二维核磁共振法等。
数据库比对法是将实验数据与已知的化合物数据库进行比对，找到匹配的化合物。
二维核磁共振法则是通过测量不同维度上的核磁共振谱图，确定不同峰之间的关系，从而归属峰的来源。
2.3 定量分析核磁数据可以用于定量分析，例如确定化合物的浓度、反应的进程等。
定量分析的方法包括内标法、峰面积法等。
内标法是通过加入内标物质来确定样品的浓度，而峰面积法则是通过计算峰的面积来确定样品的浓度。
核磁数据处理方法
核磁数据处理方法概述：核磁共振（NMR）是一种常用的分析技术，在化学、生物学和医学等领域具有广泛应用。
核磁数据处理是指对采集到的核磁共振数据进行处理和分析的过程。
本文将介绍一种标准的核磁数据处理方法，包括数据预处理、峰识别、峰积分、峰归属和数据可视化等步骤。
1. 数据预处理：在进行核磁数据处理之前，需要对采集到的原始数据进行预处理，以去除噪声和不必要的信号。
常见的数据预处理方法包括基线校正、峰对齐和峰平滑等。
基线校正是通过拟合基线曲线并将其从原始数据中减去来消除背景噪声。
峰对齐是将不同样品的峰位置进行校正，以便后续的峰识别和峰积分。
峰平滑是通过应用平滑算法来减少数据中的噪声。
2. 峰识别：峰识别是核磁数据处理的关键步骤，其目的是自动识别出数据中的峰，并确定其峰位置和峰强度。
常见的峰识别算法包括阈值法、拟合法和小波变换法等。
阈值法是根据峰的信号强度与背景噪声的差异来确定峰的位置。
拟合法是通过拟合峰形曲线来确定峰的位置和峰强度。
小波变换法是利用小波变换对数据进行频谱分析，从而确定峰的位置和峰强度。
3. 峰积分：峰积分是核磁数据处理的重要步骤，其目的是计算每一个峰的面积，以获取样品中各组分的相对含量。
常见的峰积分方法包括直接积分法、拟合积分法和峰高法等。
直接积分法是将峰的面积直接计算为峰下的积分值。
拟合积分法是通过拟合峰形曲线来计算峰的面积。
峰高法是将峰的面积计算为峰高与峰宽的乘积。
4. 峰归属：峰归属是核磁数据处理的关键步骤，其目的是将每一个峰与相应的化合物进行关联，以确定样品中各组分的化学结构和含量。
常见的峰归属方法包括峰数据库比对、化学位移计算和二维谱图分析等。
峰数据库比对是将实验测得的峰与已知化合物的峰数据库进行比对，以确定峰的归属。
化学位移计算是通过计算峰的化学位移与已知化合物的化学位移进行比对，以确定峰的归属。
二维谱图分析是通过绘制二维谱图并进行交叉比对，以确定峰的归属。
5. 数据可视化：数据可视化是核磁数据处理的最后一步，其目的是将处理后的数据以图形的形式进行展示，以便于结果的分析和解释。
Miseq标准化操作指南中文翻译版
DNA缓冲液Tagment DNA Buffer (TD)DNA酶1 Tagment DNA Enzyme (TDE1)目的DNA转移到冰上。
缓冲液颠倒混匀、酶不适合旋涡，易损坏酶片段。
把样本纯化磁珠从2-8度冰箱取出，至温度升到室温。
确保终止连接缓冲液（ST）没有沉淀，如有沉淀要旋涡，直到所有颗粒物悬浮起来。
多试剂处理，使用排枪，分装洗脱缓冲液，目的DNA缓冲液，和DNA酶，分装到八连排管中，保证每个孔的体积一致。
把样品纯化磁珠倾倒至多通道反应管中。
将深孔板插入到加热体模块中，预加热垂直混匀仪至58度。
取一个深孔板，用记号笔签字。
操作确保反应试剂分装时，为了最好的描述试剂盒信息，反应液分装不需要再冰上操作。
1. 按照以下步骤标准化a)检测目的DNA样本的质量，使用紫外分光光度计或者Qubit，b)每个样品用10mM的Tris-HCl（pH8.5）稀释到10ng/μL。
c)再次检测5ng/μL的目的DNA样本质量，使用紫外分光光度计或者Qubit。
d)在此基础上，每个样品用10mM的Tris-HCl（pH8.5）稀释到5ng/μL，取10μL备用。
配置方法：原DNA浓度为18 ng/μL，配置成体积为20 μL，浓度5ng/μL 的DNA，取原液的体积是20*5/18，取Tris-HCl体积为20-（20*5/18）。
2. 取一0.2mL的干净离心管，加入以下成分：10μL（5ng/μL）gDNA + 25μL Tagment DNA Buffer + 15μL Tagment DNA Enzyme涡旋振荡混匀，1800转1min，避免有气泡，58℃，10min。
注意：用普通PCR仪，先让机器预热到58℃，再放样品。
大样本可用深孔板操作。
在垂直混匀仪上操作。
3. 结束后，向管中加15μL Stop Tagment Buffer，涡旋振荡，短暂离心。
室温放置反应4min。
【此时体系共65μL】（三）纯化：因为转座酶与DNA末端紧密结合，会干扰下游反应过程准备样品重悬洗脱液RSB，样品纯化磁珠SPB，80%乙醇取出，降温至室温。
Illumina MiSeq 系统指南说明书
MiSeq系统指南文档号1000000154717 v00 CHSILLUMINA所有2021 年2 月MiSeq系统指南本文档及其内容归Illumina,Inc.及其附属公司（“Illumina”）所有，并且仅供其客户用于与本文档内所描述的产品用途相关的合同用途，不得用于其他任何目的。
在未获得Illumina的事先书面同意的情况下，不得出于任何目的使用或分发本文档及其内容，和/或以其他任何方式对其进行传播、披露或复制。
Illumina不通过本文档向第三方授权其任何专利、商标、所有权或习惯法权利或类似权利。
必须由具备资质且受过相关培训的人员严格明确遵照本文档中的说明操作，以确保本文档中所述产品的使用适当且安全。
在使用此类产品之前，相关人员必须通读并理解本文档中的所有内容。
未能完整阅读并明确遵守本文档中包含的所有说明可能会导致产品损坏、对用户或其他人员造成人身伤害以及对其他财产造成损害，并且将导致产品适用的保证失效。
对于由不当使用本文档中描述的产品（包括其部件或软件）引起的任何后果，ILLUMINA概不承担任何责任。
©2021Illumina,Inc.保留所有权利。
所有商标均为Illumina,Inc.或其各自所有者的财产。
有关特定的商标信息，请参见/company/legal.html。
修订历史记录目录修订历史记录iii第1章概述1简介1更多资源1组件2 MiSeq概念4系统软件4二级分析选项6 Sequencing Analysis Viewer7所需磁盘空间7 MiSeq试剂盒概述7第2章开始11启动MiSeq11自定义系统设置11配置BaseSpace更新的通知12设置电子邮件首选项12设置默认的文件夹位置12用户自备的耗材13第3章测序15简介15运行持续时间15 MiSeq工作流程16解冻试剂夹盒17检查试剂夹盒17变性和稀释文库18装入样品文库18使用MCS设置运行18清洁流动槽21装入流动槽22装入试剂23启动运行25监控运行26执行运行后清洗27第4章维护31维护频率31 VeriSeq PGS工作流程的维护频率31执行维护清洗32执行备用清洗34管理文件35MiSeq系统指南软件更新37关闭仪器37附录A故障诊断39简介39用于故障诊断的打包日志39执行系统检查40暂停或停止运行40手动提起试剂夹盒吸管41解决运行设置错误41解决RFID读取失败42执行液量测试43测量预期的清洗量43解决试剂冷却器温度错误43解决Local Run Manager分析错误44配置系统设置44附录B输出文件和文件夹45运行文件夹45 MiSeqOutput文件夹内容45 RTA文件夹和文件46索引49技术协助53第1章概述简介1更多资源1组件2 MiSeq概念4系统软件4二级分析选项6 Sequencing Analysis Viewer7所需磁盘空间7 MiSeq试剂盒概述7简介Illumina®MiSeq™系统结合了经证明的Sequencing by Synthesis(SBS)技术和创新的工作流程，这样您只需八小时就能从DNA完成数据分析。
MiSeq系统（系列7—标准文库变性及稀释）
MiSeq 系统（系列7—标准文库变性及稀释）本指南介绍了对Illumina®MiSeq® system 上进行测序的文库进行变性和稀释方法，同时介绍了用作测序控制PhiX 文库的制备说明。
1、耗材和设备名称 供应商HT1(Hybridization Buffer), thawed and prechilled Illumina 提供的MiSeq Reagent KitIlluminaPhiX Control, Catalog # FC-110-3001Illumina(选择) 1.0N NaOH, molecular biology-grade 一般实验室供应商Tris-Cl10 mM, pH 8.5 with 0.1% Tween 20一般实验室供应商 1.5ml 的离心管 SciGene,catalog # 1057-34-0, or equivalent2、试剂准备2.1准备新鲜稀释的NaOHa. 取800µLaboratory -grade water 至1.5ml 微量离心管中。
b. 添加200µL 的1.0NNaOH ，获得1ml 含0.2NNaOH 溶液。
c. 漩涡混匀离心备用。
注：为防止小的移液误差影响最终的NaOH 浓度，准备至少1ml 新鲜稀释的NaOH 。
始终准备新鲜稀释的NaOH 用于变性文库以便簇生成，新鲜配置的氢氧化钠必须在12小时以内使用.2.2准备HT1a. 将-25°C ~ -15°C 储存的HT1移至室温溶解。
b. 待HT1溶解后储存至2°C ~ 8°C 冰箱中备用。
2.3稀释变性PhiX 质控根据测序试剂版本稀释PhiX 质控名称 最终PhiX 浓度MiSeq Reagent Kit v 3 将变性PhiX 对照稀释至20 pM ，对于v3试剂能够产生最佳簇密度MiSeq Reagent Kit v 2 将变性PhiX对照稀释至12.5pM，对于v2试剂能够产生最佳簇密度2.3.1稀释PhiX质控至4nMa.取2µl10nM PhiX文库至1.5ml的微量离心管中。
生物大数据技术在个体遗传构建研究中的数据处理流程
生物大数据技术在个体遗传构建研究中的数据处理流程随着生物学研究的发展，生物大数据技术已经成为了个体遗传构建研究领域中的重要工具。
这些技术不仅可以提供大量的遗传信息，还能够帮助研究人员深入了解个体遗传构建的基本原理和调控机制。
在进行个体遗传构建研究时，数据处理流程是至关重要的一步。
本文将详细介绍生物大数据技术在个体遗传构建研究中的常用数据处理流程。
首先，个体遗传构建研究通常需要收集大量的基因组数据。
这些数据可以通过DNA测序技术获得，例如全基因组测序、RNA测序、ChIP-seq等。
在数据采集之后，首先需要进行原始数据的处理和质量控制。
这一步骤主要涉及数据清洗、去除低质量序列和去除序列污染等。
清洗后的数据将成为后续分析的基础。
接下来，生物大数据技术在个体遗传构建研究中常用的数据处理流程之一是基因组比对。
基因组比对是将测序数据与标准基因组序列进行比对，以确定测序片段在基因组中的位置。
这一步骤可以使用比对算法来实现，例如Bowtie、BWA等。
比对的结果对于后续的变异检测和基因组注释非常重要。
然后，借助生物大数据技术，个体遗传构建研究可以进行变异检测。
变异检测是通过比对结果分析个体的基因组序列与参考基因组序列之间的差异。
根据差异的种类，变异可以分为SNP、插入缺失等。
在变异检测中，常用的算法有GATK、SAMtools等。
通过变异检测，研究人员可以了解个体基因组中的具体变异情况，为后续的功能注释提供依据。
在完成变异检测之后，个体遗传构建研究还需要进行基因组注释。
基因组注释是将变异的结果与已知的基因组信息进行比对和关联，以确定变异的功能和可能的影响。
基因组注释可以分为结构注释和功能注释两个方面。
结构注释主要包括基因定位、外显子区域和启动子等的注释，而功能注释则是对变异的功能进行预测和解释，例如注释变异是否在编码区域、影响蛋白质结构或表达等。
在进行基因组注释时，可以用到一些常用的工具，如ANNOVAR、Variant Effect Predictor等。
基因表达谱数据分析方法综述
基因表达谱数据分析方法综述随着生物学研究的深入发展，基因表达谱数据分析成为了解生物体内基因表达的关键工具。
基因表达谱数据分析方法的选择和应用对于研究人员来说至关重要，它们能够揭示基因在不同生物过程和疾病中的功能和调控机制。
本文将对常用的基因表达谱数据分析方法进行综述。
一、预处理基因表达谱数据的预处理是整个分析流程中的第一步。
预处理包括数据清洗、异常值处理和标准化等。
首先，数据清洗旨在去除无效或错误的测量结果，比如删除纯噪声数据、对缺失值进行填充等。
其次，异常值处理能够排除实验误差和技术噪声对结果的影响，例如使用离群值检测方法剔除异常值。
最后，标准化使得不同样本之间的差异可比较，常用方法包括Z得分标准化、基线转换等。
二、差异分析差异分析是基因表达谱数据分析的关键步骤，用于检测不同样本之间的差异表达基因。
常用的差异分析方法包括t检验、方差分析和正态分布检验等。
在差异分析中，需要设定阈值以确定显著差异基因，一般会引入多重比较校正方法，如Bonferroni校正和FDR校正等，以控制误差率。
三、聚类分析聚类分析是一种将样本或基因分类的方法，它能够在没有先验知识的情况下探索样本之间的内在结构。
常用的聚类方法有层次聚类和K均值聚类。
层次聚类通过计算样本或基因间的距离，将相似的样本或基因分组在一起。
而K均值聚类则是将样本或基因划分为K个不同的簇，使得簇内的样本或基因间的距离最小化。
四、功能富集分析功能富集分析能够将差异表达基因与生物学功能和通路联系起来，揭示其在细胞过程和疾病中的作用。
常用的功能富集分析方法包括基于基因本体论的富集分析和基于数据库的富集分析。
基因本体富集分析将差异表达基因映射到基因本体，通过比较差异表达基因与所有基因的分布，发现富集在特定基因本体条目下的功能。
数据库富集分析则是将差异表达基因与特定数据库中的功能和通路进行比较，找出富集在特定功能和通路中的基因。
五、生存分析生存分析能够评估差异表达基因与疾病进程或预后的关联性，对于临床研究具有重要意义。
MiSeq平台相关技术
技术特点
1.读长及通量优势：读长优势可得到更准确拼装结果，通量高，PE250 高达9G通量，PE300高达15G的通量；
2.样本制备便捷，试验周期短：最低50ng DNA模板，短时间几个小时
的自动化操作就可以完成全部样品制备工作 3.最精确的测序原理: 沿用GA和HiSeq平台的边合成边测序的化学原理 4.最完整的整合功能 :独立完成簇生成、双向测序及数据分析工作。 5.数据产出均一性好:对每个样品的DNA量进行严格定量，提高了数据 产出的均一性。
MiSeq平台简介
MiSeq系统是Illumina公司推出的测序平台，测序原理和 HiSeq基本相同，即基于 DNA单分子簇的边合成边测序技术和可逆终止化学反应原理。其拥有不同测序读长 模式,测序质量可与 HiSeq相媲美.
Hale Waihona Puke 目前可以支持 500-600bp 的读长，堪与罗氏 454 平台读长媲美，但是通量却远高于 454平台，2*250读长一个run可产出7-9G左右数据量，2*300读长一个run可产出12G 左右数据。 MiSeq测序平台同时拥有较长的读长和较高的数据量产出的特点，是HiSeq和454都 无法比拟的优势，是应用于分子生态和基因组测序的最佳平台。 相对于HiSeq系统，具有更长读长，可使拼装结果更加准确完整。 相对于454平台，高数据量产出，加大了测序深度和覆盖度，使测序得到的变异信 息更加准确。
适用项目
宏基因组16S RDNA测 序 • 美国Earth Microbiome Project 已将该方法作为16S RDNA测序与环境群落 结构多样性研究的标 准方法，已有多名权 威学者的研究成果在 ISME J、Cell、 Nature和等顶尖期刊 上发表。 转录组测序 • 通过该平台测序可相 对于Illumina HiSeq 平台，可获得更长更 准确的转录本拼装信 息。 微生物基因组（重） 测序 • Illumina MiSeq非常 适用于对微生物基因 组（重）测序，可得 到更准确基因拼装结 果的同时可大量准确 检出SNP和indel信息。
免疫组库测序技术流程
免疫组库测序技术流程免疫组库测序技术是一种用于研究免疫系统中抗体多样性的高通量测序方法。
该技术利用高通量测序平台，对免疫组库中的抗体编码区域进行测序，以获得抗体的基因序列信息。
本文将介绍免疫组库测序技术的流程和应用。
一、样品准备在进行免疫组库测序之前，需要准备包含抗体多样性信息的样品。
样品可以来源于人体、动物或其他生物体内的免疫组织或细胞。
样品可以是血液、骨髓、脾脏等，也可以是单个B细胞或其核酸提取物。
样品的获取和处理要符合伦理和规范，确保实验的可靠性和准确性。
二、抗体基因的扩增在免疫组库测序中，需要对抗体基因进行扩增，以获得抗体的编码区域序列。
一般采用PCR方法进行扩增。
PCR反应中使用特异性引物，选择性地扩增目标抗体基因。
PCR反应条件需要精确控制，以保证扩增的特异性和效率。
三、文库构建扩增得到的抗体基因片段需要进行文库构建，以便后续的测序分析。
文库构建包括DNA片段的末端修复、连接适配体、连接产物纯化和文库的扩增等步骤。
文库构建过程中需要注意避免污染和损伤，以保证文库的质量和稳定性。
四、高通量测序文库构建完成后，可以进行高通量测序。
高通量测序技术可以同时测定大量的DNA序列，具有高效、高准确性的特点。
目前常用的高通量测序平台有Illumina MiSeq、Ion Torrent等。
测序数据的质量控制和分析是保证结果可靠性的重要环节。
五、数据分析测序得到的数据需要进行分析和解读。
数据分析包括序列比对、多样性分析、克隆频度计算等。
序列比对可以将测序得到的序列与数据库中已知的抗体序列进行比对，以鉴定和注释抗体基因。
多样性分析可以评估抗体基因的多样性水平和克隆选择压力。
克隆频度计算可以估算不同克隆的相对丰度。
六、应用领域免疫组库测序技术在许多领域都有广泛的应用。
在免疫学研究中，可以利用免疫组库测序来解析免疫应答的动态变化、鉴定新的抗体分子、研究抗体多样性和亲和力等。
在疾病诊断和治疗中，免疫组库测序可以用于鉴定致病微生物、筛选特异性抗体、监测治疗效果等。
MiSeq标准参数指标
高通量基因测序系统美国illumina公司Miseq技术参数1.仪器功能：可开展快速经济高效的第一代测序应用，包括扩增产物测序和克隆检查等；也可以开展新一代基因组测序应用，如高度多重PCR扩增子测序，小基因组重测序，de novo测序，小RNA测序，文库质控和16s细菌宏基因组研究等；2.技术规格＊2.1一轮测序反应生成的有效数据量最高可达15Gb（即150亿个碱基）；＊2.2一轮测序反应生成的可读测序片段序列最高可达2500万条；＊2.3一轮测序反应（最高完成15Gb数据量）的所用的全部试剂和耗材成本不高于2000美元；一轮测序反应的过程包括样本文库克隆扩增、测序和数据分析；＊2.4单端读取序列的有效数据读长可达300个碱基；双端读取序列的有效数据读长可达2×300个碱基。
2.5测序质量标准为Q30（即每个碱基的准确度为99.9％），并且75%以上的碱基比例达到Q30；2.6 样本文库克隆扩增原理为桥式PCR法；2.7 每100碱基测序的碱基缺失率<0.001；2.8具备多重SNP分析功能，可在一轮实验中同时检测384个样品，对384×1536＝589824个SNP的DNA片段进行测序比对分析；2.9可精确读取≥12个的连续单个重复碱基（如AAAAAAAAAAAAAAAA）；2.10具备云储存功能，并具有公共交流平台，方便与业内专家共同分析与合作。
2.11测序系统主机内置服务器，主机同时具备样本文库克隆扩增、测序和数据分析功能；无需再配置额外的样本文库克隆扩增和分析服务器；2.12仪器同时具备并免费提供以下软件分析功能：全基因组重测序、定向重测序、De novo 测序、序列特异DNA结合蛋白的ChIP-Seq、组蛋白修饰和表观遗传标记的ChIP-Seq、16s宏基因组学研究、mRNA测序、基于标签的基因表达、小RNA测序、降解DNA样品的测序、末端配对mRNA测序、DNA印迹和等位基因特异的表达、CNV-Seq：用测序测定拷贝数变异研究。
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M I S E Q数据处理步骤 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT
一、数据读出（通过“fasta”文件生成“classification”和“txt”文件）
1、下载Java：for64位。
2、cmd进入DOS界面，进入数据所在的文件夹，逐个分析并命名数据，见下行。
Java-Xmx4g-jar..\\dist\注意：刚开始时输入“cd..”（cd空格加两点）即退回上一级目录，直到回到C盘，fasta原始数据也必须放在C盘。
手打指令，适用本机。
3、用Excel打开目标文件txt文本，“筛选”，选择不同的分类单位进行数据整理和分析。
Class:纲Domain:域Family:科Genus:属Order:目
Phylum:门Kingdom:界Species:种
二、删除chloroplast（叶绿体）
1、将原始文件（“fasta”和“classification”文件）拷贝至与程序“mothur”相同的目录下；
2、找到后缀名为“”的数据原文件（以样品H1为例），用Excel打开；
3、选中“Class”对应的物种列，“筛选”，在下拉框中勾掉物种“chloroplast （叶绿体，非细菌）”，“确定”；复制第一列到粘贴板；
4、新建“”的txt文件，将第一列（物种序列）粘贴，保存、退出；将后缀名改为“.accnos”（窗口界面“组织”、文件夹和搜索选项、查看、勾掉“隐藏已知文件类型的扩展名”）；
5、打开程序“mothur”，输入：(accnos=,fasta=，回车，即从原始的物种序列中选出了去除chloroplast以外的新序列，系统会自动生成一个新的fasta文件“。
三、多个样本时的序列深度归一化处理
1、经过步骤一、二处理后，以各样本的“*.”为基准，重复步骤一，生成新的“classification”和“txt”文件；
2、用Excel打开“txt”文件，记录各个样本的“Totalreads”；以最小的“Totalreads”为基准，进行多个样本的序列深度归一化处理；
3、打开程序“mothur”，输入：
(fasta=式中，*即为最小的“Totalreads”数。
系统会自动生成一个新的fasta文件“。
4、以新的fasta文件为基准，重复步骤一，生成新的“classification”和“txt”文件，对“txt”文件进行整理，进行后续分析。
四、热图
1、数据预处理：将原始相对丰度数据取自然对数（lg），对于丰度为0的物种，人为输入经自然对数处理后的下限值；
2、保存数据为CSV文件，拷贝至R文件夹“h:/Software/R/”；（注意数据呈现方式，是否需要转置）
注意：物种和实验组名称不得出现“—”和空格，以下划线“_”代替。
2、按教程操作（蓝白配图命令）。
pheatmap(hm[1:m,]),col=colorRampPalette(c("white","blue"))(n=100),=1,scale="ro w",key=TRUE,symkey=FALSE,="none",trace="none")
如果想颜色与取了自然对数（lg）后的数据相匹配，则将上面的命令中scale="none"，即可。