淀粉酶的制备及活力测定

2、淀粉酶液的制备


称取 1g 萌发 3 天的小麦种子（芽长约 1cm），置于研钵中， 加入少量石英砂和 2mL 蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离 心管中，用 6mL 蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在 室温下放置提取15～20min，每隔数分钟搅动1次，使其充 分提取。然后在 3 000r/min 转速下离心 10min，将上清液 倒入 100mL 容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为 淀粉酶原液，用于α-淀粉酶活力测定。 吸取上述淀粉酶原液10mL，放入50mL容量瓶中，用蒸馏水 定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于淀粉酶总活 力的测定。

（ 4 ） 1 ％ 淀 粉 溶 液 ： 称 取 1 g 淀 粉 溶 于
100mL0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。
（ 5 ）
0.4M NaOH
实训步骤
1 、称取 1g 萌发 3 天的小麦种子，置于
研钵中。 2. 加入少量的石英砂和 2mL 的蒸馏水， 研磨匀浆。 3. 将匀浆倒入离心管中，用 6mL 蒸馏 水分次将残渣洗入离心管。提取液在 室温下放置提取 15 至 20 分钟。每隔数 分钟搅动一次，使其充分提取。
3、α-淀粉酶活力测定：
① ②
取试管3支 于每管中各加入酶液1mL，在70℃±0.5℃恒温水 浴中准确加热15min，钝化β-淀粉酶。取出后迅 速用流水冷却。 在对照管中加入4mL0.4mol/L氢氧化钠。 在4支试管中各加入1mLpH5.6柠檬酸缓冲液。
③ ④
⑤
将 4 支试管置于恒温水浴中， 40 ℃± 0.5 ℃保温 15min，再向各管分别加入40℃下预热的1%淀粉液 2mL，摇匀，立即放入40℃恒温水浴准确计时保温 5min。取出后向测定管迅速加入4mL0.4mol/L氢氧 化钠，终止酶活动，准备测糖。
取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100mL；

（2）3，5－二硝基水杨酸试剂：精确称
取1g3，5－二硝基水杨酸1g，溶于20mL1mol/L NaOH溶液中， 加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏 水稀释至100mL。盖紧瓶塞，勿使 CO2 进入。若溶液混浊可 过滤后使用；
项目二 淀粉酶的制备及活力测定
姓名：张婉月
班级：生物制药1311 学号：2013040829
组别：第2组
指导老师：彭加平 韦平和
目录

背景知识


实训原理
实验材料及仪器 实训步骤 注意事项 参考文献
背景知识

淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物 和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、 麦芽糖等小分子物质而被机体利用。 淀粉酶属于水解酶类，是催化淀粉、糖原、糊精中糖苷键 水解的一类酶的统称。此类酶广泛存在于动植物和微生物 中。根据对淀粉的作用方式不同，可将淀粉酶分为α-淀粉 酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、脱支酶。
实验材料及仪器
1、材料 萌发的小麦（或稻谷）种子（芽长约
1cm）。 2、仪器设备 分光光度计；离心机；恒温水浴 （37℃，70℃，100℃）；具塞刻度试 管；刻度吸管；100mL容量瓶2个； 25mL比色管15支；试管8支；电子天平； 研钵。
试剂及配制
（1）标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：精确称
凝胶扩散法
降落值法
快速、省时、重现性好、 消耗的材料多,间接测 平行性好、消耗的药品 定α -淀粉酶活性大小 少,适宜于测量大量样 品
α-淀粉酶的工业应用
焙烤工业 淀粉工业 啤酒酿造 酒精工业 纺织退浆 造纸 清洁剂
实训原理：
淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽
糖等小分子物质从而被机体利用。淀粉 酶主要包括α - 淀粉酶和β - 淀粉酶两种。 α-淀粉酶可随机作用于淀粉中的α-1， 4- 糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽 三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的黏 度降低，因此又称为液化酶。β-淀粉酶 可从淀粉的非还原末端进行水解，每次 水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。
2 活性计算


酶活力单位定义：在60℃、PH5.6条件下，每小时从2％的 可溶性淀粉溶液中释放出1mg尔麦芽糖的酶量定义为1个酶 活力单位（U） 淀粉酶活性U按下式计算： U = U = K×（A－A0）/S×（30÷60）×180×F 其中：U——样品淀粉酶活性，U/ml； K——标准曲线斜率； F——样品溶液反应前的总量，ml； S——样品测试量；表1中S＝1ml； 60——1小时为60min； 30——反应时间，min。
麦芽糖标 准液（mL） 蒸馏水 （mL）
麦芽糖含 量（mg）
3,5-二硝基 水杨酸（mL）
0 2.0
0 2.0
0.2 1.8
0.2 2.0
0.6 1.4
0.6 2.0
1.0 1.0
1.0 2.0
1.4 0.6
1.4 2.0
1.8 0.2
1.8 2.0
2.0 0
2.0 2.0

摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加馏水定 容至20mL。以1号管作为空白调零点，在520nm波长下比色 测定吸光度值。以麦芽糖含量为横坐标，光密度为纵坐标， 绘制标准曲线。
α
β - 淀粉酶从非还原端作用于α -1,4 糖苷键，遇到支
链淀粉的α -1,6 键时停止。单独作用时产物为麦芽 糖和β-极限糊精。β-淀粉酶是一种巯基酶，不需要 Ca 2+ 及 Cl —等辅助因子，最适pH偏酸，与α -淀 粉酶相反，它不耐热但觉耐酸，60 ℃保温15min可使 其钝化。
α-淀粉酶活力测定常用的方法
试剂及配制

（3） 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液：

A液（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C6H8O7.H2O 用蒸馏水溶解并定容至1L；
21.01g，

B 液（ 0.1mol/L 柠檬酸钠）：称取 Na3C6H5O7.2H2O 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。 取A液13.7mL与B液26.3mL混匀，即为0.1mol/L pH5.6的柠 檬酸缓冲液；
（ 3 ）如果条件允许，各实验小组可采用不同材料，
参考文献：

[1] Gardner H W.Recent investigations into the lip oxygenase pathway of plants.Biochem Biophysical Ac ta.1991 [2] 莎娜,赵立超,陈永泉.α-淀粉酶对甘薯果脯废糖液澄 清效果的研究
4.
然后在 3000r/min 速下离心 10 分钟。 5. 将上清液过滤，倒入 100mL 容量瓶 中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即 制得α -淀粉酶原液。装入试剂瓶中， 贴标签，保存于低温冰箱中，为以后 的实验使用。
1、麦芽糖标注曲线的制作

取7支干净的具塞刻度试管，号，按表1加入试剂： 试 剂 管 1 2 3 4 号 5 6 7
操作项目 I-1 淀粉酶原液 钝化β-淀粉酶 3，5-二硝基水杨 酸 预保温 1%淀粉溶液 2.0 1.0
α-淀粉酶活力测定 I-2 1.0 置70℃水浴15min，冷却 0 0 I-3 1.0
将各试管和淀粉溶液置于40℃恒温水浴中保温10min 1.0 1.0 1.0
保温
3，5-二硝基水杨 酸 0


W为样品质量，g；
T为反应时间，min。
注意事项：
（ 1 ）样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根
据不同材料酶活性的大小而定。
（ 2 ）为了确保酶促反应时间的准确性，在进行保
温这一步骤时，可以将各试管每隔一定时间依次放 入恒温水浴，准确记录时间，到达5min时取出试管， 立即加入3,5-二硝基水杨酸以终止酶反应，以便尽 量减小因各试管保温时间不同而引起的误差。同时 恒温水浴温度变化应不超过±0.5℃。 例如萌发1d、2d、3d、4d的小麦种子，比较测定结 果，以了解萌发过程中这两种淀粉酶活性的变化。

酶的活力是酶的重要参数，反映的是酶的催化能力，
因此测定酶活力是研究酶的基础。 -淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部 分α -1,4 糖苷键，单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、 α - 极限糊精和少量葡萄糖。 Ca 2+能使α -淀粉酶活 化和稳定，它比较耐热但不耐酸， pH 3.6 以下可使 其钝化。

计算Ⅰ - 2、Ⅰ - 3 光密度平均值与Ⅰ- 1光密度之差，在 标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg），按下列公式计 算α- 淀粉酶的活力。 淀粉酶活力=C×VT/（W×VS×T）



式中，C为从标准曲线上差得的麦芽糖含量，mg；
VT为淀粉酶原液总体积，mL； VS为反应所用淀粉酶原液体积，mL；
实训原理：

淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度 的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀 粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成 的麦芽糖的量表示酶活力。

淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子， 淀粉酶活力最强，其中主要是α- 淀粉酶和β- 淀粉酶。两种 淀粉酶特性不同，α - 淀粉酶不耐酸，在pH3.6 以下迅速钝化。 β-淀粉酶不耐热，在70℃15min钝化。
在40℃恒温水浴中保温5min
2.0 2.0
4.淀粉酶总活力测定
取酶液5ml，用蒸馏水稀释至1000ml，
为稀释酶液。另取 4 支试管编号， 2 支 为对照，2支为测定管。然后加入稀释 酶液1ml。在对照管中加入4ml 0.4mol/L 氢氧化钠。 4 支试管中加入 1mlpH5.6 柠檬酸钠缓冲液。以下步骤 重复α -淀粉酶活力测定⑤步的操作， 同样准备测糖。பைடு நூலகம்
测定方法 DNS 优点 缺点 灵敏、准确、精确度高, 测定步骤较繁,不便分 适宜精确测量小样品 析大量样品,测定范围 α -淀粉酶活性大小 较窄 简便、快速、省时、省 力,消耗材料和药品较 少,不需要特殊仪器,测 定范围较宽 边界不清晰,灵敏度与 准确度较低,不适宜精 确测量α -淀粉酶活性 的大小



谢谢观看！！！
[3] 何国庆 , 丁立孝 . 食品酶学 . 北京 : 化学工业出版社 2009 [4] 周晓云编著.酶技术.北京:石油工业出版社，1995 [5] 罗贵民.酶工程.北京:化学工业出版社，2003 [6] http://zhidao.baidu.com/question/266186296.htm l