液相色谱柱柱效的提高和测算
色谱柱效率
色谱柱效率
色谱柱效率，也被称为柱效能，是指在色谱分离过程中由动力学因素（如操作参数）所决定的分离效能。
它反映了样品通过色谱柱后其区域宽度增加了多少，与样品在两相中的扩散和传质情况有关。
柱效率通常以理论塔板数、有效塔板数、理论塔板高度或有效塔板高度来表示。
理论塔板数（n）越大，理论塔板高度（H）越小，柱效率越高。
影响柱效率的因素有很多，其中载气流速的选择是一个重要的因素。
载气流速慢有利于传质和组分的分离，但会使分析时间延长；而载气流速快则有利于加快分析速度，减少分子扩散，但可能会降低分离度。
因此，选择合适的载气流速对于提高柱效率至关重要。
此外，进样技术、色谱柱的性能和操作条件等因素也会对柱效率产生影响。
例如，采用注射器或六通阀门进样时，需要考虑进样量、进样速度和进样方式等因素，以确保样品能够均匀、快速地进入色谱柱。
同时，色谱柱的材质、长度、内径、固定相的种类和粒度等因素也会对柱效率产生影响。
为了提高柱效率，可以从以下几个方面入手：降低移动相的流速、减少固定相的量、减小固定相的颗粒度、选用低粘度的移动相、适当
提高柱温以及尽量减小停滞移动相的体积等。
然而，需要注意的是，在色谱分析过程中，各种因素是相互联系和制约的，因此需要通过实验和研究来找到最佳的工作条件。
总之，柱效率是色谱分离过程中一个重要的性能指标，它受到多种因素的影响。
为了提高柱效率，需要综合考虑各种因素，并通过实验和研究来找到最佳的操作条件。
液相增加柱效、提高灵敏度的小诀窍
流动相对色谱的影响(TE40) 色谱柱技术 –流动相对色谱的影响 流动相对色谱的影响
液相色谱柱: 液相色谱柱 ZORBAX Eclipse XDB-C8 色谱柱尺寸: 色谱柱尺寸 4.6 x 50 mm 3.5µm
0.025 M H3PO4
流动相: 流动相 A: 含相应的酸的水相 B: 含相应的酸的乙腈 0%-30% B（30 min.内） （ 内 进样量: 进样量 6µL肽标样 肽标样 UV: 254 nm 流速: 流速 1 mL/min 40°C ° 改变有机添加剂 可增加柱效 （提高灵敏度） 提高灵敏度）
温度: 温度 检测器: 检测器 样品: 样品
减小柱径，可增 减小柱径， 加柱效（ 加柱效（提高灵 敏度） 敏度）
色谱柱技术 – 5988-6454EN 使用小体积色谱柱对于检测器 响应时间的重要性 (TE32)
液相色谱柱: 液相色谱柱 ZORBAX StableBond-C18 色谱柱尺寸: 色谱柱尺寸 4.6 x 15 mm 3.5µm
色谱柱技术 – 5988-6468EN 有机改性剂和pH对于选择性的影响 有机改性剂和 对于选择性的影响 (TE5)
液相色谱柱: 液相色谱柱 ZORBAX StableBond-CN 色谱柱尺寸: 色谱柱尺寸 4.6 x 150 mm 5µm
甲氧基苯胺 间位苯甲胺 4-氯-苯胺 3-氨基苯甲腈 3-氯-苯胺 2-氯胺 改变有机相%， 改变有机相 ， 可增加柱效 提高灵敏度） （提高灵敏度）
提高柱温， 提高柱温， 可增加柱效 提高灵敏度） （提高灵敏度）
生物制药 减小毛细管内径来提高 低浓度样品的检测灵敏度 Reducing Capillary ID to Improve Sensitivity for Concentration-Limited Samples
高效液相色谱习题及答案 (2)
高效液相色谱法习题一、思考题1．从分离原理、仪器构造及应用范围上简要比较气相色谱及液相色谱的异同点。
2．液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些与气相色谱相比较, 有哪些主要不同之处 3．在液相色谱中, 提高柱效的途径有哪些其中最有效的途径是什么4．液相色谱有几种类型 5．液-液分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？6．液-固分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？7．化学键合色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？8．离子交换色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？9．离子对色谱的保留机理是什么这种类型的色谱在分析应用中,最适宜分离的物质是什么10．空间排阻色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？11．在液-液分配色谱中，为什么可分为正相色谱及反相色谱？12．何谓化学键合固定相？它有什么突出的优点？13．何谓化学抑制型离子色谱及非抑制型离子色谱？试述它们的基本原理14．何谓梯度洗提？它与气相色谱中的程序升温有何异同之处？15．高效液相色谱进样技术与气相色谱进样技术有和不同之处？16．以液相色谱进行制备有什么优点？二、选择题1．液相色谱适宜的分析对象是（）。
A 低沸点小分子有机化合物B 高沸点大分子有机化合物C 所有有机化合物D 所有化合物2．HPLC与GC的比较，可忽略纵向扩散项，这主要是因为（）。
A 柱前压力高B 流速比GC的快C 流动相粘度较大D 柱温低3．组分在固定相中的质量为MA(g)，在流动相中的质量为MB（g），而该组分在固定相中的浓度为CA（g·mL－1），在流动相中浓度为CB（g·mL－1），则此组分的分配系数是( )。
A mA/mB B mB/mAC CB/CAD CA/CB。
4．液相色谱定量分析时，不要求混合物中每一个组分都出峰的是＿。
液相色谱实验柱效测定
高效液相色谱测定色谱柱的柱效
实验目的：了解高效液相色谱仪的构造及操作
掌握液相色谱柱校和分离度的测定方法
实验原理：柱效常以理论塔板数n或理论塔板高度H表示用来说明柱子性能好坏，理论塔板数越高，柱效越好，分离出的组份峰又尖又高。
色谱柱的理论塔板数按计算公式：n= 16/(t R/ Y )2=5.54 [t R/( Y h/2)]2
实验原理：1.溶液的配制
配制20ppm萘和50ppm苯的混合液
2.实验条件的选择
(1) 反相色谱柱
(2) 流动相甲醇：水（90：10），流量1.0mL·min-1
(3) 监测器紫外光度监测器，254nm
(4) 进样量20uL
(5) 柱温30℃
3．测定
(1) 将配制好的流动相甲醇水溶液脱气15min。
(2) 根据实验条件，将高效液相色谱仪按照操作步骤调节至进样状态，待仪器液路和电
路系统达到平衡时，记录仪基线呈平直，即可进样。
数据处理：根据色谱图计算分离度和理论塔板数。
问题讨论。
液相色谱柱柱效的提高和测算
液相⾊谱柱柱效的提⾼和测算液相⾊谱柱柱效的提⾼和测算叶农摘要本⽂通过对如何提⾼液相⾊谱柱柱效的阐述,介绍了⼏种国际上流⾏的测量和计算柱效值的⽅法。
关键词液相⾊谱柱谱峰扩宽柱效值理论塔板数⼀、提⾼液相⾊谱柱柱效的⽅法我们知道⾊谱峰的扩宽与移动相在热⼒学的分配过程、移动相和固定相中传质阻⼒所引起的不平衡有关,谱峰扩宽(⾮平衡)的程度是流速对传质速率的直接函数。
要提⾼液相⾊谱的效率可从以下⼏⽅⾯⼊⼿。
(1)降低移动相的流速,但会使分析时间延长。
(2)减少固定相的量,但⾊谱柱中样品的负载量也随之减⼩。
(3)减⼩固定相的颗粒度,但不能过分,过分后⾊谱柱的渗透率也会减⼩。
(4)选⽤低粘度的移动相,以利于快速传质,但却不利于多组份分析。
(5)适当提⾼柱温,可降低移动相的粘度,但柱效和分离度也随之降低。
(6)尽量减⼩停滞移动相的体积,但却加快了移动相的流速。
从以上介绍可看出,在⾊谱分析过程中,各种因素是互相联系和制约的。
只有通过对柱效值的跟踪测算,对⾃⼰分析⽅法不断的研究和实践,才能找到最佳的⼯作条件。
⼆、对柱效值进⾏跟踪测算应注意的问题我们也应记住柱效值即塔板数只表⽰该⾊谱柱装填的好坏,只⽤柱效值并不⾜以预测在所有条件下的柱性能,因为在这些条件下,柱性能主要表⽰动⼒学过程对⾊谱柱谱带加宽的量。
其他⼀些影响峰宽的因素,如柱外效应和热⼒学因素(通常表现为峰拖尾),在理想情况下对于确定柱效值并不起重要作⽤。
因为任何⼀个柱性能的定义都必然与⽤此⾊谱柱所做的分离相联系,所以依据⼀个单独的数字来评定柱性能是不切实际的。
对⼤多数⾊谱⼯作者来说,柱性能指的是⾊谱柱⽤于特定分离的能⼒,⽽仅仅有⾼柱效并不能保证这种分离能⼒。
不管⽤什么特定的测试⽅法,都会有⼏个参数影响柱效的测定。
这些参数包括:洗脱液的成分和粘度及其线流速,测定塔板数所⽤的溶质,温度,柱长,填料装填⽅式,颗粒度,还有所选⽤的测量和计算⽅法。
尽管⼤多数柱效测算没有设法消除液相⾊谱仪器系统各部件对表观峰宽的影响,但只要仪器是正常使⽤的,这些影响是次要的。
液相色谱法及质谱分析练习题带答案
液相色谱法及质谱分析练习题带答案一、单选题1、高压、高效、高速是现代液相色谱的特点，下列哪一个不是采用高压的原因（）。
A、可加快流速，缩短分析时间B、高压可使分离效率显著提高C、采用了细粒度固定相所致D、采用了填充毛细管柱正确答案： D2、吸附作用在下面哪种色谱方法中起主要作用。
（）A、液一液色谱法B、液一固色谱法C、键合相色谱法D、离子交换色谱法正确答案： B3、在液相色谱中，常用作固定相又可用作键合相基体的物质是（）。
A、分子筛B、硅胶C、氧化铝D、活性炭正确答案： B4、水在下述色谱中，洗脱能力最弱（作为底剂）的是（）。
A、正相色谱法B、反相色谱法C、吸附色谱法D、空间排阻色谱法正确答案： B5、在液相色谱中，提高色谱柱柱效的最有效途径是（）。
A、减小填料粒度B、适当升高柱温C、降低流动相的流速D、增大流动相的流速正确答案： A6、液相色谱中不影响色谱峰扩展的因素是（）。
A、涡流扩散项B、分子扩散项C、传质扩散项D、柱压效应正确答案： B7、高效液相色谱仪与气相色谱仪比较增加了（）A、恒温箱B、进样装置C、程序升温D、梯度淋洗装置正确答案： D二、判断题1、高效液相色谱适用于大分子，热不稳定及生物试样的分析。
正确答案：正确2、反相分配色谱适于非极性化合物的分离。
正确答案：正确3、液相色谱的流动相又称为淋洗液，改变淋洗液的组成、极性可显著改变组分分离效果。
正确答案：正确4、高效液相色谱法采用梯度洗脱，是为了改变被测组分的保留值，提高分离度。
正确答案：正确5、高压输液泵是高效液相色谱仪的关键部件之一，按其工作原理分为恒流泵和恒压泵。
正确答案：正确6、高效液相色谱柱柱效高，凡是能用液相色谱分析的样品不用气相色谱法分析。
正确答案：错误。
高效液相色谱法的计算方法
高效液相色谱法的计算方法高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。
1、对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪。
色谱柱的填料和流动相的组分应按各品种项下的规定。
常用的色谱柱填料有硅胶和化学键合硅胶。
后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用；离子交换填料，用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等，用于分子排阻色谱等。
注样量一般为数微升。
除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。
在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法（附录ⅣA）项下对溶剂的要求。
正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。
一般色谱图约于20分钟内记录完毕。
2、系统适用性试验按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度和拖尾因子。
(1) 色谱柱的理论板数(N，用于定量表示色谱柱的分离效率，简称柱效)。
在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间t R（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半高峰宽(W h/2)，按n＝5.54(t R/W h/2)2计算色谱柱的理论板数，如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。
(2) 分离度(R)定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。
高效液相色谱柱效能的测定
1.检测器：紫外光度检测器，测试波长254nm 2.流动相：甲醇：水(83：17)，流量0.8 ml/min 3.色谱柱：长250mm，内径4.6mm，装填C-18烷基键合
相(粒度5μm) 4.进样量：20 μL
五、实验步骤：
1. 根据实验条件，将仪器调至可进样状态，待基线平 稳后，即可进样。 2. 吸取标准使用液（含甲苯、萘、联苯各10ug/ml的 正己烷溶液）20μL，注入高效液相色谱仪。 3. 记录下色谱图。 4. 从色谱图中测得甲苯、萘、联苯的保留时间tR，半 峰宽Y1/2，计算对应的理论塔板数n及分离度R。
敏度10-11g。
二、 高效液相色谱法主要类型及分离原理
根据分离原理，高效液相色谱法分为： 液-液色谱及化学键合相法 液-固色谱法 离子对色谱法 离子交换色谱法 空间排阻色谱法
反相键合相色谱法
固定相：极性较小的键合固定相，如硅胶一C18H37、 硅胶一苯基等；
流动相：极性较强的溶剂，如甲醇、乙睛、水和无机 盐的缓冲溶液等。
高效液相色谱图：
数据处理：
甲苯
萘
tR /min
Y1/2 /min
n/
块·m-1
R
n 5.54( tR )2
Y1/ 2
R
tR2 tR1
2 2.35
(Y1/ 2(1)
Y1/
2(2)
)
联苯
天美LC2130 HPLC操作规程
一、开机准备 1.实验室温度应保持在25～30℃之间，湿度小于65%。 2. 根据实验要求，选择合适的色谱柱并安装，准备相
标，混合物能否在色谱柱中得到分离，除取决于选择 合适的固定相外，还与色谱操作条件及色谱柱的装填 状况等因素有关。
柱效测定以及影响因素
速度（cm/h） 60 60 30
20 20
10
3.样品体积 柱效柱效测试通常使用的样品体积为 1%的柱体积（Vc）。当某些硬件条件无法满足时，可以在经验范围内
迚行微小优化以加强对示踪物质的检测能力。然而，值得一提的是，对于柱效好的柱子来说实验中样品体积可能导 致色谱峰明显加宽，降低塔板数,这一点对于小颗粒直径的层析介质而言尤为常见。由于峰宽增大，峰对称性可能有 所改善。这一点与增加检测流速的效果类似。
统为水-丙酮和盐系统，这些系统可分别通过测定吸收值和电导迚行监测。根据层析介质的化学属性，推荐以下样
品和洗脱液：
介质 除疏水合成聚合物， RPC 和 HIC 介质以外 的所有介质 RPC 和 HIC
所有介质
洗脱液 水
样品 1 -2% 丙酮水溶液
20%乙醇
1 -2%丙酮，至少 20%
的乙醇
0.4 M NaCl（溶于水） 0.8 M NaCl（溶于水）
术语 塔板数 平均停留时间* 方差*
2
停留时间** 停留体积** 半峰高峰宽 床高 颗粒半径 理论塔板数
N μ1
σ
tR VR Wh
L d/P HETP
最佳柱效
对于生物过程色谱中使用的有孔介质，其最佳柱效时实验测定的塔板高度 h 小于等于 3。就峰的对称性而
言，理想对称性为接近 As=1。当工作中折合塔板高度 h ≤ 3 时，一般能接受的范围通常在 0.8-1.8 之间。需要谨记
Sepharose Fast Flow,
Sepharose XL， Capto™, MabSelect™
N/m ~20000 ~11000 〉10000 〉10000 ~9000 ~3000
As 0.8~1.5 0.8~1.5 0.8~1.8 0.7~1.3 0.8~1.5 0.8~1.5
常用液相色谱柱的柱效测定方法应趋于统一化
参 考 文 献
［ １］ ＨＡ Ｐ Ｐ Ｃ Ｅ Ｓ Ｒ Ｏ Ｋ Ｔ Ｃ ＯＭＰ Ｅ ＵＴ Ｒ ＭＯ－ ＤＥ Ｐ －５０ Ｓ Ｒ Ｔ Ｏ ＭＡ ＡＬ Ｌ Ｃ １０ Ｉ Ｔ ＵＣ Ｉ Ｎ ＮＵ ． Ｎ
［ ］ Ｃ —１５ ２ Ｐ —！ ００湔浼扑慊 褂檬植 幔 本┘扑
五厂。
［ ］ ３ 计算机基础 教程， 清华大学出版社。 （ 收稿日 期：１８年１月 ８ ） ９４ １ 日
应该 大致相同 。
建议流速为１ 分左右；温度采用室温；半峰宽 毫升／
应为半峰宽处峰的一边的外侧到另一边的内侧，测 量工具应精确到０ １ ． 毫米。 ． 或０ ２ ０ ０ 不难看出，影响柱效测定的因素是很多的。测 定的方法不同，测得的柱效肯定不同，所以测得的 柱效应附有上述的所有实验条件，否则只说某一填 料和某一预装柱的柱效达到多少实在是笼统的很。 所以如果生产填料的厂家，使用单位和装柱单位对 同一填料的色 谱性能有争议的话，最好看一下填料 的批号是否一致，然后再看一下柱效的测定方法和 测试条件是否一致 （ 大体）。所以最好的办法还是 价在大体相同的条件下测定柱效，这样对填料的评 就有了共同的语言，使厂家找到了要质量控制的依 据，用户了解到了填料的性能，以便更好地选用。 （ 公安部１２研究所 李冶） １９
常用液相色谱柱的柱效测定方法应趋于统一化
柱效的高低，不仅反映出填料性能，有时也反 映出装填技术的好坏。所以测定柱效无论对于生产 填料或预装柱的厂家，还是对于使用填料或预装柱 的色谱工作者来说，都是很重要的。 厂家通过柱效测定，达到对填料生产的质量控 制；色谱工作者通过测定柱效，可选择色谱柱并监 察色谱柱使用过程中是否受到污染之目的。可见柱 效的测定很重要。 但是如何进行柱效的测定，是值得研究的一个 问题。不同的色谱柱，柱效固然不同；就是同一根 色谱柱，由于柱效的测定方法不同，诸如所用的化 合物、流动相、流速、测量温度、测量工具及仪器 等等的不同，那么所得到的理论板数也不尽相同。 这样往往对同一种填料或同一根柱子的评价就缺乏 共同语言，往往使填料的生产厂家、用户及装柱单 位之间产生误解，有碍协作。 因此柱效的测定方法应趋于统一化，测定条件
气相色谱习题
气相色谱法习题一、选择1、采用气相色谱法定量时，不必加定量校正因子的方法是。
A 归一化法B 内标法C 外标法D 校正面积归一法2、在气-固色谱分析中，最先流出色谱柱的组分的性质是。
A 溶解能力小B 吸附能力小C 沸点低 D 相对分子质量小。
3、在气相色谱分析中用于定性分析的参数是。
A 保留值 B 峰面积 C 分离度 D 半峰宽4、在气相色谱分析中用于定量分析的参数是。
A 保留时间B 保留体积 C 半峰宽 D 峰面积5、试指出下列说法中哪一个不正确气相色谱法常用的载气是。
A 氢气 B 氮气 C 氧气 D 氦气6、热导池检测器是一种。
A 浓度型检测器 B 质量型检测器C 只对含碳、氢的有机化合物有响应的检测器D 只对含硫、磷化合物有响应的检测器7、使用氢火焰离子化检测器选用下列哪种气体作载气最合适？。
A H2 B He C Ar D N28、果试样中组分的沸点范围很宽，分离不理想，可采取的措施为。
A 选择合适的固定相；B 采用最佳载气线速；C 程序升温；D 降低柱温二、填空1、色谱柱，在高于操作温度下，通载气处理的过程叫色谱柱的。
2、采用气相色谱法定量时，不必加校正因子的定量方法是。
4．不被固定相吸附或溶解的气体如空气、甲烷从进样开始到柱后出现浓度最大值所需的时间称为____________________________。
5．气相色谱分析的基本过程是往气化室进样，气化的试样经_____________分离，然后各组分依次流经_______________它将各组分的物理或化学性质的变化转换成电量变化输给记录仪，描绘成色谱图。
8．气相色谱的仪器一般由、、、和组成。
三简答题1．简要说明气相色谱分析的基本原理。
2．气相色谱仪的基本设备包括哪几部分各有什么作用3．色谱定性的依据是什么主要有那些定性方法4．在色谱内标法定量分析中，内标物该如何选择？5．比较气相色谱法中归一法、内标法、外标法 3 种定量方法的优缺点。
如何保护高效液相色谱柱以提高其使用寿命 液相色谱操作规程
如何保护高效液相色谱柱以提高其使用寿命液相色谱操作规程色谱柱用久后常显现柱压上升，柱效降低，峰形畸变，保留时间更改等变化，如不实行适当措施，色谱柱将无法再使用，缩短色谱柱的使用寿命。
在高效液相色谱仪的使用中色谱柱用久后常显现柱压上升，柱效降低，峰形畸变，保留时间更改等变化，如不实行适当措施，色谱柱将无法再使用，缩短色谱柱的使用寿命。
在高效液相色谱仪的使用中，保持高效液相色谱柱的柱效、容量和渗透特性，延长柱子的使用寿命特别紧要。
1、流动相对色谱柱的损害因素颗粒杂质:目前广泛使用的柱填料直径多在10um以下，微小的颗粒杂质很简单使柱子发生堵塞，因此使用的溶剂应当过滤，柱子上端接头应当装微孔过滤片以阻拦颗粒物进入柱中。
水溶液中的微生物:以水溶液为流动相时，应防止细菌的生长，五氯酚、叠氮化钠、辛酸等能防止细菌生长。
当用水溶液或有机酸缓冲液保护柱子时，一些厌氧霉菌可能在色谱柱中繁殖，堵塞固定相颗粒间的空隙。
pH值:对硅胶基键合相填料，水溶液pH值不可超过2—7.5这一范围，当pH>8时，硅胶会释出生成絮状物堵塞柱子，且难以复原，柱效很快降低，甚至完全失效。
盐类析出:当在流动相缓冲液中加入和水混溶的有机溶剂时，其中的盐类溶解度下降，可析出盐类沉淀，堵塞柱子；加入粘度不同的样品溶液也可能发生仿佛现象。
所以缓冲液中盐的浓度宜低，样品提取液的构成应和流动相匹配。
2、样品对色谱柱的损害因素杂质堵塞:样品中的微粒同样会使柱子堵塞，样品也应进行过滤处理。
样品组分的不可逆吸附:通常被吸附的组分有蛋白质、醣等，可以实行加装保护柱，或使用适应的溶剂反冲来处理。
常用溶剂有四氢呋喃（适用于溶解有机高聚物和工业样品中的焦油）、高浓度的脲或盐酸胍溶液（使蛋白质改性而洗脱）、高离子强度的磷酸盐缓冲液（pH=7，适合反相柱和离子交换柱，可除去蛋白质和醣等）。
样品组分与固定相反应:这种反应对NH2柱的影响较严重，NH2易和酐、酮形成希夫（Schiff）缩合而削减活性点，使保留时间缩短，因此羰基化合物样品和流动相（如丙酮、乙酸乙酯等）不宜使用NH2柱。
高效液相色谱(HPLC)柱效测定
实验六高效液相色谱(HPLC)柱效测定093858 张亚辉一. 实验目的1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。
2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。
3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。
二. 实验原理高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。
在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。
反之，则称为正相色谱分离系统。
反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。
定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。
分离度（R）的计算公式为：R＝ 2[t(R2)-t(R1)] /1.7*(W1＋W2)式中 t(R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t(R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1及W2为此相邻两峰的半峰宽。
除另外有规定外，分离度应大于1.5。
本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。
它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。
但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。
待测物性质见表1。
表1色谱柱测试条件如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC分离检测。
三.仪器与试剂1、仪器Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。
2、试剂甲醇（色谱专用），高纯水四. 实验步骤1、色谱条件色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶（C8）柱温：室温流动相：初始为高纯水：20％，甲醇：80％检测器：DAD检测器;检测波长：220nm；进样体积：20µl定量环，实际注射每次可控制在40µl。
HPLC柱效测定
HPLC柱效测定
以第一主数据为例
n=)2=2=201.881
柱长25cm
H===0.001238
思考题
1、高效液相液相色谱采用3~10微米的固定相有何优点?同时它又给实验带来什么问题?如何克服？
答：这个是从色谱理论H-u曲线推导出来的结果.在100kg压力左右,5微米的柱效最高.但随加工制造技术的提高,更高压力的泵如400kg,也能够大量的普及.而在400kg左右,1-3微米的固定相柱效更高,所以在HPLC的基础上又有UPLC仪器了.
2、紫外光度检测器是否适用于检测所有的有机化合物,为什么?
答：不是理由有2 ，第一是并不是所有的有机物都有强的特征紫外吸收，只有特定的集团会有这样的情况。
第二是有频率相近的吸收峰的物质很多，不能完全区分开来。
3、若实验中的色谱峰无法完全分离，应如何改善实验条件色谱柱？
答：色谱柱使用时间长了，柱效会降低，会影响到分离度的，改善方法是更换新的色谱柱。
如果已经是新的色谱柱了，分离度还不好，那可以采用更长一些的色谱柱，也会增加分离度；流动相的调节，通过调节流动相中各组分的比例，使流动相的极性发生变化，分离效率会不一样，这要针对要检测的成分具体情况进行分析确定；改变柱温，相同条件下升高柱温，会增大色谱柱的分离能力而提高分离度。
色谱柱的性能 色谱柱技术指标
色谱柱的性能色谱柱技术指标色谱柱的性能与液相色谱柱的性能相关的因素很多，基质（matrix）或者说担体、载体的化学性质、键合相（固定液）的化学性质、填料形状大小粒度分布、碳量和键合度等等。
色谱柱填料可以由基质直接构成，如硅胶、氧化铝、高交联度的苯乙烯—二乙烯苯或者甲基丙烯酸酯等等；也可以在这些基质的基础上涂布或化学键合固定液来构成，如：较为经典的各种ODS柱、氨基柱、氰基柱等。
一、基质的特点：1、硅胶硅胶是陶瓷性质的无机物基质，刚性大，不易变形。
化学性质较稳定，但对于水溶液尤其碱性水溶液仍旧是不稳定的，即使表面经过良好的化学键合，覆盖了固定液，还是要注意水、碱性溶液、酸性溶液对硅胶的溶解作用，基质或者说是柱床（packed bed）溶解对色谱柱的影响是致命的。
以硅胶为基质的填料构成了目前绝大多数的色谱柱填料。
纯硅胶填料适合分别溶于有机溶剂的极性、弱极性的非强离解型的化合物，硅胶也可以做凝胶色谱但柱效较低。
硅胶基质键合固定相的高压液相填料，有其他填料无法比拟的高分别效能。
2、二氧化铝二氧化铝和硅胶相像，但对水溶液、酸性碱性水溶液溶液更加不稳定。
所以，极少用作键合固定相的基质，也是适合分别溶于有机溶剂的极性、弱极性的非强离解型的化合物，尤其是分别芳香族碳氢化合物。
酸性易离解的化合物简单在二氧化铝上形成死吸附。
另外，氧化铝分别几何异构体本领优于硅胶。
3、聚合物填料聚合物基质受压会变形，压力限度低但pH使用范围宽。
苯乙烯—二乙烯苯基质疏水性强，使用任何流动相，在整个pH范围内稳定，可以用强酸、强碱来清洗色谱柱。
甲基丙烯酸酯基质比苯乙烯—二乙烯苯疏水性更强，但可以通过适当的功能基修饰变成亲水性的。
由于不耐压、有溶胀性，所以聚合物填料适合用于大分子像蛋白质或合成的高聚物，另外还可以制成分子排阻、离子交换柱。
近年进展快速的大孔树脂，实际上主体就是苯乙烯—二乙烯苯聚合物或仿佛的合成高聚物。
由于硅胶基质的确定地位，以下紧要以硅胶为例。
提高液相色谱柱柱效的方法 液相色谱解决方案
提高液相色谱柱柱效的方法液相色谱解决方案色谱柱的柱效能是评价色谱性能的一项紧要指标，混合物能否在色谱柱中得到分别，除取决于选择合适的固定相外，还与色谱操作条件及色谱柱的装填情形等因素有关。
在确定的色谱操作条件下，色谱柱的柱效可用理论塔板数或理论塔板高度来衡量。
一般说来塔板数愈多，或塔板高度愈小，色谱柱的分别效能愈好。
提高液相色谱柱柱效的方法：1、降低移动相的流速，但会使分析时间延长。
2、削减固定相的量，但色谱柱中样品的负载量也随之减小。
3、减小固定相的颗粒度，但不能过分，过分后色谱柱的渗透率也会减小。
4、选用低粘度的移动相，以利于快速传质，但却不利于多组份分析。
5、适当提高柱温，可降低移动相的粘度，但柱效和分别度也随之降低。
6、尽量减小停滞移动相的体积，但却加快了移动相的流速。
从以上介绍可看出，在色谱分析过程中，各种因素是相互联系和制约的。
只有通过对柱效值的跟踪测算，对本身分析方法不断的讨论和实践，才能找到较佳的工作条件。
气相色谱和液相色谱微型化中的关键问题在器微型化过程中,尺寸的缩小不仅要考虑材料的性质和制造上的可能,还要从原理上考虑尺寸缩小后所带来的一系列问题。
这些问题包括：（1）分别系统中被调配的分子个数是否大于106,由于只有大于106才能得到符合统计结果的数据；（2）因分别通道尺寸缩小,自然提高了单位柱长的效率,但是总长度的削减可能使总分别效能远低于常规；（3）对于质量敏感型检测器,经过分别柱后单位时间内到达检测器的分子个数是否充分检测原理所要求的最小数目；（4）对于浓度型检测器,到达检测池的分子数目是否能充分符合统计规律的分子数目；（5）检测微区内的外加能量密度是否超过被检测分子所能承受的极限；（6）微量流动相的输送与掌控；（7）因材料尺寸的缩小,表面层氧化或腐蚀对器件功能的影响。
最后,色谱仪器微型化所带来的好处不仅仅是单位长度分别效率的提高,而是总分别本领的保持甚至提高；不仅仅是分别系统或某个部件的微型化,而是整体的微型化；不仅仅是质量灵敏度的提高,而是浓度灵敏度的保持或提高；不仅仅是能量和物质的低消耗,而是使用的便利和友好；不仅仅是整体尺寸的缩小,更紧要的是整机的稳定性和牢靠性的提高!下面分别讨论上述7个问题。
常见液相色谱柱性能比较
常见液相色谱柱性能比较一、高性能色谱柱特点：柱效高，价格高，通用性好，使用寿命长，pH范围宽1、Waters公司Xbridge2005年waters公司推出，杂化颗粒柱。
优点：pH 1-12,在高pH状态下，没有能与此色谱柱匹敌的，目前市场的宽pH色谱柱在高pH的状态下（9-12）普遍寿命很短，如Gemini，资生堂公司Capcell，YMCPro-C18，包括waters的第一代杂化柱Xterra都是寿命不长，Zorbax Extend更是不堪。
柱效与一流的硅胶柱相当，甚至有过之无不及，杂化颗粒柱和聚合物色谱柱的问题在于柱效，Xterra和常见的PSDVB的色谱柱都有不错的pH范围，但是柱效低的问题无法解决，这是聚合物填料一般比较软且不耐压的原因造成。
在如此宽的pH范围，最大的好处是可以在化合物的保留平台区去开发方法（pH1-3,pH9-12），这样能得到更稳定更容易重现的方法，对酸性，中性，尤其是碱性化合物都能得到理想的峰形。
注：Waters UPLC色谱柱与Xbridge采用同类型填料，只是颗粒度是1.7um，所以不再重复。
缺点：价格高，平均每支￥7000多的，不是大多数中国客户可以接受的。
2、MerckChromolith整体化色谱柱Merck公司2001年推出。
优点：高流速、低压力，可以快速分析样品，因为压力低，所以可以串联色谱柱以获得更高的柱效而不用担心色谱柱耐压问题，低压力是因为硅胶棒的大量中孔的存在，中孔的存在也让这支色谱柱不怕堵，在处理比较脏的样品的时候会优势很大（如中药），实际的寿命也因此延长。
这个色谱柱最大的特点是柱效高出峰时间快，特别适合之前分析时间超长的实验条件，目前很好的例子就是人参的指纹图谱，因为成分复杂，之前出峰要2个小时，现在用整体化色谱柱30min就可以分析完了（已有报导），且不影响柱效，类似于UPLC，但不像UPLC那么容易堵。
缺点：规格单一，单价比较高，单价￥7000左右，所以通过串联获得更高柱效的方式显得比较奢侈。
色谱小讲堂013-影响液相柱柱效测试结果的因素
色谱小讲堂013-影响液相柱柱效测试结果的因素校测试方法可以根据每根色谱柱附带的测试报告（Performance Report）提供的方法条件进行试验。
通常实际测试结果比色谱柱所附的测试报告结果偏低是正常的。
因为Agilent测试塔板数的HPLC系统是专门设计的，整个系统扩散体积非常小。
如果测试结果与报告中有很大不同，很大可能是由于色谱系统配置以及死体积等因素的影响。
通常需要考虑的因素有以下几方面：1.不同柱外体积的影响柱外体积是指“额外”或“外部”（相对于色谱柱）体积，是系统的一部分，尤其是各LC 部件、色谱柱之间的连接管线体积、进样体积和流通池体积。
下面的例子就显示了柱外体积的影响（图一）。
当使用4.6×30mm短柱时，10µL的柱外体积可以得到良好的分离结果，当加上一段管线形成50µL的柱外体积，色谱峰变宽、分离度降低。
在向系统中添加体积不明的管线时，这种情况经常发生。
添加一段太长的管线，或内径较大的短管时，会使高柱效色谱柱的分离度变差。
图二展示了不同内径的管线对色谱峰展宽的影响。
管线内径越大，样品谱带在管线内发生的扩散也就越大，色谱峰展宽也就越严重。
原则上，系统的最大柱外体积（管线体积、进样体积和检测器体积）不应超过柱体积的10%。
图二2.管线和色谱柱连接的接头是否合适图三您需要使用与色谱柱匹配并连接恰当的管线和接头。
如图三所示，连接不恰当的接头，会造成色谱峰的展宽。
比如，如果密封圈位置不正确，管线从密封圈伸出过长，会使密封圈与色谱柱入口螺纹产生空隙而发生漏夜；管线从密封圈伸出过短，将产生一段死体积，形成混合腔，导致柱外体积增加，使色谱峰展宽。
故一定要使用正确的接头，并保证色谱柱末端接头位置正确。
上篇讲述的在液相柱柱效测试过程中，不同柱外体积以及管线和色谱柱连接的接头是否合适两大因素对结果的影响，接下来，在下篇中会继续分析在测试过程中通常需要考虑的其他因素。
仪器分析课后题答案（第四版）
仪器分析课后题答案（第四版）第⼆章⽓相⾊谱分析1. 当下列参数改变时:(1)柱长缩短,(2)固定相改变,(3)流动相流速增加,(4)相⽐减少,是否会引起分配系数的改变?为什么?答:固定相改变会引起分配系数的改变,因为分配系数只与组分的性质及固定相与流动相的性质有关.所以（1）柱长缩短不会引起分配系数改变（2）固定相改变会引起分配系数改变（3）流动相流速增加不会引起分配系数改变（4）相⽐减少不会引起分配系数改变2.当下列参数改变时: (1)柱长增加,(2)固定相量增加,(3)流动相流速减⼩,(4)相⽐增⼤,是否会引起分配⽐的变化?为什么?答: k=K/b,⽽b=VM/VS ,分配⽐除了与组分,两相的性质,柱温,柱压有关外,还与相⽐有关,⽽与流动相流速,柱长⽆关.故:(1)不变化,(2)增加,(3)不改变,(4)减⼩3．能否根据理论塔板数来判断分离的可能性?为什么?答: 不能,有效塔板数仅表⽰柱效能的⾼低,柱分离能⼒发挥程度的标志,⽽分离的可能性取决于组分在固定相和流动相之间分配系数的差异.4．在⼀根2 m 长的⾊谱柱上,分析⼀个混合物,得到以下数据:苯、甲苯、及⼄苯的保留时间分别为1?20“, 2…2”及3?1“；半峰宽为0.211cm, 0.291cm, 0.409cm ，已知记录纸速为1200mm.h-1,求⾊谱柱对每种组分的理论塔板数及塔板⾼度。
解：三种组分保留值⽤记录纸上的距离表⽰时为：苯：（1+20/60）×[（1200/10）/60]=2.67cm甲苯：(2+2/60) ×2=4.07cm⼄苯: (3+1/60) ×2=6.03cm甲苯和⼄苯分别为：1083.7,0.18cm; 1204.2,0.17cm5．试述速率⽅程中A, B, C三项的物理意义. H-u 曲线有何⽤途?曲线的形状主要受那些因素的影响?解: A 称为涡流扩散项, B 为分⼦扩散项，C 为传质阻⼒项。
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液相色谱柱柱效的提高和测算
叶农
摘要本文通过对如何提高液相色谱柱柱效的阐述,介绍了几种国际上流行的测量和计算柱效值的方法。
关键词液相色谱柱谱峰扩宽柱效值理论塔板数
一、提高液相色谱柱柱效的方法
我们知道色谱峰的扩宽与移动相在热力学的分配过程、移动相和固定相中传质阻力所引起的不平衡有关,谱峰扩宽(非平衡)的程度是流速对传质速率的直接函数。
要提高液相色谱的效率可从以下几方面入手。
(1)降低移动相的流速,但会使分析时间延长。
(2)减少固定相的量,但色谱柱中样品的负载量也随之减小。
(3)减小固定相的颗粒度,但不能过分,过分后色谱柱的渗透率也会减小。
(4)选用低粘度的移动相,以利于快速传质,但却不利于多组份分析。
(5)适当提高柱温,可降低移动相的粘度,但柱效和分离度也随之降低。
(6)尽量减小停滞移动相的体积,但却加快了移动相的流速。
从以上介绍可看出,在色谱分析过程中,各种因素是互相联系和制约的。
只有通过对柱效值的跟踪测算,对自己分析方法不断的研究和实践,才能找到最佳的工作条件。
二、对柱效值进行跟踪测算应注意的问题
我们也应记住柱效值即塔板数只表示该色谱柱装填的好坏,只用柱效值并不足以预测在所有条件下的柱性能,因为在这些条件下,柱性能主要表示动力学过程对色谱柱谱带加宽的量。
其他一些影响峰宽的因素,如柱外效应和热力学因素(通常表现为峰拖尾),在理想情况下对于确定柱效值并不起重要作用。
因为任何一个柱性能的定义都必然与用此色谱柱所做的分离相联系,所以依据一个单独的数字来评定柱性能是不切实际的。
对大多数色谱工作者来说,柱性能指的是色谱柱用于特定分离的能力,而仅仅有高柱效并不能保证这种分离能力。
不管用什么特定的测试方法,都会有几个参数影响柱效的测定。
这些参数包括:洗脱液的成分
和粘度及其线流速,测定塔板数所用的溶质,温度,柱长,填料装填方式,颗粒度,还有所选用的测量和计算方法。
尽管大多数柱效测算没有设法消除液相色谱仪器系统各部件对表观峰宽的影响,但只要仪器是正常使用的,这些影响是次要的。
而测量和计算方法对柱效值的确定起着极大的作用。
三、几种测量和计算柱效值的方法
因为色谱峰是假定样品浓度在移动相和固定相中呈正态分布而得到的样品谱带分布,故常常把色谱峰型看作正态曲线来计算理论塔板数。
因此计算柱效(以理论塔板数n为单位)的公式
习惯上定义为:
式中tR为色谱峰的保留时间; σ2是以时间为单位测量色谱峰的偏差;a是和峰高(从测峰宽的基线量起)有关的常数, ωb是峰宽,表示由色谱峰顶点与色谱峰两侧拐点处做切线与峰底基线相交两点间的距离。
图1所示为正态峰轮廓所测量峰宽处的峰高与7种可能的测定n 的方法所对应的常数a值之间的关系。
拐点法(Inflectionmethod):在拐点处峰宽等于标准偏差的2倍,该法对不对称色谱峰最不敏感。
半峰宽法(Widthathalfpeak):该法最常用,计算者的主观误差降到最小,有很好的重复性。
切线法(Tangentmethod):由于切线是人为确定的,色谱峰的对称性对该法的偏差起决定作用。
3σ,4σ和5σ法:这些方法对色谱峰非对称性的灵敏度随上述顺序增加,测量位置越接近于峰底,其结果受拖尾或前延的影响越大。
5σ法对于确定基线的准确性也很灵敏。
峰高/峰面积法(Height/areamethod):该法可通过积分仪或计算机直接计算出n值。
n=2π(ht R)2/A2,h为峰高,A为峰面积。
量矩法(Momentmethod):此法避免了假设特定的峰型,如果有合适的,正确的程序计算设备,它能够最精确地表示理论塔板数。
非对称法(Asymmetry-basedmethod):从峰顶向基线画一垂线,在峰高10%处测得垂线两边峰宽A,B的长度,并计算其比率。
由于便于测量,该法最能反映色谱峰的非对称性。
在新的国家液相色谱仪检定规程(征求意见稿)中,也增加了对色谱柱柱性能的测试,采用的方法是半峰宽法和非对称法。
四、结论
假如一个色谱峰真是正态峰型,那么每种计算方法都会得到同样的结果。
然而即使一些比较理想的仪器和倾向于得到对称峰型的溶质,由于柱内的槽或空隙,也会出现非正态峰型。
所以不同的计算方法将会得到相差较大的n值。
通常偏离正态模型的峰型表示为“前延”或“拖尾”。
对于这些峰型,越在峰的高处测量,计算的理论塔板数值就越大(准确性越低)。
在许多情况下,色谱工作者需要能反映整个峰型(包括拖尾)的柱效值,同时为了保证定量的重复性,也需要色谱峰很好的对称性。
这时对色谱峰非对称性最敏感的计算方法最适合。
如果目的
仅仅是要监测色谱柱从第一次使用到使用寿命结束这一过程中的柱效,那么以上任何一种方法都可以,应选择最简便的方法。