基因工程疫苗GeneticEngineeringVaccine

四、重组活载体疫苗 （一）重组病毒载体 1、重组禽痘病毒(Fowl Poxvirus)载体 疫苗: 宿主范围广、滴度高、稳定性好、 基因容量大、非必需基因多，已经成 功地应用于表达禽流感病毒、新城疫 病毒、传染性支气管炎病毒和马立克 氏病病毒的保护性抗原基因。
2、腺病毒（Adnovirus）载体疫苗：安
核酸疫苗
定义：指将编码某一抗原的外源基因直接导入动物细 胞，在宿主细胞中表达并合成抗原蛋白，激发机体 一系列类似疫苗接种的免疫应答，起到预防和治疗 的目的。 核酸疫苗的特点 1、在体内表达的抗原保持天然构型 2、可构建多价疫苗 3、安全，无整合，无返祖 4、制备简单，降低成本 5、便于运输
核酸疫苗研究现状
传统疫苗
弱毒苗研制方法 1、自然弱毒：如鸡新城疫LaSota；马立克氏病 CV1988 2、异源免疫：Jenner以牛痘病毒预防天花；火鸡疱 疹病毒预防马立克氏病。 3、在异源动物或细胞上传代致弱：猪瘟兔化弱毒株 是将猪瘟病毒在兔体多次传代致弱而获得的；驴白 细胞传代致弱的马传染性贫血疫苗；乳兔肺致弱的 猪支原体性肺炎疫苗等。 4、改变体外培养条件：改变温度、加入诱变剂、射 线处理，如在加有醋酸铊的培养基中分离的抗醋酸 铊的猪副伤寒沙门氏菌和马流产沙门氏菌的弱毒苗。
基因工程疫苗 Genetic Engineering Vaccine
疫苗
1976年E. Jenner 从挤奶女工感染的痘疱中获取疱 浆，接种接种8岁男孩J.Phipps 的手臂上，结果男 孩未感染上天花 1798年医学界正式承认疫苗 1980年世界卫生组织宣布全球消灭天花 疫苗：一切通过注射和粘膜途径接种，可诱导机体 产生针对特定致病原的特异性抗体或细胞免疫，从 而使机体获得保护或消灭该致病原能力的生物制品， 包括蛋白质、多糖、核酸、活载体或感染因子等。
全、感染非分裂细胞、增殖滴度高、可在 消化道和呼吸道繁殖，并能诱导粘膜免疫， 可制成口服制剂预防消化道和呼吸 道感染。
3、疱疹病毒（Herpesvirus）载体疫苗：
基因组大 （150kb)、容量大、宿主范围窄， 故安全、很多疱疹病毒经粘膜感染，诱导 粘膜免疫。 已用于载体研究的病毒有：单 纯疱疹病毒、伪狂犬病毒、火鸡疱疹病毒、 牛疱疹病毒I型、马疱疹病毒I型、传染性支 气管炎等。
基因工程疫苗
一、合成多肽疫苗及制剂 合成多肽疫苗（Synthetic Peptide Vaccine）： 是用化学方法合成的病源微生物的保护性多 肽并将其连接到大分子载体上，再加入佐剂 制成的疫苗。如丙肝病毒外膜蛋白E2内筛选 出一段多肽，可刺激机体产生保护性抗体。 从蛇毒分离出一个13肽（IKAIAALAKKLL）， 其对革兰氏阴性和阳性菌均有极强的杀菌能 力。
疫苗的基本特性
安全性：是否致弱？是否反毒？灭活是否彻 底？是否污染？
免疫原性：免疫效果，抗体滴度，持续时间， 接种次数 稳定性：生物稳定性，物理稳定性
传统疫苗
灭活苗的研制方法
1、物理灭活
热灭活：56-57C一小时 紫外线灭活：最大限度保留抗原的完整性和免疫原性
2、来自百度文库学灭活
福尔马林：浓度、温度、时间和pH Beta-丙内酯：作用核酸，保持免疫原性，水解产物丙酮 酸对人体无害，但是有致癌作用，对疫苗产生人员有害。 乙烯亚胺和双乙烯亚胺：原理与Beta- 丙内酯相同，但未 发现致癌作用，被广泛应用。
（二）重组细菌载体 优点：培养方便、外源基因容量大、刺激 细胞免疫力强，因为细菌本身起到佐剂的 作用。 常用的细菌载体：乳酸菌（Lactic acid bacteria),安全级微 生物，包括乳酸杆菌、乳酸球菌和双歧杆 菌。 成功实列：表达破伤风毒素片段C、布氏杆菌 L7/L12蛋白。
（三）构建重组载体疫苗的原则 1、载体的选择：载体的安全性，一般来自 疫苗株；载体的组织适性应与表达的抗原 一致；活载体对外源基因的容量。 2、转移载体的构建：有足够长的同源臂序 列（800-1000bp)；有一个适当的启动子。 3、外源基因的插入位点的选择：外源基因 的插入不应影响病毒或细菌的复制，即非 必需基因。为降低毒力，可将外源基因插 入到毒力基因。
二、亚单位疫苗
优点： 安全性好 无热源、变应原、免疫抑制源 与感染产生的免疫应答相区别 研究亚单位疫苗的策略： 确定保护性基因，如鸡传染性支气管炎病毒的S 基因；轮状病毒的Vp7和Vp4基因；爱滋病病毒 gp120 抗原表达系统： 原核表达系统和真核表达系统
三、基因缺失疫苗（Deletion mutant vaccine ） 定义：将病毒致病基因进行缺失，从而获 得弱毒疫苗 优点：毒力稳定、返祖机率小、免疫力强、 免疫期短。 实例: 伪狂犬病毒TK基因缺失使病毒致弱 而 获得。1986年获得美国FDA批准的第一 个基因工程苗。
1、人类核酸疫苗 1993 Ulmer 将流感病毒NP基因cDNA克隆到真核表达载体， 注射小鼠肌肉可诱导特异性IgG和CTL应答； 1993 Wang等人将HIVgp120 基因重组质粒接种小鼠，产生特 异性抗体，此抗体可中和HIV对体外培养细胞的感染。 1994 Davis等将乙型肝炎表面抗原克隆到真核表达载体，注射 小鼠后，产生特异性抗体。 2、 兽医核酸疫苗 1993 Cox等人将牛单纯疱疹病毒I型（BHV-I）三种不同的和 蛋白分别插入pPSVCAT表达载体中，注射天然宿主动物后 产生特异性中和抗体， 对强度攻击有保护效果。 此外对禽流感疫苗、伪狂犬病疫苗、猪流感疫苗、牛病毒性 腹泻疫苗、新城疫疫苗等得到广泛应用。
疫苗种类
传统疫苗 灭活苗 弱毒苗 亚单位疫苗 新型疫苗 基因工程亚单位疫苗 基因缺失活疫苗 基因工程活载体疫苗 核酸疫苗
疫苗的基本成分
抗原=疫苗 佐剂：铝制佐剂、油制佐剂 防腐剂：硫柳汞、2-苯氧乙醇、氯仿 稳定剂：乳糖、明胶、山梨醇 灭火剂：物理法：加热、紫外线；化学法： 丙酮、酚、甲醛