免疫共沉淀技术的研究进展_郭纯

免疫共沉淀技术的研究进展

S t u d y P r o g r e s s o f C o-i m m u n o p r e c i p i t a t i o n T e c h n o l o g y

郭纯

(湖南省人民医院,湖南　长沙　410005)

[摘要]　免疫共沉淀(c o-i m m u n o p r e c i p i t a t i o n)技术是检测蛋白质间相互作用的经典方法,也是较常用的方法。文章对近10余年有关免疫共沉淀技术的原理和应用及其优缺点的分析进行文献综述。

[关键词]　免疫共沉淀;蛋白质;相互作用;技术

[A b s t r a c t]　C o-i m m u n o p r e c i p i t a t i o n t e c h n o l o g y i s c l a s s i c a l m e t h o dt o e x a m i n e t h e i n t e r a c t i o na m o n g p r o t e i n s,a l s o ac o m m o n m e t h o d.T h e p a p e r m a d e a l i t e r a t u r er e v i e w,w h i c hr e f e r r e dt ot h e p r i n c i p l e o f c o-i m m u n o p r e c i p i t a t i o nt e c h n o l o g y a n di t sm e r i t o r f l a w.

[K e y w o r d s]　C o-i m m u n o p r e c i p i t a t i o n;P r o t e i n;I n t e r a c t i o n;T e c h n o l o g y

[中图分类号]R392-33　[文献标识码]A　[文章编号]1672-951X(2007)12-0086-04

蛋白质间的相互作用控制着大量的细胞活动事件,如细胞的增殖、分化和死亡。通过蛋白质间相互作用,可改变细胞内蛋白质的动力学特征。如底物结合特性、催化活性;也可产生新的结合位点,改变蛋白质对底物的特异性;还可失活其它蛋白质,调控其它基因表达。因此,只有使蛋白质间相互作用顺利进行,细胞的正常生命活动过程才有保障。由于蛋白质间相互作用具有如此重大的意义,因此其检测方法的研究也备受重视由生化方法,如蛋自质亲和层析(p r o t e i n a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y)、亲和印迹(a f f i n i t yb l o t t i n g)、免疫沉淀(i m m u n o p r e c i p i t a t i o n)及交联(c r o s s-l i n k i n g),发展到当今的分子生物学方法,如以基因文库为基础的蛋白探测(p r o-t e i np r o b i n g)、噬菌体显示(p h a g e d i s p l a y)及双杂交系统(t w o -h y b r i ds y s t e m)等。另外,还发展了可定性和定量检测蛋白质间相互作用的简便又快捷的方法,如表面胞质团共振(s u r-f a c e p l a s m o n r e s o n a n c e)等。通过这些方法的联合使用,实验得出的蛋白质间的相互作用的结论显得更为可靠[1]。

1　免疫共沉淀基本原理

细胞裂解物中加入抗体,这样可与已知抗原形成特异的免疫复合物,若存在与已知抗原相互作用的蛋白质,则免疫复合物中还应包含这种蛋白质,经过洗脱,收集免疫复合物,然后分离该蛋白质,对该蛋白质进行N端氨基酸序列分析,推断出相应的核苷酸序列。将包含活性物质的组织或细胞构建成c D N A文库,以上述核苷酸序列为探针从c D N A文库中分离出c D N A克隆。

1.1　免疫共沉淀技术的主要步骤

1.1.1　用磷酸盐缓冲液洗30块10c m培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1m l冰冷的E B C裂解缓冲液中。

1.1.2　将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15m i n。

1.1.3　收集上清(约30m l)并加入30μg的适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1h。

1.1.4　加入0.9m l的蛋白质A-S e p h a r o s e悬液,4℃摇动免疫沉淀物30m i n。

1.1.5　用含900m m o l/L N a C l的N E T N洗蛋白A-S e p h a r o s e 混合物,再重复洗5次。最后,用N E T N洗1次。

1.1.6　吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×S D S胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4m i n。

1.1.7　将样品加入到大孔的不连续S D S-P A G E梯度胶中,在10m A的恒定电流下电泳过夜。

1.1.8　通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。

1.1.9　从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1m l 50%乙腈洗两次,每次3m i n。

1.1.10　用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱。

1.1.11　通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在A B I 477A或494A机器上进行自动E d m a n降解测序。

2　免疫共沉淀技术的应用

2.1　肿瘤　鼻咽癌细胞中p53相结合蛋白质的分离与鉴定:免疫共沉淀与L C2E S I2M S/M S分析相结合的方法对H N E1细胞蛋白条带3鉴定的p53相互作用蛋白之一H S P78进行了验证。首次在鼻咽癌细胞中鉴定了9个p53结合蛋白,为阐明鼻咽癌中p53蛋白聚集及失活的机制提供了重要

第13卷第12期 中　医　药　导　报 2007年12月V o l.13　N o.12 G u i d i n g J o u r n a l o f T C M D e c e m b e r.2007 DOI:10.13862/ 43-1446/r.2007.12.038