利用原生质体育种技术获得优良酵母菌设计实验路线
酵母菌的分离纯化酵母菌的分离纯化实验方案
酵母菌的分离纯化酵母菌的分离纯化实验方案导读:就爱阅读网友为您分享以下“酵母菌的分离纯化实验方案”资讯，希望对您有所帮助，感谢您对的支持!酵母菌的分离纯化实验目的1. 了解培养基的配置与灭菌技术;2. 无菌操作技术;3. 工业微生物的分离与纯化技术;4. 工业微生物的检测及保藏。
基本原理1、培养基是人工配置的用于培养、分离、鉴定和保存各种微生物的营养基质。
也适合微生物在生命活动中积累各种代谢产物。
由于微生物种类不同，营养类型各异以及实验目的不同，因此培养基的种类也很多。
不同微生物对营养的要求不同，在配置时根据微生物对PH的要求选择合适的PH。
1由于本次实验主要是分离纯化酵母菌，所以配置的培养基是适合酵母菌生长麦芽汁平板培养基，同时添加抗生素抑制霉菌及其它菌的生长。
2、接种和培养过程中必须保证不被其它微生物所污染，关键在于严格进行正确的无菌操作，但是绝对无菌是不可能的，只能人工创造相对无菌的环境。
所以本次实验无菌操作是在超净工作台的酒精灯火焰旁进行。
3、把特定微生物从混杂的微生物群体中分离出来而获得某一种或某一株微生物的过程叫微生物的分离与纯化。
首先根据其生长特性设计只利于此菌生长的条件，再根据各种稀释法使他们在固体培养基上单独长成菌落。
分离纯化的方法通常有:稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法和平板划线。
此次实验采用梯度稀释涂布平板法。
4、微生物检测项目最常用的是细胞数的检测，方法比较多，主要有显微镜直接计数法、平板菌落计数法(CFU)、光电比浊计数法等。
本次实验设计酵母菌的数量检测，选用显微镜直接计数法和平板菌落计数法。
实验器材仪器设备恒温水浴锅、电热干燥箱、蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、恒温摇床、水浴锅、电炉、铜锅、酒精灯、接种环、电子天平、研钵、光学显微镜、血细胞计数器玻璃器2皿烧杯、锥形瓶、大小试管、培养皿、漏斗、三角涂棒、吸管、试管架、玻璃涂棒、盖玻片试剂与材料苹果、大麦芽、琼脂、蒸馏水、碘液、抗生素、染色液其它纱布、滤纸实验内容及操作步骤(一)、样品的选择酵母菌一般在果园的土壤中或者水果的表面含量较多，因此选择苹果为样品。
酵母菌的纯培养实验原理
酵母菌的纯培养实验原理酵母菌是一种单细胞真核生物，广泛存在于自然界中，常见于土壤、果皮和发酵食品等环境中。
酵母菌的纯培养实验是一种常用的实验手段，通过这种实验可以得到纯净的酵母菌培养物，为后续的研究提供了可靠的基础。
酵母菌的纯培养实验主要包括以下几个步骤：酵母菌的分离、酵母菌的培养和酵母菌的纯化。
酵母菌的分离是实验的第一步。
我们可以从自然界中采集到含有酵母菌的样品，比如果皮、土壤等。
将样品放入培养基中，利用其富含的养分和适宜的温度等条件，促使酵母菌开始生长。
然后，通过显微镜观察，可以看到培养基中存在着许多酵母菌细胞。
选取单个酵母菌细胞，将其转移到另一个培养基中，再次进行培养。
经过多次的分离，我们可以得到纯净的酵母菌培养物。
酵母菌的培养是纯培养实验的关键步骤。
酵母菌的培养基一般由碳源、氮源、矿物质和维生素等组成，提供了酵母菌生长所需的养分。
培养基的配制需要根据酵母菌的需求来确定，以确保酵母菌能够正常生长和繁殖。
在培养过程中，温度和氧气供应也是需要注意的因素。
一般情况下，酵母菌的最适生长温度为28-30摄氏度，过高或过低的温度都会对其生长产生不利影响。
此外，酵母菌对氧气的需求较高，需要提供充足的氧气供应。
酵母菌的纯化是实验的最后一步。
在酵母菌培养物中，可能会存在其他微生物的杂菌。
为了获得纯净的酵母菌培养物，我们可以采用多种方法，如温度选择法、抗生素选择法和营养选择法等。
这些方法可以通过调节培养基中的温度、添加抗生素或改变培养基中的营养成分，来选择性地培养酵母菌，排除其他微生物的干扰。
通过以上的步骤，我们可以得到纯净的酵母菌培养物。
这些纯净的酵母菌培养物可以用于研究酵母菌的生理特性、代谢途径、基因表达和蛋白质功能等方面的问题。
同时，纯培养的酵母菌也为酵母菌在工业生产中的应用提供了基础。
总结起来，酵母菌的纯培养实验是一种重要的实验手段，通过分离、培养和纯化等步骤，可以得到纯净的酵母菌培养物。
这些纯净的酵母菌培养物可以为酵母菌的研究提供可靠的基础，也为酵母菌在工业生产中的应用提供了有力支持。
高中生物学新课程选择性必修3实验教学设计2：酵母菌的纯化培养
杂菌不混入发酵物 毒。
验 中呢？
教
环节二 实验探究
学 活 动 设 计
1. 视频展示酵母 菌培养基的成分、 配置方法，倒平板 和平板划线操作的 基本流程。 2.巡回检查学生进 行实验的过程，提 醒学生安全操作。 3.针对学生的疑问 进行点拨解答。
1.观看视频，明确实验的流 程和操作步骤，归纳培养基 的组成成分，分析平板倒置 的原因和平板划线法纯化分 离微生物的原理。 2.小组分工合作完成培养基 的配置。 3.完成倒平板和平板划线操 作。
让学生在感性 认识的基础上理性 分析归纳培养基的 配置、平板倒置的 原因、平板划线法 的原理，加深对基 础知识的理解。 通过观看视频，规 范实验操作。
环节三 思维提升
1.平板倒置原因？ 2.设置未接种平板 组的意义是什么？ 3.为什么每一次划 线前，要用酒精灯 灼烧接种环，并且 要从上一次划线的 末端开始划线？ 4.为什么最后一次 划线和第一次的划 线不能相连？ 5.划线完毕后灼烧 接种环的原因？
学生活动 环节一 情景导入
设计意图
设问：自制酸奶容
思考并回答问题
实
易引发肠胃不适， 主要是由于在制作 过程中有杂菌混 入。那么，怎样才 能保证无处不在的
首先要尽量做到密封条 件下的发酵；其次，所用器 具材料使用之前要做好消毒 工作；最后，制作环境要清 洁卫生，并经常用紫外灯消
让学生初步认 识防止杂菌污染， 获得纯净的微生物 培养物的重要性。
环节四 分享交流
引导、评价
与教师一起梳理和总结，结 合已有知识储备，发表观点， 并为自己的观点寻求证据。
培养学生的批判性 思维。
环节五 课堂小结
展示 PPT 概念图 体会、必记。
增强模型建构意 识。
原生质体融合育种
原生质体融合育种摘要原生质体融合育种克服了远缘杂交不亲和的障碍，可以提高重组频率，使得遗传物质的交换、传递更完整，成为微生物育种的一种重要方式。
其过程包括原生质体制备和再生、原生质体融合以及融合体检出等步骤。
在每个步骤中均要考虑到其应注意的因素，从而提高原生质体育种的效率，达到快速育种的目的。
因原生质体融合育种的优势，其在多功能菌种选育、工程菌选育和工业生产育种等方面应用广泛。
关键词原生质体制备融合育种原生质体再生融合体检出引言传统的杂交育种具有一定的局限性，需要受到亲和力的影响，并且要求亲本有性的分化，而原生质体育种则克服了这些缺点。
当细菌细胞壁被剥离，剩下由原生质膜包围的原生质部分称为原生质体。
原生质体融合是指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。
[1]原生质体融合不受种属限制，能够完整的传递遗传物质，使得重组几率提高进而提高育种速度。
[1-2]育种步骤可分为五大步骤：直接亲本及其遗传标记的选择、双亲本原生质体制备和再生、亲本原生质体诱导融合、融合重组体分离、遗传标记分析和测定。
1.亲本遗传标记的选择进行原生质体融合的双亲本一般要携带遗传标记，以顺利地筛选到融合子。
常用营养缺陷型、抗性、荧光染色、温度敏感性、孢子颜色、菌落形态等作为标记。
其中营养缺陷型是常用而有效的选择手段。
[3]2.原生质体制备制备原生质体是融合育种的前提，为了制备原生质体，需要将包围细胞的细胞壁去除掉。
去壁的方法很多，主要有机械法、酶法和非酶法，现在使用较多的是酶法。
[4]2.1酶法制备原生质体的条件（1）菌体年龄微生物的生理状态决定了原生质体的形成，而菌龄明显影响了原生质体的形成率，菌龄过长不利于释放原生质体，过短则菌丝体容易破裂。
丝状真菌一般选择年轻的尖端生长点的菌丝；细菌与霉菌一般采用对数生长期，而放线菌以对数期到静止期的转换期为好。
[5]（2）稳定剂原生质体由于失去了细胞壁因此对环境十分敏感，渗透压尤为重要。
酵母实验教案设计方案模板
一、实验名称酵母发酵实验二、实验目的1. 了解酵母在发酵过程中的作用。
2. 掌握酵母发酵的基本原理和实验操作方法。
3. 培养学生的实验操作技能和观察能力。
三、实验原理酵母是一种单细胞真菌，在适宜的条件下，酵母能够将糖类物质转化为酒精和二氧化碳。
本实验通过观察酵母发酵过程中酒精和二氧化碳的产生，验证酵母的发酵作用。
四、实验材料与试剂1. 实验材料：酵母粉、葡萄糖、琼脂、蒸馏水、烧杯、试管、酒精灯、酒精、滴管、pH试纸、碘液、锥形瓶、玻璃棒等。
2. 实验试剂：酵母粉、葡萄糖、琼脂、蒸馏水、碘液、酒精等。
五、实验步骤1. 准备实验材料：将琼脂加入蒸馏水中，加热溶解后，冷却至室温备用。
2. 配制培养基：将葡萄糖加入琼脂溶液中，搅拌均匀，倒入锥形瓶中，待凝固后，制成固体培养基。
3. 接种酵母：用无菌滴管将酵母粉接种于固体培养基上，用玻璃棒轻轻搅拌，使酵母均匀分布。
4. 观察酵母发酵：将接种后的培养基置于37℃恒温培养箱中培养，每隔一定时间观察酵母菌的生长情况和酒精、二氧化碳的产生。
5. 测定pH值：用pH试纸测定发酵过程中培养基的pH值变化。
6. 验证二氧化碳产生：将装有发酵培养基的锥形瓶倒置，观察瓶底是否有气泡产生。
7. 验证酒精产生：用碘液检测发酵过程中酒精的产生。
六、实验注意事项1. 实验过程中要保持无菌操作，避免污染。
2. 实验过程中要严格遵守实验操作规程，确保实验结果准确。
3. 注意观察实验现象，做好实验记录。
七、实验报告要求1. 实验报告应包括实验目的、原理、材料与试剂、实验步骤、实验结果、实验讨论等内容。
2. 实验结果应包括酵母菌的生长情况、pH值变化、二氧化碳和酒精的产生情况等。
3. 实验讨论应结合实验结果，分析酵母发酵过程中的变化和原因。
八、实验拓展1. 探究不同温度、不同浓度的葡萄糖对酵母发酵的影响。
2. 研究其他微生物的发酵作用，如乳酸菌、醋酸菌等。
3. 了解发酵技术在食品、医药、化工等领域的应用。
原生质体融合育种
（二）原生质体融合的影响因素 １、融合剂 电场融合的优点： 适于动植物、微生物细胞；融合频率高 可在显微镜下观察
（二）原生质体融合的影响因素
１、融合剂
２、温度 20~30℃
３、亲株的亲和力和原生质体的活性
４、无机离子
PEG介导融合 钙离子、镁离子
电场融合
糖或糖醇
四、融合体再生 复原： 再生培养基 细胞壁重建 形成菌落 P239 图9.8
第五节 酵母菌原生质体融合育种 一、酵母细胞壁结构和遗传标记 菌龄对原生质体形成影响大 亲本灭火的方法：紫外线
热 药物
第五节 酵母菌原生质体融合育种 一、酵母原生质体制备 p259 预处理：EDTA；巯基乙醇
蜗牛酶
第六节 霉菌原生质体融合育种 二、培养基及相关溶液 p262 （1）查氏培养基的作用：菌丝生长 （3）酶液的制备：
（2）菌体培养方式：
1.平板玻璃纸法：
丝状菌
2.振荡沉没培养法
细菌和酵母菌
酶法分离原生质体的影响因素？
（3）菌体年龄
丝状真菌
菌丝体尖端细胞
放线菌
对数期到静止期
细菌
对数期
酵母菌
菌体同步化
酶法分离原生质体的影响因素？
（4）稳定剂
高渗溶液
无机盐：NaCl、KCl、MgSO4、CaCl 微生物原生质体育种 三、原生质体转化育种 何种形式DNA转化率高？ 质粒
第一节 微生物原生质体育种
五、其他微生物原生质体育种 脂质体转移 原生质体转染等
第二节 微生物原生质体融合育种
微生物原生质体融合育种：
通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原 生质体发生融合，并产生重组子的过程。
生物实验教案：中学生物实验《酵母发酵条件探究》设计
生物实验教案：中学生物实验《酵母发酵条件探究》设计一、引言中学生物实验在培养学生科学实验能力的同时，也有助于提高他们的科学思维和研究兴趣。
本教案旨在设计一项生物实验，名为《酵母发酵条件探究》，通过改变不同条件下的酵母发酵情况，让学生了解酵母发酵的基本原理和影响因素，并培养学生的实验设计和数据分析能力。
本教案将对实验的目的、所需材料、实验步骤、数据记录和实验结果分析进行详细描述。
二、实验目的本实验的目的是让学生了解酵母发酵的条件以及不同条件对酵母发酵效果的影响。
通过实验，学生将学会如何设计并进行实际操作，以便最大限度地掌握实验技能，培养他们的科学思维和创新能力。
三、实验材料1. 酵母粉2. 砂糖3. 盐4. 温水5. 温度计6. 量杯7. 实验管8. 密封瓶9. 实验记录表格四、实验步骤1. 准备工作：a) 将酵母粉、砂糖和盐分别称量好b) 准备一定量的温水c) 温水的温度应在实验开始前测量并记录2. 实验设计：a) 将4个实验管标记为A、B、C、Db) 在A实验管中加入10ml温水和5g酵母粉，搅拌均匀c) 在B实验管中加入10ml温水、5g酵母粉和5g砂糖，搅拌均匀d) 在C实验管中加入10ml温水、5g酵母粉和5g盐，搅拌均匀e) 在D实验管中加入10ml温水、5g酵母粉、5g砂糖和5g盐，搅拌均匀3. 实验操作：a) 将实验管A、B、C、D放置在温度恒定的环境中，定时观察酵母发酵的情况b) 在实验过程中，要记录温度的变化以及酵母的发酵状态5. 数据记录：a) 记录每个实验管中酵母的发酵时间和产生的气体量b) 使用实验记录表格记录数据，确保准确性和规范性6. 实验结果分析：a) 比较不同条件下酵母发酵的时间和产生的气体量b) 分析酵母发酵所需的最佳温度、理想的盐浓度以及糖对发酵的影响七、实验结果与讨论通过对实验结果的观察和数据分析，我们可以得出一些结论：1. 酵母发酵的最佳温度为X摄氏度，超过或低于该温度将会影响酵母发酵效果。
从环境中分离酵母菌 实验设计方案
实验设计方案从环境中分离酵母菌班级：10级生科（2）班组员:刘楠楠: 201008010222潘婷: 201008010225李炜昊：201008010221马森:201008010224实验：从环境中分离出酵母菌实验设计方案一、采样采样的理由：1、酵母菌与人类的关系密切酵母菌是一类单细胞真菌的俗称，分类学上分属于子囊菌纲半知菌类特征:1. 个体一般以单细胞状态存在；2. 多数营出芽生殖，有的裂殖；3. 能发酵糖类产能；4. 细胞壁常含有甘露聚糖；5. 喜在含糖量较高、酸度较大的水生环境中生长。
酵母菌分布：主要生长在偏酸的含糖环境中，在水果、蜜饯的表面和果园土壤中最为常见。
种类：据1982年的资料，已知的酵母有56属，500多种。
酵母菌与人类的关系极其密切。
千百年来，人类几乎天天离不开酵母菌，例如酒类的生产，面包的制作，乙醇和甘油发酵，石油及油品的脱蜡，饲用、药用等的生产。
2、酵母菌细胞的形态和构造电子显微镜下的酿酒酵母细胞结构示意图细胞直径比细菌粗10倍左右，如Saccharomyces cerevisiae细胞的宽度为2.5~10μm，长度为4.5~21μm。
因此在光学显微镜下可以模糊地看到它们细胞内的各种结构分化。
酵母菌细胞的形态通常有球状、卵圆状、椭圆状、柱状或香肠状等多种。
细胞壁：酵母细胞壁呈“三明治”结构外层：甘露聚糖（约占30%，以α-糖苷键联结（并非所有酵母菌都有）内层：葡聚糖（约占30-40%，由D-葡萄糖以β-糖苷键联结）中间层：蛋白质（含6-8%，多为酶类）细胞膜：酵母菌的细胞膜与原核生物的基本相同。
但有的酵母菌如酿酒酵母中含有固醇类（甾醇）、VitD的前体----麦角固醇，这在原核生物是罕见的。
细胞核:核膜：核孔40～70nm ，透性比任何生物膜都大。
•染色体:由DNA和组蛋白牢固结合而成，呈线状, 数目因种而异。
•核仁：核内有一或几个区域rRNA含量很高，这一区域为核仁，是合成核糖体的场所。
酵母菌细胞融合-实验操作
酵母菌细胞融合实验一、实验目的学习酵母菌原生质体制备和再生技术，为了解酵母菌为材料的外源基因转移等技术奠定基础。
二、实验原理酵母菌如酿酒酵母，在遗传学和分子生物学的研究中有很大作用，尤其是近些年来，随着科技的进步，酵母菌的遗传操作如转化、基因克隆和外源基因在酵母受体中的表达等技术都有了突破性的进展。
作为受体系统的酵母菌原生质体在这些技术中有独特的地位。
这种经溶菌酶处理脱壁后的细胞（脱壁不完全者称原生质球）既可以作为不同种属间细胞融合的母体，实现细胞器等大结构的转移，又可作为外源基因转移的受体，大大提高基因转移的效率。
这些新技术不仅促进了酵母菌遗传学的发展，而且很多已应用到构建新的酿酒业酵母。
本实验以酿酒酵母为材料，进行原生质体的分离制备和再生。
酵母菌原生质体的制备一般采用蜗牛酶、酵母溶菌酶或其它细胞壁溶解酶类。
分离制备过程受许多因素的影响，如不同菌株的生长期、细胞浓度、溶菌酶类型和用量、处理时间和温度等。
所以整个实验过程设计应综合考虑各种因素，才能获得较好的效果。
分离制备的原生质体在适当的再生培养基上培养时，可以再生出细胞壁而恢复完整细胞状态，即完成再生过程，这也是以原生质体为受体的所有实验技术最终能实现的一个关键步骤。
在原生质体制备中，应选用适当生长时期的菌体作为分离的材料。
一般来说，对数生长期的酵母菌细胞易脱壁，静止期细胞较难甚至不可能形成原生质体。
而不同菌种的生长对数期也略有差异，一般在12～16小时之间（108细胞/ml）。
制成的原生质体悬浮液在0℃条件下保存4～6小时，不会影响融合再生率。
所以欲进行原生质体融合，应在制备后尽快进行，以免时间过长，影响再生。
分离过程中采用的β-巯基乙醇可使细胞壁组分中的二硫键破坏，使蜗牛酶易于分解细胞壁。
此外，渗透压的调节可用0.8mol/L山梨醇、16％蔗糖，或者0.6mol/L KCl溶液。
三、实验材料菌种：酿酒酵母SP-48、L-酵母：器具和试剂：恒温摇床、恒温水浴、显微镜、台式离心机、培养皿、试管、过滤灭菌装置。
从土壤中分离提纯高效的酵母菌
从土壤中分离提纯高效的酵母菌主要内容：利用各种微生物实验技术，从土壤中分离并提纯酵母菌，再通过检测酵母菌发酵速率，从而筛选出高效的酵母菌。
关键词：分离提纯高效酵母菌在土壤中分离酵母菌，因此土壤的采样地点在果树下较好。
采集好土壤，将土壤配制成10^-2悬液，主要方法是称取1g土壤，放入三角瓶，迅速倒入99ml无菌水，震荡5-10min即成所需的土壤悬液。
1.由于土壤中酵母菌含量较低，因此在分离前要先进行富集培养24h。
2.接下来是配制培养基，由于要分离的是酵母菌，配制马丁氏培养基。
3.对培养基进行灭菌放入高压蒸汽灭菌锅115℃/30min4.取出后待50℃以下是加入链霉素，每一百克三毫升5.队超净台消毒，点燃酒精灯6.在酒精灯旁倒平板。
7.接种，画线。
8.放入26℃保温箱3-4d。
9.取生长较好的六个菌落分别接入0.05mol/L4ml的六个试管中，编号1-6。
10.3d后检测葡萄糖含量。
11.配置新制的氢氧化铜0.5mol/L50ml12.将强氧化铜分别放入六个试管中每个4ml。
摇匀加热。
13. 5min后比较六个试管的颜色深浅。
编号颜色1褐色'++褐色+2褐色'--3褐色-4褐色+5褐色6结论：三号试管的颜色最浅，所含葡萄糖最少，所以三号试管的酵母菌效率最高。
结果讨论：实验比较成功，但是培养基的菌株较少，这可能和富集培养的时间太短有关系，忘了设置对照试验。
选取高校教务军，可以重复做这个实验，选出比较高效的酵母菌。
注意:1.注意培养基的灭菌2.注意紫外线只能在无人的时候开启3.注意接种环要灼烧彻底4.注意在培养箱中放培养技师要倒置5.注意统一变量。
酵母菌诱变育种
酵母菌原生质体融合育种第一部分：酵母菌原生质体融合育种一、基本原理进行微生物原生质体融合时，首先必须消除细胞壁，它是微生物细胞之间进行遗传物质交换的主要障碍。
在酵母属进行细胞融合时，通常采用蜗牛酶除去细胞壁，采用聚乙二醇促使细胞膜融合。
细胞膜融合之后还必须经过细胞质融合、细胞核重组、细胞壁再生等一系列过程，才能形成具有生活能力的新菌株。
融合后的细胞有两种可能：一是形成异核体，即染色体DNA 不发生重组，两种细胞的染色体共存于一个细胞内，形成异核体，这是不稳定的融合。
另一是形成重组融合子，通过连续传代、分离、纯化，可以区别这两类融合。
应该指出，即使真正的重组融合子，在传代中也有可能发生分离，产生回复或新的遗传重组体。
因此，必须经过多次分离，纯化才能获得稳定的融合子二、实验材料（一）菌种：酵母菌（二）培养基：1、完全培养基（液体CM）2、完全培养基（固体CM）在液体培养基加入2%琼脂3、基本培养基（MM）葡萄糖柠檬酸钠培养基或YNB培养基4、再生完全培养基固体完全培养基中加入0.5mol/L的蔗糖(三) 缓冲液(1) 0.1 mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液。
(2) 高渗缓冲液，于上述缓冲液中加入0.8 mol/L 甘露醇。
(四) 原生质体稳定液(SMM)0.5 mol/L 蔗糖、20 mol/L MgC12、0.02 mol/L 顺丁烯二酸，调pH 6.5。
(五) 促融剂40％聚乙二醇 (PEG)的SMM 溶液。
(六) 器皿培养皿、移液管、试管、容量瓶、锥形瓶、离心管、玻璃棒、显微镜、离心机等。
四、试验内容(一) 原生质体的制备1．活化菌体将单倍体酿酒酵母菌Y-1 和Y-4 活化分别转接新鲜斜面。
自新鲜斜面分别挑取一环接入装有25 mL 完全培养基的锥形瓶中，30℃培养16 h 至对数期。
2．离心洗涤、收集细胞分别取5 mL 上述培养至对数生长期的酵母细胞培养液，3000 r/min 离心 10 min，弃上清液，向沉淀的菌体中加入5 mL 缓冲液，用无菌接种环，搅散菌体，振荡均匀后离心洗涤一次，再用5 mL 高渗缓冲液离心洗涤一次。
利用原生质体育种技术获得优良酵母菌设计实验路线
利用原生质体育种技术获得优良酵母菌设计实验路线一、引言原生质体是一种独立的细胞结构，能够从细胞中分离出来，其膜结构与细胞膜相似，内含有细胞质、细胞器和液泡等细胞组分。
利用原生质体进行质体育种技术可以快速筛选和培育出优良的酵母菌株，提高酵母菌的发酵能力和产物产量。
本文将结合原生质体育种技术的原理和操作步骤，设计一条实验路线，以获得优良的酵母菌株。
二、实验原理原生质体育种技术是利用细胞外靶酶介导外源DNA进入酵母细胞质的一种技术。
其步骤包括：1）制备原生质体，将酵母细胞经过适当处理（如酶解细胞壁）制备成原生质体；2）选择合适的外源DNA，如含有目标基因的质粒；3）利用凝集素介导质粒与原生质体的结合，使质粒进入原生质提；4）将质粒整合到酵母基因组中，通过筛选培养条件促使原生质体内的外源基因表达。
三、实验步骤1.酵母菌细胞培养选择优良的酵母菌株，进行预培养。
在含有适宜培养基的培养瓶中，加入适量酵母菌液，经过恒温摇床培养，直至菌体生长到对数期（约达到OD600≈1）。
2.细胞壁酶解将酵母菌细胞收取，用含有Zymolyase的酶解缓冲液进行细胞壁酶解。
将酵母菌菌体与酶解缓冲液按照一定比例混合，恒温摇床酶解一定时间，使得酵母菌细胞壁酶解。
3.质体分离酶解后的细胞在低速离心下，使得原生质体分离出来。
去除上清液，保留沉淀中的原生质体。
4.质粒与原生质体结合准备含有目标基因的质粒，并与原生质体进行结合。
可以利用凝集素对质粒进行修饰，使质粒能够与原生质体特异性结合。
5.内化质粒将质粒与凝集素修饰的原生质体进行混合，经过适当条件的处理，使质粒进入原生质体内。
6.利用选择性培养基筛选培养原生质体内的酵母菌，用含有选择性抗生素的培养基进行筛选，筛选出带有外源基因的酵母菌。
7.验证外源基因表达通过PCR或蛋白质表达分析等技术，验证筛选出的酵母菌是否具有外源基因的表达。
8.进一步培养和优选将表达外源基因的酵母菌进行进一步培养，优选出其发酵能力和产物产量更高的菌株。
酵母原生质体制备实验
酵母原生质体制备实验标签：酵母原生质体制备原生质体由原生质分化形成，具体包括细胞膜和膜内细胞质及其他具有生命活性的细胞器。
植物和动物的如细胞核、线粒体和高尔基体等，而细菌如核糖体、拟核等。
实验方法实验方法基本方案实验材料酵母试剂、试剂盒YPD 酵母消解缓冲液山梨醇抽提缓冲液贮存缓冲液液氮仪器、耗材摇床水浴锅转子离心机培养箱实验步骤1. 将酵母菌接种于YPD培养基（100 ml 到20 L），剧烈摇动或强制通气条件下培养至对数中期（OD600≈1~5）。
培养物在预称重的离心瓶中于4℃，1 500 g 离心5 min。
2. 确定酵母细胞的湿重，它与压紧的细胞体积大致相同。
在所有的后续步骤中菌体的量将当作1体积来考虑。
3. 细胞用2~4体积冰水重悬，并立即于4℃，1 500 g 离心5 min，加入1体积含30 mmol/l DTT的酵母消解酶缓冲液重悬细胞、室温放置15 min。
4. 于4℃，1 500 g 离心5 min，菌体用3体积的酵母消解酶缓冲液重悬。
5. 在每毫升原压紧细胞中加入2 mg（200 U）酵母消解酶-100T，于30℃水平摇床以大约50 r/min 的转速温育40 min，通过水渗破法确定菌体是否完全转变为原生质体，如果原生质体化不完全，应继续温育直到完全。
6. 1 500 g 离心原生质体5 min，小心弃上清，原生质体球沉淀块不如细胞沉淀块般紧密。
7. 用2体积冰冷的酵母消解酶缓冲液轻轻重悬沉淀，原生质体1 500 g 离心5 min，重复2次。
8. 用2体枳酵母消解酶缓冲液轻轻重悬沉淀，不要试图得到均一的悬液，只需将沉淀物从管壁上洗下来，悬转10~20次，于1 500 g 离心10 min回收原生质体。
9. 用玻璃棒仔细将原生质体沉淀重悬于1体积裂解缓冲液中。
10. 在Dounce 匀浆器中用最紧密的研杵，冲击15~20次以裂解原生质体。
11. 往超离心管中加入一半管体积原生质体裂解液，再加等体积的抽提缓冲液，将离心管封口。
实验四 酵母菌原生质体细胞融合
实验四酵母菌原生质体细胞融合（一）实验目的学习以酵母菌为材料的原生质体细胞融合的方法。
（二）原理（略）（三）实验材料1.菌种：S.cerevisiae Y-1 a ade-，S.cerevisiae Y-2 his、leu、thr。
2.培养基：（1）完全培养基（YPAD）：葡萄糖2%，酵母膏1%，盐酸腺嘌呤0.04%，蛋白胨2%，pH5.5（2）基本培养基：葡萄糖2%，YNB0.67%，pH5.5，琼脂2%（处理琼脂）（3）再生完全培养基：每100毫升完全培养基中加入18.2g山梨醇。
固体再加入2%琼脂。
（4）再生完全培养基软琼脂：组分同再生完全培养基，加入0.8～1%琼脂。
（5）再生基本培养基：与基本培养基组分相同，加入18.2%山梨醇，再加入处理琼脂2%。
（6）再生基本培养基软琼脂：组分同再生基本培养基，加入处理琼脂0.8～1%。
（7）生孢子培养基3.溶液：（1）ST溶液：1mol/L山梨醇，0.01mol/Ltris-HCl（pH7.4）（2）Zymolyase酶混合液：10mLST溶液，0.2mL0.05mol/L EDTA（pH7.5），Zymolyase酶1mg，过滤除菌（3）STC溶液：ST溶液中，加入0.01mol/LCaCl2（4）PTC溶液：35%PEG-4000，0.01mol/L tris-HCl（pH7.4），0.01mol/LCaCl2（5）0.05mol/LEDTA溶液（6）0.5mol/Lβ-巯基乙醇（四）方法与步骤1.菌体前培养分别从斜面取1环菌种接种于装有20mL完全培养基的250mL三角瓶中，30℃振荡培养16～18h；分别取2mL培养物接种于装有20mL完全培养基的250mL三角瓶中，30℃振荡培养6～8h，呈对数生长状态。
将上述培养液分别离心（3500r/min，10min）收集菌体，用10mL 无菌水离心洗涤菌体两次，尽可能出去杂质。
2.原生质体制备（1）将两亲本细胞分别悬浮于10mL溶液（25mL0.05mol/LEDTA和1mL0.5mol/Lβ-巯基乙醇混合液）中，30℃振荡处理10min。
酵母菌细胞融合-实验操作
酵母菌细胞融合实验一、实验目的学习酵母菌原生质体制备和再生技术，为了解酵母菌为材料的外源基因转移等技术奠定基础。
二、实验原理酵母菌如酿酒酵母，在遗传学和分子生物学的研究中有很大作用，尤其是近些年来，随着科技的进步，酵母菌的遗传操作如转化、基因克隆和外源基因在酵母受体中的表达等技术都有了突破性的进展。
作为受体系统的酵母菌原生质体在这些技术中有独特的地位。
这种经溶菌酶处理脱壁后的细胞（脱壁不完全者称原生质球）既可以作为不同种属间细胞融合的母体，实现细胞器等大结构的转移，又可作为外源基因转移的受体，大大提高基因转移的效率。
这些新技术不仅促进了酵母菌遗传学的发展，而且很多已应用到构建新的酿酒业酵母。
本实验以酿酒酵母为材料，进行原生质体的分离制备和再生。
酵母菌原生质体的制备一般采用蜗牛酶、酵母溶菌酶或其它细胞壁溶解酶类。
分离制备过程受许多因素的影响，如不同菌株的生长期、细胞浓度、溶菌酶类型和用量、处理时间和温度等。
所以整个实验过程设计应综合考虑各种因素，才能获得较好的效果。
分离制备的原生质体在适当的再生培养基上培养时，可以再生出细胞壁而恢复完整细胞状态，即完成再生过程，这也是以原生质体为受体的所有实验技术最终能实现的一个关键步骤。
在原生质体制备中，应选用适当生长时期的菌体作为分离的材料。
一般来说，对数生长期的酵母菌细胞易脱壁，静止期细胞较难甚至不可能形成原生质体。
而不同菌种的生长对数期也略有差异，一般在12～16小时之间（108细胞/ml）。
制成的原生质体悬浮液在0℃条件下保存4～6小时，不会影响融合再生率。
所以欲进行原生质体融合，应在制备后尽快进行，以免时间过长，影响再生。
分离过程中采用的β-巯基乙醇可使细胞壁组分中的二硫键破坏，使蜗牛酶易于分解细胞壁。
此外，渗透压的调节可用0.8mol/L山梨醇、16％蔗糖，或者0.6mol/L KCl溶液。
三、实验材料菌种：酿酒酵母SP-48、L-酵母：器具和试剂：恒温摇床、恒温水浴、显微镜、台式离心机、培养皿、试管、过滤灭菌装置。
优良菌种选育(原生质体融合)
洗涤菌体
酶解释放原生质体
洗涤菌体
酶解释放原生质体
分离纯化原生质体
分离纯化原生质体
AB原生质体等量混合
原生质体融合
再生
原生质体的融合方法
原生质体融 合方法
自发融合
融合概率低， 一般不推荐
诱导融合 激光诱导融合 电诱导融合
化学诱导融合
不需要仪器，操作 简单，但PEG对细胞 －16－ 有毒性，原生质体 融合率低 无毒无害，直观操作， 融合率较高，但需要在 专门的电融合仪
再生培养基
• • • 用MgSO4、甘露醇、山梨糖、蔗糖为渗透剂，不同的微 生物种类应选择不同的再生培养基。 营养因子，酵母膏、酪蛋白、氨基酸、糖类 原生质体保护剂扩张剂：牛血清白蛋白、人血清白蛋 白、明胶等对原生质体具有保护作用，同时起到原生 质体扩张剂作用，刺激原生质体再生。 加入再生细胞壁诱导物与前体物质：在培养基中加明 胶、细胞壁残片甚至纤维素都有刺激原生质体再生的 功能
纤维素酶 Cellulase
酵母裂解酶 Zymolyase β1,3葡聚糖酶
蜗牛酶 商品酶 Novozyme234来自 Trichoderma harzianum Lywallzyme 广东微生物研究所溶壁酶 Glucuronidase 葡聚糖苷酸酶
原生质体释放有关的因素
酶解时间：20min-7h左右，一般细菌酶解时间较短， 真菌酶解时间较长。 pH值：细菌如枯草芽孢杆菌最适pH7.5-8.5，低于 pH7对原生质体的制备率影响较大。真菌如黄青霉 菌最适pH为5.5，在pH值4.0-8.0范围内均可释放原 生质体。 预处理剂：青霉素，巯基乙醇，二硫苏糖醇 渗透压稳定剂：KCl，NaCl，CaCl2，MgSO4，蔗糖， 甘露糖，山梨醇。一般丝状真菌比较适宜以无机盐 为稳压剂，酵母菌则使用糖醇做稳压剂比较好。
一种酵母原生质体的制备方法(一)
一种酵母原生质体的制备方法(一)
一种酵母原生质体的制备方法
引言
酵母原生质体是研究酵母生物学和细胞功能的重要工具。
本文将详细介绍一种酵母原生质体的制备方法，包括材料和步骤。
材料
•酵母菌株
•酵母培养基
•液氮
•酶（如裂解酶）
•加压破碎机
步骤
1.酵母菌株的培养
–选取合适的酵母菌株，并在适宜的酵母培养基中培养。
–确保培养条件适宜，包括温度、pH值和营养物质。
2.收获酵母菌细胞
–将培养好的酵母菌细胞收获到离心管中。
–使用低温和高速离心将酵母菌细胞沉淀到管底。
3.冻存酵母细胞
–将收获到的酵母菌细胞用液氮快速冷冻保存。
–这样可以保持细胞的完整性和活力。
4.酵母细胞的裂解
–从冻存酵母菌中取出适量细胞液。
–加入适量的裂解酶，在恰当的温度下孵育制备酵母细胞裂解液。
5.原生质体的制备
–将酵母细胞裂解液加入加压破碎机。
–根据设备要求进行适当压力和时间的制备。
6.分离原生质体
–经过加压破碎机后，从制备好的原生质体悬浮液中轻轻吸取上清液。
–上清液中富集了酵母原生质体。
7.原生质体的储存
–将得到的酵母原生质体储存于低温条件下，如冰箱等。
–注意保持原生质体的稳定性和活性。
结论
本文介绍了一种酵母原生质体的制备方法，该方法可以有效地从酵母菌株中制备出具有活性和稳定性的原生质体。
通过这种方法，可以为酵母生物学和细胞功能的研究提供有力的工具。
以上是详细的酵母原生质体制备方法，我们希望本文能对该领域的研究者和实验室工作者有所帮助。
酵母菌的纯培养实验原理
酵母菌的纯培养实验原理
酵母菌的纯培养实验是通过分离单个酵母菌细胞，并将其培养在含有适当营养物质的培养基中，以获得大量的纯种菌种。
其原理包括以下几个步骤：
1.分离单个酵母菌细胞：将酵母菌培养基平板上生长的菌落通过传统的划线法或微孔过筛法等方法进行单菌分离。
2.稀释法制备适宜浓度细胞悬液：通过向含有适宜营养成分的液体培养基中加入一定浓度的单菌酵母菌悬液进行瓶内培养。
3.筛选最优液体培养基类型：在选择酵母菌的液体培养基时，需充分考虑其酵母菌生长最适宜的环境和所需营养成分。
4.瓶内培养及传代：将原始酵母菌细胞悬液放入培养瓶中进行培养，继续传代使其增殖。
同时进行基因分型分析，确认其为同一纯种菌。
5.酵母菌的鉴定与获得纯种：经过不断的筛选和传代，获得单纯无污染的酵母菌纯种，可通过形态学、生化特性鉴定、分子生物学、基因组测序等方法进行鉴定。
通过上述步骤，可成功获得大量的酵母菌纯种，在酒、面包、气泡饮料、酱油等食品工业中的应用中起到了重要的作用。
酵母标本制作流程
酵母标本制作流程一、准备材料。
咱得先把要用的东西都找齐喽。
需要有酵母，这可是主角呢。
然后是载玻片和盖玻片，这俩就像是舞台和幕布一样，给酵母搭建展示的地方。
还有滴管，它就像个小运输员，负责把酵母送到载玻片上。
再有就是染色剂啦，这能让酵母更好地被我们看到，就像给酵母穿上漂亮的衣服。
也不能少了显微镜，这可是观察酵母标本的神器。
二、酵母培养。
在制作标本之前，咱得先把酵母养得胖胖的。
可以找个小容器，放上一些适合酵母生长的培养基，就像给酵母做了个小食堂。
把酵母放进去，然后给它放在合适的温度下，就像给它找了个舒适的小窝。
酵母就会在这个小窝里欢快地生长啦。
三、标本制作。
1. 取载玻片。
先把载玻片拿出来，用擦镜纸把它擦得干干净净的，就像给它洗个澡一样，这样酵母在上面住着才舒服。
2. 滴酵母液。
用滴管轻轻地吸取一些含有酵母的液体，然后小心地滴在载玻片的中央。
这时候要像对待小宝贝一样，不能滴太多也不能滴太少，太多了会溢出来，太少了又看不到酵母啦。
3. 染色。
如果需要染色的话，这时候就可以把染色剂滴在酵母液上啦。
染色剂会和酵母发生神奇的反应，让酵母变得五颜六色的，可好看了。
4. 盖盖玻片。
拿出盖玻片，从一侧慢慢地盖下去。
这就像给酵母盖被子一样，要轻轻地，要是太用力了，酵母可能就被压坏了，那可就不好了。
四、观察。
标本做好了，就可以放在显微镜下观察啦。
调整好显微镜的焦距，就能看到小小的酵母啦。
它们有的像小椭圆，有的像小香肠，形态各异，可有意思了。
就好像在微观世界里看一群小精灵在跳舞一样。
酵母标本制作其实并不难，只要我们认真细心，就能做出很棒的标本，然后就能在微观世界里探索酵母的奥秘啦。
这个过程就像是一场小小的冒险，每一个步骤都充满了惊喜呢。
1.2.1酵母菌的纯培养教学设计-2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3
教学设计课程基本信息学科生物学年级高二学期春季课题探究·实践酵母菌的纯培养教学目标1.学会配置酵母菌的培养基并倒平板。
2.学汇进行无菌操作。
3.尝试通过平板划线操作来获得纯化的酵母菌菌落。
教学内容教学重点：1. 微生物的培养和提纯。
教学难点：1. 倒平板和平板划线的具体操作步骤。
教学过程教学环节教师活动学生活动导入新课酿酒和做面包都要用到酵母菌，这些酵母菌可以用液体培养基（培养液）来培养,如何得到纯净的酵母菌呢？可以进行酵母菌的纯培养讲授新课在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。
由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。
获得纯培养物的过程就是纯培养。
微生物纯培养一般包括以下几个步骤步骤：配制培养基--灭菌--接种--分离--培养等。
该实验的实验原理为：(1)分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。
(2)单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
一个单菌落就是一个种群。
在相同培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征。
其具有一定的大小、形态、颜色，以及一定的隆起程度。
这些都是鉴定菌种的重要依据。
获得单菌落的方法有哪些？①平板划线法②稀释涂布平板法二、实验目的。
1.学会配制培养酵母菌的培养基并倒平板。
2。
学会进行无菌操作。
3尝试通过平板划线操作来获得纯化的酵母菌菌落。
三、材料用具1. 实验材料：酵母菌培养液、无菌马铃薯琼脂培养基2．实验用具包括培养皿、接种环、酒精灯、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、干热灭菌锅、恒温培养箱等。
四、实验设计思路制备培养基-接种和分离酵母菌-培养酵母菌-酵母菌菌种的保存。
其中制备培养基的过程为：配制培养基→灭菌→倒平板。
本实验用到的培养基采用哪种方式灭菌呢？一般利用高压蒸汽灭菌锅进行湿热灭菌。
该实验的其他用具分别采用什么方式灭菌？五、实验创新点1.采用PDA培养基。
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利用原生质体育种技术获得优良酵母菌设计实验路线
摘要：
一、引言
1.1 背景介绍：原生质体育种技术在酵母菌育种中的应用
1.2 实验目的：获得优良酵母菌
二、实验材料与方法
2.1 实验材料：酵母菌菌株、培养基等
2.2 实验方法：原生质体育种技术
三、实验步骤
3.1 酵母菌菌株的筛选与分离
3.2 原生质体的制备与融合
3.3 融合子的筛选与鉴定
3.4 优良酵母菌的设计与应用
四、实验结果与分析
4.1 筛选出优良酵母菌
4.2 优良酵母菌的性能分析
4.3 结果讨论
五、结论
5.1 实验总结
5.2 对实际应用的意义
正文：
一、引言
1.1 背景介绍：原生质体育种技术在酵母菌育种中的应用
随着科学技术的进步，生物技术在各个领域得到了广泛的应用。
在酵母菌育种领域，原生质体育种技术因其独特的优势而备受瞩目。
原生质体育种技术是指通过原生质体融合，将不同酵母菌的优良性状进行组合，从而获得更优良的酵母菌菌株。
这种方法能有效提高酵母菌的性能，为酿酒、面包制作等食品工业提供更优质的酵母菌。
1.2 实验目的：获得优良酵母菌
为了提高酵母菌的性能，本实验将利用原生质体育种技术，筛选出优良酵母菌，并研究其性能，为实际应用提供参考。
二、实验材料与方法
2.1 实验材料：酵母菌菌株、培养基等
本实验所需的材料主要有酵母菌菌株、培养基、融合剂等。
其中，酵母菌菌株为实验的基础，培养基用于酵母菌的培养和筛选，融合剂则用于原生质体的制备与融合。
2.2 实验方法：原生质体育种技术
本实验采用原生质体育种技术，主要包括以下步骤：酵母菌菌株的筛选与分离、原生质体的制备与融合、融合子的筛选与鉴定、优良酵母菌的设计与应用。
三、实验步骤
3.1 酵母菌菌株的筛选与分离
首先，从多种酵母菌菌株中筛选出具有优良性状的菌株，并进行分离，为
后续实验做好准备。
3.2 原生质体的制备与融合
将筛选出的酵母菌菌株进行培养，利用融合剂制备原生质体，并进行原生质体融合。
通过融合，将不同酵母菌的优良性状进行组合。
3.3 融合子的筛选与鉴定
融合完成后，对融合子进行筛选与鉴定，挑选出具有优良性状的融合子。
3.4 优良酵母菌的设计与应用
将筛选出的优良酵母菌进行性能测试，分析其性能，为实际应用提供依据。
四、实验结果与分析
4.1 筛选出优良酵母菌
经过实验筛选，成功获得了具有优良性状的酵母菌。
4.2 优良酵母菌的性能分析
对筛选出的优良酵母菌进行性能分析，发现其在发酵速率、酒精产量等方面具有显著优势。
4.3 结果讨论
通过原生质体育种技术，成功筛选出优良酵母菌，为实际应用提供了优质的菌株。
五、结论
5.1 实验总结
本实验利用原生质体育种技术，成功筛选出优良酵母菌，具有重要的实际意义。