间接免疫荧光
细胞表面间接免疫荧光染色
细胞表面间接免疫荧光染色细胞表面间接免疫荧光染色是一种常用的细胞学实验技术，用于研究细胞表面蛋白的分布和表达。
该技术通过标记特定抗体，利用荧光染料对其进行可视化，从而在显微镜下观察和定位特定抗原在细胞表面的分布情况。
本文将详细介绍细胞表面间接免疫荧光染色的原理、步骤和应用。
一、原理细胞表面间接免疫荧光染色的原理基于免疫反应。
首先，需要选择与目标抗原特异性结合的一对抗体，其中一种抗体被称为一抗，另一种抗体被称为二抗。
一抗是直接与目标抗原结合的抗体，而二抗则与一抗结合。
一般情况下，一抗是小鼠或兔子产生的，而二抗是针对小鼠或兔子IgG的抗体。
二、步骤1. 细胞固定：将待染色的细胞固定在载玻片上，常用的固定剂包括甲醛、乙醛和冰乙酸。
2. 渗透：为了提高染色抗体的进入细胞的能力，需要对固定的细胞进行渗透处理。
一般使用0.1% Triton X-100或0.5% Tween 20进行渗透。
3. 阻断：为了防止非特异性结合，需要对细胞进行阻断处理。
常用的阻断剂包括牛血清白蛋白（BSA）和羊血清。
4. 一抗孵育：将合适浓度的一抗溶液加到载玻片上，与细胞孵育。
一抗与目标抗原结合后，可以利用荧光标记的二抗进行可视化。
5. 二抗孵育：将荧光标记的二抗溶液加到载玻片上，与一抗结合。
常用的荧光标记物有荧光素（FITC）、罗丹明（Rhodamine）和碳氰菲（Cy5）等。
6. 洗涤：将载玻片进行洗涤，去除未结合的抗体。
7. 封片：将载玻片倒置在抗褪色剂中，然后用封片胶封住玻片边缘，使样品不受空气氧化。
三、应用细胞表面间接免疫荧光染色广泛应用于生命科学领域，尤其在细胞生物学和免疫学研究中发挥重要作用。
具体应用包括：1. 细胞表面蛋白定位：通过荧光染色，可以观察和定位特定蛋白在细胞表面的分布情况，如受体、通道蛋白等。
2. 细胞凋亡检测：细胞表面间接免疫荧光染色可以用于检测细胞凋亡相关标志物，如细胞色素C和半胱天冬酶-3等。
3. 免疫细胞分型：通过特定抗体的染色，可以对免疫细胞进行分型，如T细胞、B细胞、巨噬细胞等。
间接免疫荧光检测
6、弃上清，重复洗涤一次。 用完全RPMI-1640 1ml定容，计数细胞，调整细 胞浓度。 一般每ml血可分离出1-2×106个单个核细胞。 7、细胞活力检查 取 1滴细胞悬液加 1滴 2%台盼蓝染液，作湿片高 倍镜检，计算活细胞百分率。活细胞不着色，死 细胞染成蓝色。一般活性应在95％以上。
材 料
1. Ag PBMC 2. Ab1 兔抗人白细胞血清 (Ab1) 3. Ab2 FITC-抗兔单克隆抗体 (Ab2) 4. 洗涤液 5. 荧光显微镜
方 法
1.制备抗原片: 吸管取1滴PBMC液体（约10ul）滴加到标本片 黑色圈圈背面中央, 静止5-10分钟，待PBMC干 燥。
2. 15 ul Ab1 加入玻片上37℃孵育30 min。 PBS洗3 次(3min/次)。
3. 玻片上加15 ml 荧光二抗 (Ab2) 湿盒内37℃孵育 30 min。PBS洗3次(同上,避光操作) 4. 用吸水纸印干玻片，滴油，荧光镜显微镜下观察。
原 理
间接免疫荧光法是用荧光素标记Ab2以检测 Ag或Ab的一种实验技术。其原理是Ag首先与 Ab1结合，然后Ab1再与荧光素标记的Ab2结合， 形成一个Ag- Ab1-荧光素标记Ab2的三分子复合 物，在荧光显微镜下呈现荧光。
外周血单个核细胞分离 ------ 葡蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法
[原理]
外周血单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞、单 核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同。红 细胞和多核细胞比重较大，为 1.092 左右，而淋巴细 胞和单核细胞比重为 1.075左右。利用比重为 1.077左 右的分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按 密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
《间接免疫荧光实验》课件
培训与技能 提升
为提高实验结果的可靠性，应进行重复实验，并对结 果进行统计分析，以确定结果的稳定性和可重复性。
06
CATALOGUE
实验应用与拓展
在生物学研究中的应用
细胞生物学
用于标记和观察细胞表面 的抗原，研究细胞结构和 功能。
微生物学
用于检测和鉴别病原体， 如细菌、病毒和寄生虫。
03
解读结果的意义
解释实验结果的生物学意义，并 将其与实验目的和预期结果进行 比较。
结果分析的注意事项
排除非特异性荧光
01
在解释荧光信号时，需排除非特异性荧光的干扰，确保结果的
准确性。
重复实验验证
02
为确保结果的可靠性，需进行重复实验验证，并对结果进行统
计学分析。
结果解读的局限性
03
了解实验结果的局限性，避免过度解读或误导性解读。
免疫学
用于研究免疫系统的抗原 和抗体反应，探索免疫疾 病的发病机制。
在医学诊断中的应用
感染性疾病诊断
用于检测和鉴别各种感染性疾病的病原体，如病毒、细菌和寄生 虫。
自身免疫性疾病诊断
用于检测自身抗体，辅助诊断和治疗自身免疫性疾病。
肿瘤诊断
用于检测肿瘤标志物和癌细胞表面抗原，辅助肿瘤的诊断和分类 。
实验方法的改进与拓展
其他试剂设备
其他试剂和设备包括洗涤液、 封片剂、显微镜、荧光显微镜
等。
洗涤液用于清洗细胞或组织样 本，去除未结合的抗体和荧光
标记物。
封片剂用于固定细胞或组织样 本，防止荧光标记物的脱落。
显微镜和荧光显微镜用于观察 和检测荧光标记物，提高实验 的准确性和可靠性。
03
CATALOGUE
临床免疫实验 间接免疫荧光法测抗核抗体实验报告
实验三、间接免疫荧光法检测血清中抗核抗体一、实验目的：1、掌握免疫荧光法的原理。
2、掌握免疫荧光法检测过程中避免非特异荧光干扰的方法。
二、实验原理：间接免疫荧光技术是利用荧光抗体标记第二抗体检测未知抗原或未知抗体（第一抗体）的方法。
以检测人血清抗核抗体（ANA）为例。
病人血清中ANA（Ab）能与各种系细胞核成分（Ag）特异性结合，此种结合的Ab（IgG型）能与荧光标记的羊抗人IgG（二抗）结合，在荧光显微镜下，细胞核显示荧光，提示血清中ANA的存在。
三、试验材料：0.1M，pH6.8PBS；小白鼠，待测血清，对照血清（阴性血清），羊抗人IgG荧光抗体、滴管、试管、孵箱、荧光显微镜等。
四、实验步骤：1、小鼠断颈处死取肝，NS漂洗，剪取肝横断面印片于玻片上，左右各一处，自然干燥；滴加无水乙醇固定，室温凉干；2、左右印片处分别盖上一片小纸片，分别滴加阳性血清和阴性血清各1滴，37℃30′；3、去除纸片，PBS冲洗1min×3次，吸干水分；4、左右印片处分别盖上一片小纸片，并滴加荧光标记羊抗人IgG（二抗）各1滴，37℃305、去除纸片，PBS漂洗1min×3次，吸干水分；6、荧光显微镜镜检。
五、实验结果：荧光显微镜下观察：细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞，不发荧光为阴性；抗原片中出现阳性染色细胞为ANA 阳性，否则为阴性；阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。
（均质型）细胞核呈均匀一致的荧光(斑点型)细胞核内呈现斑点状荧光六、实验讨论：1、注意事项：1）制作核抗原片（印片）不宜太厚；2）滴加的血清或荧光抗体要充分盖满抗原片；3）荧光抗体孵育时要注意避光;4）染色后的片子应及时镜检，不宜放置过久。
5）注意各步骤的漂洗要充分。
2、临床意义：1）总的ANA检测在临床诊断与鉴别诊断中是一个极为重要的筛选试验。
绝大多数自身免疫性疾病均可呈阳性。
ANA阳性者进一步检测各亚类ANA抗体对明确诊断、临床分型、病情观察、预后及治疗评价有重要意义。
《间接免疫荧光法》课件
06
问题与展望
常见问题及解决方案
荧光染色不均
可能是由于抗体浓度过高或孵育 时间不足，解决方案是调整抗体
浓度和孵育时间。
非特异性染色
可能是由于血清内源性荧光物质干 扰，解决方案是使用去内源性荧光 物质处理。
荧光淬灭
可能是由于荧光物质不稳定，解决 方案是使用更稳定的荧光物质或采 用避光染色技术。
研究展望
01
02
03
04
医学诊断
用于检测和诊断各种疾病，如 自身免疫性疾病、感染性疾病
等。
生物学研究
用于研究细胞表面抗原、细胞 内抗原等，以及探索细胞与细
胞之间的相互作用。
农业科研
用于检测植物病毒、细菌和真 菌等病原微生物，以及研究植
物抗病性等。
环境监测
用于检测环境中的有害物质和 污染物，如重金属、农药等。
优化抗体标记技术
探索更高效、特异性和稳定的抗体标记技术 ，提高荧光染色的敏感度和特异性。
深入研究荧光物质
研究荧光物质的性质和作用机制，为提高染 色效果提供理论支持。
拓展应用领域
将间接免疫荧光法应用于更多疾病的研究和 诊断，如肿瘤、感染性疾病等。
建立标准化操作流程
制定标准化的操作流程和质控标准，提高实 验结果的可靠性和可比性。
通过使用针对特定抗原的抗体 ，间接免疫荧光法能够特异地 识别和标记目标抗原。
定位准确
间接免疫荧光法能够准确地定 位抗原的位置，有助于了解抗 原在细胞或组织中的分布情况 。
可视化结果
通过荧光显微镜观察，间接免 疫荧光法能够直观地展示抗原 的存在和分布，便于结果的解
读和分析。
局限性
抗体依赖
间接免疫荧光法依赖于针对特定抗原的抗体，如果抗体不适用或不可 获得，该方法可能无法应用。
间接免疫荧光法
间接免疫荧光法间接免疫荧光法(Indirect Immunofluorescence Assay,IFA)是一种常用的特异性检测技术，也是最常见的检测技术之一，可以用于检测抗原分子的特异性结合。
一、IFA的原理：在IFA技术中，使用两种不同的抗体，分别与检测抗原结合，以形成双重抗原抗体复合物，再用夹带抗体获得体外的特异性检测反应；其中，一种抗体称作抗体，另一种抗体称作夹带抗体，具有特定免疫能力，可以将抗原抗体复合物与另外特定抗原进行特异性结合，获得所需的检测反应，而后将夹带抗体对抗原抗体复合物设定与荧光探针结合，从而实现特异性检测。
二、IFA的操作步骤：1、样品处理：将抗原进行均质处理，获得悬浮液。
2、抗体处理：将样哮抗体在恒温下进行稀释，然后添加到抗原悬浮液中，放置回温处理反应，补充抗体，使抗原与抗体完全结合形成复合物。
3、夹带抗体处理：将夹带抗体加入复合物，在恒温下进行反应，以获得抗原/夹带抗体复合物，从而实现特异性检测。
4、荧光标记：将荧光探针与夹带抗体完全结合，使抗原/夹带抗体复合物呈现特定的荧光，从而实现特异性检测。
5、检测：利用适当的仪器检测复合物的活性，并完成IFA的检测。
三、IFA的应用：IFA可以直接用于病毒、细菌、植物、动物等微生物抗原的检测，也可以用于检测抗原蛋白、血清病原体等，具有一定的临床实用价值。
1、应用于病原体鉴定：通过将IFA进行优化，可以对人体和动植物病原体进行识别、诊断和鉴定，给临床实践带来重要的参考价值；2、应用于鉴定疾病：IFA还可以用于检测某种疾病的免疫检测，例如常见的疾病，如流感病毒、登革热病毒、结核分枝杆菌、沙眼衣原体、病毒性肝炎慢性病毒、HIV/AIDS等；3、应用于临床诊断：IFA可以用于对各种疾病进行鉴别诊断和检测，例如：癫痫、睑缝螨虫病、先天性心脏病、脑外膜炎、肺炎、病毒性心肌炎等疾病；4、应用于药物开发：可以在药物研究和开发中应用此技术，以研究对病原生物体或抗原分子的特异性作用，使药物开发进程更加准确、可靠；五、IFA技术优势：1、IFA是一种精确度高、特异性能强的检测技术，可实现灵敏性检测，快速和实时检测，有效提高疾病的检测效率；2、IFA有较强的合并性，可以同时结合不同的抗体，能够更好地检测抗原分子特异性反应；3、IFA具有较低的污染风险，实验中没有生物体的接触，可以有效地控。
间接免疫荧光法原理
间接免疫荧光法原理
间接免疫荧光法是一种常用的免疫学实验技术，用于检测目标物质在样品中的表达和定位。
它基于特定抗体与目标物质结合的原理，利用荧光标记的二抗来识别和定位特定抗体的位置。
该方法的步骤如下：
1. 准备样品：收集需要检测的样品，如细胞、组织或体液。
如果是组织样品，需要进行固定和切片处理；如果是细胞样品，需要将其培养在培养皿中。
2. 孵育样品：将样品与特定抗体共孵育，使特定抗体与目标物质结合。
这一步骤被称为一抗孵育，加强了对目标物质的识别和特异性。
3. 孵育引导二抗：将荧光标记的二抗与一抗结合。
这个二抗能够识别并结合到一抗上，从而引导荧光标记的二抗定位到目标物质附近。
4. 洗涤：洗涤样品，去除未结合的抗体和二抗，以减少背景噪音。
5. 荧光显微镜观察：将样品放置在荧光显微镜下观察，荧光显微镜可以激发荧光标记的二抗，使其发出可见光。
通过观察荧光信号的位置和强度，可以确定目标物质的存在和定位。
间接免疫荧光法的优点是灵敏度高、特异性好、可以同时检测
多个目标物质等。
它被广泛应用于生命科学研究和临床诊断中，如检测蛋白质、抗体、细胞标记和组织定位等。
间接免疫荧光试验
六、操作步骤
1、病毒吸附：5%cpv同步接毒，3d 2、丙酮固定：80%丙酮，4 ℃,1h 3、洗涤：用 PBS 洗涤3遍 ∕ 3min 4、加入一抗：加入抗 CPV 阳性血清（1：100倍稀 释），200μL/孔，37℃湿盒中作用 3h 5、洗涤 6、加入二抗：加入 FITC 标记羊抗鼠 IgG 二抗 （1:300倍稀释）50μL，37℃闭光作用 1h； 7、洗涤 8、镜检：荧光显微镜观察，拍照，有绿色荧光者判 为阳性，无荧光者判为阴性。
二、常见荧光素特性
1)FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490~495nm，发射 光：520~530nm，明亮的黄绿色荧光。 2)RB200：橘红色粉末，吸收光570nm，发射光 595~600nm，橘红色荧光。 3)TRITC：紫红色粉末，吸收550nm，发射光620nm， 橙红色荧光。 4）镧系：Eu、Tb 5)PE：吸收光490~560nm，发射光595nm，红色荧光。 6）其它：酶作用后产生荧光物质。
七、图示
三、分类
直接免疫荧光法
间接免疫荧光法
四、应用
将病毒接到敏感细胞上进行增殖复制， 待病价最高的时候进行间接荧光免疫实 验 用于分毒时，确定有无病毒的存在 测抗体
五、优缺点及注意事项
优点：特异性高、敏感性高、速度快 缺点：非特异性染色 注意事项：
1、每次试验应设阳性和阴性对照 2、应注意荧光抗体的质量 3、标本应避光保存
间接荧光免疫实验
2013307341 叶ห้องสมุดไป่ตู้苹
一、原理
根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原 或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用 这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查 细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细 胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧 光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受 激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或 桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织， 从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利 用定量技术测定含量。
96孔板间接免疫荧光实验步骤
96孔板间接免疫荧光实验步骤96孔板间接免疫荧光实验是一种常用的实验方法，用于检测特定抗原和抗体的结合情况。
以下是该实验的详细步骤，帮助您完成实验并获得准确的结果。
第一步：准备实验材料和试剂在进行实验前，确保准备好所需的试剂和材料，包括：1. 96孔板：用于进行实验的常用多孔板。
2. 抗原：待测物质，可以是细胞表面抗原、蛋白质、细菌等。
3. 抗体：具有高亲合力和特异性，用于与抗原结合。
4. 荧光标记的二抗：可以与抗体结合并发出荧光信号。
5. 缓冲液：用于稀释抗原和抗体的缓冲液。
第二步：包被抗原1. 取一小部分被测抗原，在适当的浓度下进行稀释。
2. 取出96孔板，并将稀释好的抗原加入孔中。
3. 在孔中加入适量的缓冲液，并在室温下静置一段时间，使抗原与孔壁结合。
第三步：阻断非特异性结合1. 弃去孔中的缓冲液。
2. 加入适量的蛋白质（如牛血清蛋白、羊血清蛋白等）作为阻断剂。
3. 在室温下静置一段时间，以防止非特异性结合。
第四步：加入抗体和二抗1. 弃去阻断剂，并用洗涤缓冲液洗涤孔中的抗原。
2. 加入适量的特异性抗体，并在室温下孵育一段时间，使其与抗原结合。
3. 弃去孔中多余的抗体，并用洗涤缓冲液洗涤孔中的抗原。
4. 加入适量的荧光标记的二抗，并在室温下孵育一段时间，使其与抗体结合。
第五步：荧光信号检测1. 弃去孔中多余的荧光标记的二抗，并用洗涤缓冲液洗涤孔中的抗原。
2. 加入适量的检测缓冲液以稀释孔中的荧光信号。
3. 使用荧光读板仪检测每个孔中的荧光强度。
4. 根据结果判断抗原和抗体的结合情况。
第六步：数据分析和结果解释对读取的荧光信号进行数据分析，比较不同孔中的荧光强度。
如果目标抗原与特异性抗体结合，荧光信号应相对较高。
通过对比各孔的荧光强度，可以得出抗原和抗体的结合程度以及目标物质的相对含量。
通过按照以上步骤进行实验，您可以获得准确的间接免疫荧光实验结果。
这种实验方法广泛应用于生物医学研究、诊断试剂的开发和药物筛选等方面。
间接免疫荧光实验
通过观察荧光强度，可以初步判断抗原表达量， 为定量分析提供参考。
定量与定性分析
定量分析
通过测量荧光强度或计数阳性细胞数 量，对实验结果进行定量分析，得出 抗原表达水平的相对值。
定性分析
根据荧光显微镜下观察到的抗原定位 、细胞形态以及荧光强度，对实验结 果进行定性分析，判断抗原是否存在 以及表达情况。
实验局限性及改进方向
01
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实验过程中可能存在假阳性或 假阴性结果，需要进一步优化
实验条件和操作流程。
实验方法的灵敏度和特异性仍 需进一步提高，以适应更广泛
的应用场景。
需要加强实验质量控制，确保 实验结果的稳定性和可靠性。
针对不同抗原和样本类型，需 要进一步探索和改进实验方法 ，以提高其适用性和通用性。
02 实验材料
抗体选择与制备
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抗体来源
选择来源于特异性免疫动 物的抗体，如小鼠、兔、 羊等。
抗体纯化
通过亲和层析、凝胶过滤 等方法对抗体进行纯化， 去除杂蛋白和聚合物。
抗体标记
选择荧光染料对抗体进行 标记，常用的荧光染料有 FITC、TRITC、Cy3等。
细胞或组织样本
细胞培养
将细胞在适宜的培养基中培养， 保持细胞活性。
06 参考文献
参考文献
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实验步骤
间接免疫荧光实验通常包括细胞或组织固定、抗体孵育、洗涤、加入荧光标记的第二抗体 、再次洗涤和荧光显微镜观察等步骤。
实验注意事项
在进行间接免疫荧光实验时，需要注意控制实验条件，如温度、pH值和抗体浓度等，以 保证实验结果的准确性和可靠性。同时，需要注意荧光标记物的选择和使用，以及避免非 特异性染色等问题。
间接免疫荧光法测ANA课件
检查生物薄片是否与液滴接触良好，然后 继续下一张。
从现在开始，注意避免阳光直射载片。
室温温育30分钟。
实验步骤八: 冲洗
用烧杯盛PBS-Tween缓冲液, 流水冲洗载片, 然后立即放入装有PBS-Tween缓冲液的小 杯中浸洗至少5分钟。
可在每150ml磷酸盐缓冲液中加10滴(150 µl) 伊文氏蓝进行复染。
然后再进行下一个载片的操作。
实验步骤十: 结果判断
➢荧光显微镜下观察荧光。
结果判读:
荧光显微镜下观察 细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞, 不发
荧光为阴性。 抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性, 否
则为阴性。 阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。
【均质型】 细胞核呈均匀一致的荧光
【核仁型】 核仁部分呈现荧光
某些核抗原成分在核仁和胞浆内比核质内 更丰富
ANA检测的意义
有助于疾病的诊断 如抗Sm是SLE标记抗体； 抗ScL-70 是SD的标记抗体； 抗Jo-1是PM/DM的标记抗体；
观察疾病活动度和治疗反应 研究发病机理
【ANA分类】
抗DNA（dsDNA,ssDNA) 抗组蛋白（Histone) 抗非组蛋白（Nonhistone,Extractable
✓滴度定义: 与相同稀释倍数的阴性血清相比，能观察 到特异性荧光反应的最高稀释度
【临床意义】
总的ANA检测在临床诊断与鉴别诊断中是一 个极为重要的筛选试验。绝大多数自身免疫 性疾病均可呈阳性。ANA阳性者进一步检测 各亚类ANA抗体对明确诊断、临床分型、病 情观察、预后及治疗评价有重要意义。
未经治疗的、活动性SLE的阳性率为80%－ 100%。药物性狼疮100%、全身硬皮病、混 合性结绨组织病、狼疮性肝炎、原发性胆汁 性肝硬化等。
间接免疫荧光试验步骤
间接免疫荧光试验步骤
间接免疫荧光试验(IFA)是一种用于检测抗体或抗原的灵敏方法。
以下是其基本步骤：
1.样品准备：根据待测样本类型（如贴壁细胞、悬浮细胞、组织等）
进行相应的处理。
对于贴壁细胞，需将洁净的盖玻片进行浸泡处理，并用无菌的镊子放置到培养皿中。
对于悬浮细胞，可以先进行固定步骤，然后将细胞滴加在载玻片上。
对于冷冻切片或石蜡切片，需进行相应的处理。
2.固定：固定是为了防止离体组织自溶和抗原扩散。
常用的封闭液
包括与二抗同一来源的血清、BSA或者是羊血清。
通透或固定后的样品需用PBS进行洗涤。
3.封闭：封闭是为了减少一抗和二抗与非特异性位点结合，常使用
山羊血清作为封闭液。
4.一抗孵育：根据一抗的说明书，按照适当比例用一抗稀释液稀释
一抗，吸水纸吸尽封闭液后，每张玻片滴加稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜。
洗涤后回收一抗。
5.二抗孵育：滴加适当稀释的荧光标记的二抗溶液，使其完全覆盖
标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间。
取出玻片，洗涤后加一滴缓冲甘油以盖玻片覆盖。
6.观察：立即用荧光显微镜观察标本的特异性荧光强度。
待检标本
特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为(±)或(-)，
即可判定为阳性。
请注意，这些步骤仅是间接免疫荧光试验的基本流程，实际操作中可能需要根据具体情况进行调整。
如果对具体操作有疑问，建议咨询专业人士。
间接免疫荧光法
活细胞间接免疫荧光法1 转染细胞4h后，用PBST洗涤三次。
2 固定。
用置于-20℃预冷的甲醇进行固定，500 ul/孔，室温作用10 min。
用PBST洗涤三次。
3 封闭4 一抗加入1：100倍稀释的阳性血清（用1%的BSA稀释）200 ul/孔，37℃作用1h。
用PBST 洗三次5 二抗加入1：500稀释的Alexa fluor 488标记的羊抗鸡IgY(用1%的BSA稀释)，200uL/孔，37℃作用lh。
用PBST洗涤三次。
6 荧光显微镜下观察结果。
转染Vero 细胞4h后，用PBST洗涤三次，用置于-20℃保存的冷丙酮(丙酮：乙醇=2：3)进行固定，500uL/孔，室温作用10min。
用PBST洗涤三次，加入1：100倍稀释的ARV阳性血清200uL/孔，37℃作用lh。
用PBST洗涤三次，加入1：500稀释的Alexa fluor 488标记的羊抗鸡IgY，200uL/孔，37℃作用lh。
用PBST洗涤三次一．实验器材：1．器材：40孔塑料板、40孔板离心机、微量加样器、振荡器、盖玻片、荧光显微镜等。
2．试剂：单抗隆抗体（单抗）、荧光标记抗鼠免疫球蛋白、PBS（pH7.2-7.4）、甘油、叠氮钠（NaN3）等。
二．方法（微量法）1．将分离好的单个核细胞用PBS洗2次，1000rpm每次10分钟。
用含0.1% NaN3PBS调细胞浓度在0.5-1×108/ml（5000万-1亿/ml），加在40孔板上，每孔10ul，含5-10×105细胞，然后加入单抗（第一抗体）50ul（同时加入AB型血清5ul）振荡混匀，置4℃，至少30分钟。
2．用含0.1%NaN3的PBS洗一次，1000rpm离心3-5分钟弃上清。
3．加荧光标记抗鼠抗体（第二抗体）工作液20ul，混匀振荡置4℃/30分钟（时间不能超过）。
4．用含0.1%NaN3的PBS洗2次，方法同上，弃上清，加入含60%甘油的PBS5-10ul（依据所加细胞量而定）振荡均匀，点片，并加盖玻片。
免疫荧光间接法注意事项
免疫荧光间接法注意事项1. 引言1.1 什么是免疫荧光间接法免疫荧光间接法是一种常用的免疫学实验技术，在细胞生物学和分子生物学研究中具有重要的应用。
通过利用特异性的抗体与待检测的抗原结合，然后使用荧光标记的二抗来识别和定位目标蛋白或细胞结构，从而实现对目标分子的定量或定位分析。
这种方法具有灵敏度高、特异性好、操作简便等优点，因此被广泛应用于科研领域。
免疫荧光间接法的原理是基于免疫学的理论，利用抗体与抗原特异性结合的原理来实现对待检测分子的检测和定位，其灵敏度和特异性取决于抗体的选择和标记的二抗的性能。
在实验中，需要注意一些关键因素，如样本处理、试剂及仪器选择、实验操作、数据分析和安全措施等。
通过严格遵循这些注意事项，可以确保免疫荧光间接法实验的顺利进行，并保证结果的准确性和可靠性。
【2000字】1.2 为什么需要注意事项在进行免疫荧光间接法实验时，需要特别注意一些事项，这是因为这种方法在生物学研究中扮演着非常重要的角色。
免疫荧光间接法是一种通过标记一种特定抗体来检测样品中特定蛋白质的方法，其原理是通过特异性抗体与特定抗原结合后，再通过荧光标记的二抗来实现信号的放大与检测。
这种方法通常用于检测蛋白质的表达水平、确定细胞的定位以及研究细胞间的相互作用等方面。
在实验过程中，如果没有按照正确的操作步骤进行，就会导致实验结果的不准确或是出现误差。
需要严格遵守一些注意事项，以保证实验的准确性和可靠性。
这些注意事项涉及到样本处理、试剂及仪器、实验操作、数据分析以及安全等方面，每一个环节都至关重要。
免疫荧光间接法的注意事项不仅仅是为了确保实验过程的顺利进行，更重要的是为了保证实验结果的准确性。
只有在遵守各项注意事项的前提下，我们才能得到可靠的实验结果，为科研工作提供有效的支持。
所以，我们必须认真对待免疫荧光间接法中的注意事项，以确保实验的顺利进行和结果的可靠性。
2. 正文2.1 样本处理注意事项在进行免疫荧光间接法实验时，样本处理是非常关键的一步，直接影响到实验结果的准确性和可靠性。
间接免疫荧光法
目 录
• 引言 • 间接免疫荧光法原理 • 间接免疫荧光法实验步骤 • 间接免疫荧光法在生物医学领域的应用 • 间接免疫荧光法优缺点及改进方向 • 间接免疫荧光法实验操作注意事项
01 引言
目的和背景
研究目的
介绍间接免疫荧光法的原理、应用和优缺点，为相关领域的研究提供参考。
背景
随着免疫学、生物技术和医学的不断发展，间接免疫荧光法作为一种重要的免 疫学技术，在疾病诊断、药物研发和生物医学研究等领域发挥着越来越重要的 作用。
抗体孵育与荧光标记
一抗孵育
选用特异性针对目标抗原的抗体作为 一抗，与固定好的抗原进行孵育，使 抗体与抗原结合。
清洗
二抗孵育
选用与一抗种属匹配的荧光标记二抗， 与一抗结合，形成荧光标记的抗体-抗 原复合物。
去除未结合的一抗，减少非特异性荧 光干扰。
显微镜观察与结果分析
荧光显微镜观察
在荧光显微镜下观察样本，激发荧光并捕捉荧光信号。
肿瘤标志物检测
肿瘤相关抗ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ检测
利用特异性抗体与肿瘤相关抗原结合， 通过荧光显微镜观察荧光信号，辅助 肿瘤的诊断和分类。
肿瘤特异性抗体检测
检测患者血清中针对肿瘤特异性抗原 的抗体，用于肿瘤的早期发现和病程 监测。
05 间接免疫荧光法优缺点及 改进方向
优点
高灵敏度
间接免疫荧光法能够检测到非常 低浓度的目标抗原或抗体，具有
病毒抗体检测
检测患者血清中特异性病毒抗体的存 在和滴度，用于病毒感染的诊断和病 程监测。
自身免疫性疾病诊断
自身抗体检测
利用间接免疫荧光法检测患者血清中针对自身组织抗原的抗 体，用于自身免疫性疾病的诊断和分类。
间接免疫荧光检测过程
间接免疫荧光检测过程
嘿，咱今天就来讲讲那个间接免疫荧光检测过程哈。
记得有一次我在实验室里，要做这个检测。
那场面，就跟一场神秘的探险似的。
首先呢，咱得准备好样本，这就好比是要去探险得先找好装备一样。
把样本小心翼翼地放在玻片上，就好像给它找了个安稳的小窝。
接下来，就是加一抗啦。
这一抗就像是我们探险时的秘密武器，得准确地给它加到样本上，可不能有一点儿马虎。
然后呢，得让它好好地反应一会儿，这时候就感觉时间过得特别慢，就像等一个重要的消息一样焦急。
等了一阵子，就得把多余的一抗洗掉啦，就像把身上沾的灰尘洗掉一样。
接着，就是加二抗啦，二抗一加上，就好像给样本穿上了一件特别的外衣。
看着那些色彩慢慢显现出来，真的特别神奇。
再经过一系列的操作，最后在显微镜下观察，哇，那画面，就像打开了一个神奇的微观世界的大门。
看到那些荧光标记的地方，就像是找到了宝藏一样兴奋。
总之，这间接免疫荧光检测过程就像一场充满惊喜和挑战的旅程，每一步都得认真对待，才能最终看到那让人惊叹的结果呀。
这就是间接免疫荧光检测过程啦！。
间接免疫荧光
谢谢
应用：筛选药物分子， 提高药物研发效率
局限性：需要荧光标记 的抗体，可能影响药物 活性
3
间接免疫荧光的优缺点
优点
灵敏度高：可 以检测到低浓 度的抗原或抗
体
特异性强：可 以区分不同的
抗原或抗体
操作简便：实 验步骤简单，
易于操作
结果直观：荧 光信号明显， 易于观察和判
断结果
缺点
01
操作复杂，需要熟练
间接免疫荧光
演讲人
目录
01. 间接免疫荧光的原理 02. 间接免疫荧光的应用 03. 间接免疫荧光的优缺点
1
间接免疫荧光的原理
荧光抗体
荧光抗体是间接免疫荧光 实验的关键试剂
荧光抗体由荧光素和抗体 结合而成
荧光抗体可以特异性识别 抗原
荧光抗体在间接免疫荧光 实验中发挥重要作用
荧光标记
01
原理：利用荧光素与抗体结合，形成荧光抗体
02
荧光抗体制备：将荧光素与抗体结合，形成荧光抗体
03
荧光抗体检测：将荧光抗体与待测抗原结合，通过荧光显微镜观察荧光信号
04
荧光信号分析：通过荧光信号的强弱和位置，分析抗原的存在和分布情况
检测方法
样品制备：将待测样品进行 固定、染色等处理
抗体标记：将荧光素标记的 抗体与待测样品进行反应
荧光检测：使用荧光显微镜 观察样品中的荧光信号
掌握操作待结果
03
实验结果受多种因素
影响，如抗体浓度、
荧光染料浓度等
04
实验成本较高，需要
购买昂贵的抗体和荧
光染料
改进方向
提高灵敏度：通过优化 抗体和荧光染料，提高 检测灵敏度
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间接免疫荧光法检测Ad-LMP2表达EBV-LMP2蛋白的活性
1 材料和仪器
293细胞
大鼠抗LMP2单克隆抗体
FITC标记山羊抗大鼠IgG抗体
荧光显微镜
2 检测方法
2.1 293细胞接种到24孔板中, 1.5~2.0×105个细胞/孔，37℃，5% CO2培养箱培养过夜，细胞生长成片。
2.2 每个细胞孔感染2.0×106VP供试品重组腺病毒，同时设置293细胞阴性对照孔。
37℃，5% CO2培养箱培养两天，细胞完全病变。
2.3 收集293细胞。
用PBS洗涤两次，重悬到100µlPBS缓冲液中，每孔10µl 涂于细胞片上，室温自然晾干。
2.4 将细胞片置于4℃丙酮中固定15分钟，PBS洗两次，室温晾干。
2.5 PBS浸泡10min，用PBS（含0.05%Triton-X100）浸泡通透25min。
2.6 用10%胎牛血清室温封闭40min。
2.6 细胞孔使用1：20 PBS稀释抗体，置于湿盒中，37℃孵育1小时。
PBS洗8~9遍，保持湿润。
2.7 覆盖1：40稀释的FITC标记（PBS稀释）的羊抗大鼠IgG，置于湿盒中，37℃孵育30分钟。
PBS洗8~9遍，室温晾干。
(如用PBS有颗粒沉淀)
2.8 伊文氏蓝负染5分钟。
超纯H2O洗3遍，室温晾干。
2.9 50%甘油封片。
2.10 显微镜下观察照相。
3 结果判定
显微镜下观察阴性对照孔细胞呈红色，供试品孔细胞可以看到明显的绿色荧光，即判定为阳性。
检测结果应为阳性。
注：1、每一步均需晾干，细胞浓度可以比较高。
2、水洗效果要好，无盐粒子颗粒。
3、丙酮固定过夜效果较好。
PBS稀释。
当然最好用封闭液直接稀释，再加一点TritonX100效果好。
培养液成分太多了。
而且固定之后细胞都死了，用培养液没什么意义，只要保证其pH等条件适合就好了。
抗体说明书上都会有推荐的稀释倍数。
上网查一下，有很多protocol。
一般一比几百到一万都有，依抗体而定。
可以4度过夜，这样染色效果好。
二抗一般较便宜，一般1：50到1：200多。
Jdzhangwenjun525@
1. 直接免疫荧光法测抗原
（1）基本原理
将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。
其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。
此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。
（2）试剂与仪器
λ磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
λ荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释
λ缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制
λ搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
λ有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）
λ荧光显微镜
λ玻片架
λ滤纸
λ37℃温箱等。
（3）实验步骤
①滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。
②滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。
③取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/ L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
④取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
⑤立即用荧光显微镜观察。
观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：
（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+ ++ ++++）荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。
（4）注意事项
1)对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
2)染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。
染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。
低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。
3)为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。
①标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。
②特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。
③阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。
4)一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。
2.间接免疫荧光法测抗体
（1）基本原理
染色程序分为两步，第一步，用未知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上，在湿盒中37℃保温30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。
第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG抗体。
如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗体。
（2）试剂与仪器
λ磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
λ缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。
λ荧光标记的抗人球蛋白抗体：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释。
λ搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）
λ有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）
λ荧光显微镜
λ玻片架
λ滤纸
λ37℃温箱等。
（3）实验步骤
1)滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原标本片，10min后弃去，使标本片保持一定湿度。
2)滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体标本，覆盖已知抗原标本片。
将玻片置于有盖搪瓷盒内，37℃保温30min。
3)取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗1-2次，然后按顺序过0. 01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不时振荡。
4)取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加一滴一定稀释度的荧光标记的抗人球蛋白抗体。
5)将玻片平放在有盖搪瓷盒内，37℃保温30min。
6)重复操作3。
7)取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴缓冲甘油，再覆以盖玻片。
8)荧光显微镜高倍视野下观察，结果判定同直接法。
（4）注意事项
1)荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，会使荧光减弱。
2)每次试验时，需设置以下三种对照：
①阳性对照：阳性血清+荧光标记物
②阴性对照：阴性血清+荧光标记物
③荧光标记物对照：PBS+荧光标记物
3. 已知抗原标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。
4. 所滴加的待检抗体标本或荧光标记物，应始终保持在已知抗原标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。
For immunof luorescence analysis, cells were grown on coverslips, fixed in 4% paraformaldehyde for 20 min, and permeabilized with 0.5% Triton X-100 (Sigma) in PBS for 15 min, both at room temperature.。