第二章 微生物的纯培养和显微技术
2 微生物的纯培养和显微技术
2 、 扫描电镜 （ scanning electron microscope, SEM ）
电子束做电子探针在样品表面激发出二 次电子， 二次电子产生的多少与样品表面立体 形貌有关。对 二次电子处理，在荧光屏呈现放 大样品立体图像。 主要用于观察微生物的表面 三、显微镜观察样品的制备 结构。
1 、光学显微镜制样 2 、电子显微镜制样
4m 0m 焦f 距 （ ） 12m 70 m 工离 作 距 4 n光 蓝 2 µ 5 m源 0 . m 3 （ 光的率 ）分 时辨
2 、 特殊功能的光学显微镜
名称 普通光学镜 光源 可见光 特殊装置 视野 亮 样品处理与观 应用 察 染色、清晰 形态结构 观察
暗视野镜 相差镜
可见光 特殊聚光 器 可见光 环状光阑 ，相差板 短波光 滤光片
基分离
富集培养 目的菌验证
选择培养
练习思考题：
利用选择培养基如何筛选： （ 1 ）抗链霉素（ str ）细菌？ （ 2 ）降解利用尿素的细菌？ （ 3 ）分解利用纤维素的细菌 ？ 利用富集培养和选择培养如何分离： （ 1 ） 如何从土壤中分离筛选高温（ 70℃ ）解烃细菌？ （ 2 ） 如何从污染废水中分离筛选苯胺降解细菌？
同一 稀释度 培养 20 支
生长者为纯培养物
三、单细胞（孢子）分离
营养琼脂平板不能形成菌落的微生物 解剖显微镜下用吸管挑选单细胞（孢子 ） 显微镜下用显微操作仪挑选单细胞（孢 子） 操作难度与单细胞（孢子）大小成反比
四、选择培养分离
原理： 创造适于目的微生物生长条件 促使目的微生物快速生长成优势菌 抑制非目的微生物生长 从混杂微生物中选择分离目的微生物 1 、 利用选择培养基直接分离目的微生物 选择培养基（ selective medium ） 只允许特定微生物生长，而同时抑 制或阻止其它微生物生长的培养基。
第二章微生物的纯培养和显微技术
第二章微生物的纯培养和显微技术第二章微生物的纯培养和显微技术第一节微生物的分离和纯培养一、无菌技术在分离、转接及培养纯培养物时防止被其他微生物污染，其自身也不污染操作环境的技术被称为无菌技术。
1、微生物培养的常用器具及其灭菌（1）试管、玻璃烧瓶、培养皿。
（2）高压蒸汽灭菌，杀灭所有的微生物，包括休眠体，同时可保持培养基的营养成分不被破坏。
（3）高温干热灭菌。
2、接种操作无菌条件下，用接种环在火焰附近进行操作，或在无菌操作箱或操作室内进行。
二、用固体培养基获得纯培养1、菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。
菌苔：当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。
2、涂布平板法3、稀释倒平板法4、平板划线法5、稀释摇管法对氧气更加敏感的厌氧型微生物。
先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热，使琼脂融化后冷却，将微生物进行梯度稀释，冷凝后，在琼脂表面倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基隔开。
三、用液体培养基获得纯培养对一些个体大的细菌、许多原生动物、藻类。
稀释法。
接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。
经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。
只能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类。
四、单细胞（孢子）分离采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞（单孢子）分离法。
较大的微生物较容易，个体较小的较难。
对较大微生物，用毛细管提取个体，在低倍显微镜下操作；对较小微生物，采用显微操作仪。
五、选择培养根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法，或抑制大多数其他微生物生长，或造成有利于该菌生长的环境，培养一段时间后，通过平板稀释等方法进行纯培养分离。
1、选择平板培养2、富集培养制定特定的环境，使仅适应于该条件的微生物生长。
第二章 微生物的纯培养与显微技术
4、稀释摇管法（dilution shake culture method）
四 、液体培养基分离纯培养
1、原因
不是所有的微生物都能在固体培养基上生 长 。例如：许多原生动物、藻类、大细胞细菌 等。
2、方法
稀释法 （必须在同一个稀释度的许多平行试 管中，应超过95%表现为不生长）
五、单细胞（孢子）分离
有性繁殖：细菌结合
conjugation
2、放线菌
1）菌丝形态： 营养菌丝、气生菌丝和孢子丝（鉴定指标）
Chain of conidiospores
Aerial hyphae
Agar surface
Substrate mycelium
孢子丝不同形态
3、古生菌
古生菌与细菌具有类似的个体形态，但它们多生活 于一些生存条件十分恶劣的极端环境中，例如高温、 高盐、高酸等 。
直接采取显微分离法从混杂群体中 直接分离单个细胞或单个个体进行培 养以获得纯培养。
六、选择培养分离
（一）原因：
1、单一培养不能满足所有微生物生长。 2、微生物对培养条件的选择。 3、微生物对营养的竟争。
（二）分离方法 1、利用选择平板进行直接分离
依据：利用微生物自身特点选择分离条件，如 耐高温、产特殊酶类等。
高压蒸汽灭菌锅
超净工作台
三、固体培养基分离纯培养
（一）相关概念
1、菌落（colony） ：单个微生物在
适宜的固体培养基表面或内部生长、繁 殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有 一定形态结构的子细胞生长群体 。
2、菌苔（lawn） ：当固体培养基表
面众多菌落连成一片时，便成为菌苔 。
细菌菌落形态
（二）微生物分离的手段
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[精品]微生物的纯培养和显微镜技术第2章微生物的纯培养和显微镜技术重点、难点剖析1(无菌技术是最基本的微生物学实验操作技术，其核心是无菌概念的建立，以及正确而严格地按实验教材和实验课的要求，掌握在各种情况下的具体应用原则和操作规范。
2(分离获得某特定的微生物纯培养，是研究和利用微生物的基础。
获得纯培养的方法有固体培养基分离、液体培养基分离和单细胞挑取3大类(表2—1)，其中用固体培养基获得单独的微生物菌落是最常用、最基本的方法。
此外还有活细胞或活体分离法，如噬菌体和动植物病毒纯培养的分离等。
表2-1 获得微生物纯培养的方法比较方法特点应用菌落分离较为均匀，进行微生这3种方法可用于所有在固物计数结果相对准确。
但操作体培养基表面形成菌落的稀释倒平板法相对麻烦，热敏感菌有时易被微生物的纯培养分离。
并烫死，而严格好氧菌也可能被且，通过选用适当的选择平固体培养基分离固定在培养基中生长受到影响板及培养条件可直接分离各种具有特定生理特征的操作相对简单，是较常使用的微生物。
和厌氧罐或厌氧手常规方法。
但有时会因涂布不套箱技术结合，这3种方法涂布平板法均匀使某些部位的菌落不能分也可用于获得各种厌氧开，进行微生物计数时需对稀菌的纯培养释和涂布过程的操作特别注意，否则不易得到准确结果平板划线法操作简单，多用于对已有纯培养的确认和再次分离稀释倒平板的一种变通形式，在缺乏专业的厌氧操作设稀释摇管法但由于菌落形成在琼脂柱的中备的情况下对严格厌氧菌间，观察和挑取都相对困难进行分离和观察工作量大，是否获得纯培养需不能或不易在固体培养基稀释法依靠统计学的推测上生长的微生物进行纯培养分离或数量统计一般不能直接获得微生物的纯1)根据某种微生物的特殊液体培养基分离培养，在通过富集培养使原本生长要求，按照意愿从自然在自然环境中占少数的微生物界中对这种微生物进行有富集培养的数量大大提高后，需再通过针对性的有效分离;2)分离平板法进行相应富集培养微生培养出由科学家设计的特物纯培养的分离和检测定环境中能生长的微生物，尽管我们并不知道什么微生物能在这种特定的环境中生长分离过程直观，可靠，但对仪从样品中直接分离所需的器和操作技术要求较高，多限微生物细胞或孢子，获得其单细胞(孢子)于高度专业化的研究，而挑取纯培养显微操作挑取的微生物单细胞或孢子需经固体或液体培养基培养后才能获得其纯培养物3(保证所用菌种性状的稳定是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。
第二章微生物的纯培养和显微镜技术
第二章微生物的纯培养和显微镜技术2．纯培养和显微技术一、纯培养技术1、无菌技术包括两方面的内容：（1）用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物；(2)在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染，其自身也不污染环境；2、分离纯化技术（1）固体培养基分离纯培养技术微生物个体微小，常以群体混合状态存在，将单个细胞从群体中分离出来，即纯培养。
菌落：单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。
菌苔：众多菌落连成一片。
获得纯培养的方法有：倾注平板法：操作较麻烦，对好氧菌、热敏感菌效果不好！涂布平板法：使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！平板划线法：厌氧微生物的分离：（2）液体培养基分离纯培养稀释法进行液体分离必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。
（3）选择培养分离：抑制大多数其它微生物的生长；使待分离的微生物生长更快；使待分离的微生物在群落中的数量上升，方便用稀释法对其进行纯化。
使待分离的微生物生长“突出”；直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养。
3、单细胞分离技术用显微操作仪，在显微镜下进行。
难度与细胞或个体的大小成反比，局限于高度专业化的科学研究中。
4、选择培养分离选择平板：抑制大多数微生物不能生长，或具区别特征的直观结果。
富集培养：造成有利于某种菌生长的环境。
（1）利用选择平板进行直接分离高温培养分离嗜热菌，培养基中不含有N，分离固氮菌；培养基中含有抗生素分离抗生菌。
牛奶培养基分离产蛋白酶菌株。
（2）富集培养利用不同微生物之间的生长特性不同，制定特定的环境条件，使仅适合条件的微生物旺盛生长，从而使其在为生物群落中的比率大大增大，易于从群落中间将墓地君主分离出来。
5、二元培养物培养物中只含有二种微生物，而且有意识地保持二者之间的特定关系的培养物。
如病毒与宿主；蛭弧菌与和E.coli.6、微生物的保藏技术影响微生物菌种稳定性的因素：a. 变异；b. 污染；c. 死亡基本要求：在一定时间内使菌株不死，、不变、不乱基本方法生活态：培养基传代培养（斜面、平板、半固体），多见于冰箱4℃培养。
微生物的纯培养和显微技术
只含有两种微生物，且有意识保持二者之间关系的培养物， 这是具有寄生、共生关系微生物的最有效保存途径。
选择培养基分离法
1 ml
1.dilute sample
9 ml
10
100 1000 104 105
106
107
高氏培养基 土豆培养基 牛肉膏培养基
7.微生物保藏技术
微生物纯培养物必须通过各种保藏技术使其在一定时间内 不死亡、不被污染、不变异、生物学性状不丢失，以保证微生 物学研究及应用工作顺利进行，因而微生物保藏技术也是保护 微生物资源的一项重要基础工作。
(1）菌种保藏技术的原理：根据微生物生理、生化特点，人 工创造条件，是微生物的代谢处于不活泼，生长繁殖受抑制的 休眠状态；主要三个条件是：低温、干燥和缺氧。
（2）保藏方法 ①传代培养保藏：斜面，半固体穿刺，液体等，可密封后冷 藏。
②沙土保藏：霉菌孢子及产芽孢细菌。
③真空冷冻干燥法保藏
④冷冻法：低温冷冻（-20℃），超低温，液氮；液体培养 物中常加15%左右甘油，速冻后保藏。
日本大阪发酵研究所(IFO)
斜面低温保藏法－－常用保藏法
• 将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全 后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏 期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏， 如此连续不断。 此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏
此法的主要保藏措施是低温。一般可保存1～6个月左右。
培养平板（culture plate，也称平板或平皿）：溶化的培 养基倒入无菌空平皿中，冷却凝固后盛有培养基的平皿。
（1）涂布平板法（Spread plate method） 适于大多数好氧微生物。
（2）稀释倒平皿法（Pour plate method）
第二章微生物的纯培养和显微技术精品PPT课件
四联球菌
▲八叠球菌 按三个互相垂直的平
面进行分裂后，每八个 球菌在一起成立方体形.
如藤黄八叠球菌
（Sarcina ureae)
八叠球菌
▲葡萄球菌 分裂面不规则，多个球菌
聚在一起，像一串串葡萄。 如金黄色葡萄球菌
（Staphylococcus aureus)
第二节 显微镜和显微技术
显微镜自 身特点
放大倍数 分辨率 反差
显微 观察效果
操作者 技能
显微镜使用 标本制作 观察技术
一 显微镜的种类及原理 二 显微观察样品的制备
一 显微镜的种类及原理
普通光学显微镜 暗视野显微镜（视野暗，样品亮。细菌运动） 相差显微镜（不染色观察细微结构） 荧光显微镜（黑暗时荧光素吸收紫外线放出可见光） 电子显微镜
第二章 微生物的纯培养和显微技术
第一节 微生物的分离和纯培养 第二节 显微镜和显微技术 第三节 原核微生物 第四节 真核微生物
第一节 微生物的分离和纯培养
微生物的培养物（culture) 微生物的纯培养物(pure cultrue) 微生物的纯培养技术
无菌技术
防止实验操作过程中其被其他微生物污
显微镜的数值孔径与镜口角及工作距离间的关系 η.sinθ——数值孔径NA。
低倍镜 高倍镜
油镜
以空气做介质同以香柏油做介质的比较 η.sinθ——数值孔径NA。
(a)×500
(b)×175
(c)×210
(a) (b)暗视野显微镜观察 (c) (d) (e)相差显微镜观察
(d)×600
(e)×100
普通光学显微镜
机械装置——镜座、支架、载物台、调焦螺旋 光学系统——物镜、目镜、聚光器
微生物的纯培养及显微技术
●无菌(asepsis)：不存在活菌。
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5
（1）常用物理消毒灭菌方法 ● 热力灭菌法； ● 辐射杀菌法； ● 滤过除菌法； ●超声波杀菌法。
A、 热力灭菌法
●干热灭菌法
▲焚烧：废弃物、尸体； ▲灼烧：接种环、试管口；
● 连续加压灭菌：135-140 ℃下处理5-15 s ，主要适用于大
规模的发酵工厂培养基灭菌；
● 常规加压灭菌：121 ℃（压力：1kg/cm2 或15 磅/英寸）
15~20 min，是一种最为广泛的灭菌方法。 ▲ 注意灭菌物体含菌量的影响，含菌量越高灭菌时间越长。
天然原料＞化学试剂
▲ 空气的排除程度，必须尽量驱尽锅内空气。是依靠温度而
▲ 加热与散热的速度。
B、 辐射杀菌法；
● 紫外线：波长200-300nm的紫外线具有杀菌作用。其主要作
用于DNA，使一条DNA链上相邻的两个胸腺嘧啶共价结合形成二 聚体，导致细菌变异和死亡。
●电离辐射： 高速电子、X射线、γ射线
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洁净工作台
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● 微波：波长1mm~1m
C、过滤除菌法
● 赛氏滤器； ● 玻璃滤器； ● 薄膜滤器
D、超声波杀菌法
● 是一种机械的作用因素，每秒超过2万次振动的声波即为超声 波。常用的超声波发生器能产生20-100千赫的声波。可使细菌细胞 壁裂解而死亡。
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超声仪
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（2）化学消毒剂：
● 消毒剂的种类：酚类、醇类、重金属盐类、氧化
★ 最后一个稀释度 95%表现为不生长。
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第二章微生物的纯培养和显微技术
1. 定义及概念
培养物:在人为规定条件下,培养繁殖,得到的微生物群体称为培养物.
纯培养物:只有一种微生物的培养物称为纯培养物.
混合培养物:含有多种微生物的培养物.
微生物学研究的重要技术:纯培养技术,显微技术.
2.无菌技术
定义:在分离转接及纯培养物时防止其被其他微生物污染,其自身也不污染操作环境的技术.
A．微生物培养的常用器具及其灭菌
试管，玻璃烧瓶，培养皿是最为常用的微生物培养的器具。
培养微生物的营养物质称为培养基。
最为常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，高温干热灭菌。
B．接种操作
接种操作：在无菌条件下，用接种环或接种针挑取微生物，把它由一个培养器皿转接到另一个培养器皿中进行培养。
要点：在火焰附近熟练的无菌操作，或在无菌操作箱或操作室内进行操作。
1.用固体培养基获得纯培养
培养基分为：固体，液体，半固体。
固体培养基是用琼脂或其他凝胶物质固化的培养基。
菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长，繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的，有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。
（纯培养）菌苔：当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。
（不一定是纯培养）
ζ不同微生物在特定的培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对微生物鉴定的重要依据。
培养平板：是被用于获得微生物纯培养的最常用的固体培养基形式，它是冷却凝固后的固体培养基在无菌培养皿中形成的培养基固体平面。
3.微生物的分离培养和保藏
固体培养基获得微生物纯培养的基本方法：
1．涂布平板法:操作较简单，但涂布可能不均匀。
2．稀释倒平板法：操作较为麻烦，对热敏，好氧菌效果不好。
3．平板划线法：
用接种环以无菌操作蘸取少许待分离的材料，在无菌平板上划平行或扇形的
线，微生物数量随划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，划线适宜的话，微生物能一一分散，可以得到单菌落。
4．摇管稀释法：主要是针对厌氧微生物的分离。
（厌氧罐，手套箱）
2.用液体培养基获得纯培养
用于不能在固体培养基上生长的微生物。
（个体大的细菌，原生动物，藻类）具体方法是最大可能值法：同一个稀释度应有较多的平行试管，而有可能获得纯培养的那个稀释度的大多数试管（>95%）应表现为没有微生物生长。
3.单细胞分离
可以提取不占数量优势的种类，采用毛细管提取（个体较大），显微镜操作仪（个体较小），激光拖动，锁定脱离。
4.选择培养
通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离。
具体原理是依据目标微生物的特点，包括营养，生理，生长条件等，采用选择培养分离的方法，或抑制大多数其他微生物生长，或造成有利于该菌生长的环境，使其生长突出，经过一定时间培养后使该菌落中的数量上升，再通过平板稀释等方法进行分离。
具体方法有：
选择平板培养：依据待分离微生物的特点选择不同的培养条件。
富集培养：富集培养主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特
定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，使人们能够更容易地分离所需的特定微生物。
5.二元培养物
培养物中只含有二种微生物，而且是有意识地保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。
6.微生物的保藏技术
定义:菌种保藏就是根据菌种特性及保藏目的的不同,给微生物菌株以特定的条件,使其存活而得以延续.
目的:1.在一定时间内微生物不死亡;2不会被污染;3.不会因发生变异而丢失重要
的生物学性状.
方法:
1.传代培养保藏: 琼脂斜面,半固体琼脂柱,液体培养.易操作但保藏时间短.
2.冷冻保藏:-20度普通冰箱,-70度深低温冰箱,-196度液氮.将微生物置于冷冻状
态.冷冻过程和冰箱内微小的温度变化引起培养物的反复融化和再结晶,对菌体造成损伤.
3.干燥保藏法(最普遍最重要的保藏方法):沙土管保藏(产孢子的微生物),冷冻真
空保藏.
4.显微镜的种类及原理
A．基本概念
放大：被观察物越小，放大倍数越大否则难以看清。
分辨率：能辨别2点之间最小距离的能力被称为分辨率。
R=0.5λ/nsinθ（数值孔径NA，是决定物镜性能的最主要指标）。
反差：被观察物与背景之间的区别程度。
光学显微镜的最高放大倍数能达到1000~1600倍，进一步提高放大倍数不能提高观察效果，因为人的肉眼正常分辨率为0.25nm。
B.显微镜的种类和原理
1．普通光学显微镜
2．暗视野显微镜：利用特殊的聚光器实现斜射照明，给样品照明的光不直接穿过物镜，而是由样品反射或折射后再进入物镜，整个视野是暗的而样品是明亮的。
3．差相显微镜
由于细胞各部分的折射率和厚度不同，光线通过标本时，直射光和衍射光会产生光程差和相位差，利用环状光阑和相差板，能将相位差转化为可观察的明暗差，提高对比度。
4．荧光显微镜
在紫外线的照射下，发荧光的物体会在黑暗的背景下表现为光亮的有色物体，这就是荧光显微技术的原理。
5．透射电子显微镜
6．扫描电子显微镜
主要用于观察样品的表面结构。
7．扫描隧道显微镜
分辨率最高的显微镜，横向分辨率0.1~0.2nm 纵向0.001nm
5 显微镜下的微生物
微生物分为细胞型（细菌，古细菌，真核生物）和非细胞型（病毒和类病毒）
A．细菌和古细菌
在显微镜下细菌的单个形态可分为球菌，杆菌和螺旋菌三种基本形态。
球菌：双球菌，链球菌，葡萄球菌（0.5~1微米）.可作为分类依据。
杆菌：梭菌（半杆菌），膨大的一头是芽孢。
（0.2~1微米）
螺旋菌：0.3~1微米
依据菌丝的形态可分为营养菌丝，气生菌丝，孢子丝。
古生菌和细菌具有相似的形态，但遗传上与真核生物相近。
古生菌具有较独特的形态（嗜盐菌呈方型）
原核生物的细胞大小：测量的主要方法是显微测微尺和照相放大测量。
影响测量大小的因素有：
1．染色方法，正染色大小小于负染色的大小。
2．个体因素
3．干燥后的细菌小于活体细菌
4．菌龄的大小，幼年大于成熟的
5．环境因素影响
最大的细菌：纳米比亚硫磺菌（0.1~0.3mm 0.75mm）
最小的细菌：纳米细菌（50nm）
B．真菌
1．霉菌：菌体由菌丝构成，菌丝交织在一起构成菌丝体。
菌丝可分为隔膜菌丝和无隔膜菌丝。
2．酵母菌：呈卵圆形，圆形，圆柱形等。
最大可达100微米。
酵母菌细胞与子代细胞连在一起成为链状，称为假丝酵母。
3．藻类
4．原生生物：变形虫，纤毛虫，鞭毛虫。
小结：
掌握纯培养物，菌落的概念
分离纯培养物的方法有哪些？
微生物的主要保藏方法有哪些？
什么是显微镜的分辨率？
分辨率最高的显微镜是哪种？能达到多少？
细菌的基本形态有哪些？
最小和最大的细菌有多大？。