第二章 微生物的纯培养和显微技术

第二章微生物的纯培养和显微技术

1. 定义及概念

培养物:在人为规定条件下,培养繁殖,得到的微生物群体称为培养物.

纯培养物:只有一种微生物的培养物称为纯培养物.

混合培养物:含有多种微生物的培养物.

微生物学研究的重要技术:纯培养技术,显微技术.

2.无菌技术

定义:在分离转接及纯培养物时防止其被其他微生物污染,其自身也不污染操作环境的技术.

A．微生物培养的常用器具及其灭菌

试管，玻璃烧瓶，培养皿是最为常用的微生物培养的器具。

培养微生物的营养物质称为培养基。

最为常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，高温干热灭菌。

B．接种操作

接种操作：在无菌条件下，用接种环或接种针挑取微生物，把它由一个培养器皿转接到另一个培养器皿中进行培养。

要点：在火焰附近熟练的无菌操作，或在无菌操作箱或操作室内进行操作。

1.用固体培养基获得纯培养

培养基分为：固体，液体，半固体。

固体培养基是用琼脂或其他凝胶物质固化的培养基。

菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长，繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的，有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。（纯培养）菌苔：当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。（不一定是纯培养）

ζ不同微生物在特定的培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对微生物鉴定的重要依据。

培养平板：是被用于获得微生物纯培养的最常用的固体培养基形式，它是冷却凝固后的固体培养基在无菌培养皿中形成的培养基固体平面。

3.微生物的分离培养和保藏

固体培养基获得微生物纯培养的基本方法：

1．涂布平板法:操作较简单，但涂布可能不均匀。

2．稀释倒平板法：操作较为麻烦，对热敏，好氧菌效果不好。

3．平板划线法：

用接种环以无菌操作蘸取少许待分离的材料，在无菌平板上划平行或扇形的

线，微生物数量随划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，划线适宜的话，微生物能一一分散，可以得到单菌落。

4．摇管稀释法：主要是针对厌氧微生物的分离。（厌氧罐，手套箱）

2.用液体培养基获得纯培养

用于不能在固体培养基上生长的微生物。（个体大的细菌，原生动物，藻类）具体方法是最大可能值法：同一个稀释度应有较多的平行试管，而有可能获得纯培养的那个稀释度的大多数试管（>95%）应表现为没有微生物生长。

3.单细胞分离

可以提取不占数量优势的种类，采用毛细管提取（个体较大），显微镜操作仪（个体较小），激光拖动，锁定脱离。

4.选择培养

通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离。具体原理是依据目标微生物的特点，包括营养，生理，生长条件等，采用选择培养分离的方法，或抑制大多数其他微生物生长，或造成有利于该菌生长的环境，使其生长突出，经过一定时间培养后使该菌落中的数量上升，再通过平板稀释等方法进行分离。

具体方法有：

选择平板培养：依据待分离微生物的特点选择不同的培养条件。

富集培养：富集培养主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特

定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，使人们能够更容易地分离所需的特定微生物。

5.二元培养物

培养物中只含有二种微生物，而且是有意识地保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。

6.微生物的保藏技术

定义:菌种保藏就是根据菌种特性及保藏目的的不同,给微生物菌株以特定的条件,使其存活而得以延续.

目的:1.在一定时间内微生物不死亡;2不会被污染;3.不会因发生变异而丢失重要

的生物学性状.

方法:

1.传代培养保藏: 琼脂斜面,半固体琼脂柱,液体培养.易操作但保藏时间短.

2.冷冻保藏:-20度普通冰箱,-70度深低温冰箱,-196度液氮.将微生物置于冷冻状

态.冷冻过程和冰箱内微小的温度变化引起培养物的反复融化和再结晶,对菌体造成损伤.

3.干燥保藏法(最普遍最重要的保藏方法):沙土管保藏(产孢子的微生物),冷冻真

空保藏.

4.显微镜的种类及原理

A．基本概念

放大：被观察物越小，放大倍数越大否则难以看清。

分辨率：能辨别2点之间最小距离的能力被称为分辨率。R=0.5λ/nsinθ（数值孔径NA，是决定物镜性能的最主要指标）。

反差：被观察物与背景之间的区别程度。

光学显微镜的最高放大倍数能达到1000~1600倍，进一步提高放大倍数不能提高观察效果，因为人的肉眼正常分辨率为0.25nm。

B.显微镜的种类和原理

1．普通光学显微镜

2．暗视野显微镜：利用特殊的聚光器实现斜射照明，给样品照明的光不直接穿过物镜，而是由样品反射或折射后再进入物镜，整个视野是暗的而样品是明亮的。3．差相显微镜

由于细胞各部分的折射率和厚度不同，光线通过标本时，直射光和衍射光会产生光程差和相位差，利用环状光阑和相差板，能将相位差转化为可观察的明暗差，提高对比度。

4．荧光显微镜

在紫外线的照射下，发荧光的物体会在黑暗的背景下表现为光亮的有色物体，这就是荧光显微技术的原理。

5．透射电子显微镜

6．扫描电子显微镜

主要用于观察样品的表面结构。

7．扫描隧道显微镜

分辨率最高的显微镜，横向分辨率0.1~0.2nm 纵向0.001nm

5 显微镜下的微生物

微生物分为细胞型（细菌，古细菌，真核生物）和非细胞型（病毒和类病毒）

A．细菌和古细菌

在显微镜下细菌的单个形态可分为球菌，杆菌和螺旋菌三种基本形态。

球菌：双球菌，链球菌，葡萄球菌（0.5~1微米）.可作为分类依据。

杆菌：梭菌（半杆菌），膨大的一头是芽孢。（0.2~1微米）

螺旋菌：0.3~1微米

依据菌丝的形态可分为营养菌丝，气生菌丝，孢子丝。

古生菌和细菌具有相似的形态，但遗传上与真核生物相近。古生菌具有较独特的形态（嗜盐菌呈方型）

原核生物的细胞大小：测量的主要方法是显微测微尺和照相放大测量。

影响测量大小的因素有：

1．染色方法，正染色大小小于负染色的大小。

2．个体因素

3．干燥后的细菌小于活体细菌

4．菌龄的大小，幼年大于成熟的

5．环境因素影响

最大的细菌：纳米比亚硫磺菌（0.1~0.3mm 0.75mm）

最小的细菌：纳米细菌（50nm）

B．真菌

1．霉菌：菌体由菌丝构成，菌丝交织在一起构成菌丝体。菌丝可分为隔膜菌丝和无隔膜菌丝。

2．酵母菌：呈卵圆形，圆形，圆柱形等。最大可达100微米。酵母菌细胞与子代细胞连在一起成为链状，称为假丝酵母。

3．藻类

4．原生生物：变形虫，纤毛虫，鞭毛虫。

小结：

掌握纯培养物，菌落的概念

分离纯培养物的方法有哪些？

微生物的主要保藏方法有哪些？

什么是显微镜的分辨率？

分辨率最高的显微镜是哪种？能达到多少？

细菌的基本形态有哪些？

最小和最大的细菌有多大？