超声波提取乳酸菌胞外多糖初步研究
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感谢吉林大学军需科技学院2005级全体同学尤其是食品 科学与工程专业同学四年来对我的殷切关怀和真心帮助，在 此对他们表达我深深的谢意！ 感谢在我大学生活、学习期间，给予我关心与帮助的食 品学院刘静波院长、张铁华主任、潘风光老师、庄红老师、 林松毅老师、张鸣镝老师以及吉林大学军需科技学院食品专 业的所有老师。 最后向论文评阅人和答辩委员会的所有教授老师表示最 真诚的感谢！
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致谢
本论文是在导师张铁华老师悉心指导下完成的，张老师在 工作繁忙之余总是抽空认真耐心负责地引导我查阅资料以及 做实验，带给我巨大的帮助和指导。在此我要对我的恩师表 示由衷的感谢。
感谢实验室各位师兄师姐和朋友们在我试验遇到困难和 阻碍的时候给予我的帮助，这为实验的成功带来了巨大帮助, 也增进了我们的友情。
BEA Confidential. | 7
0.9
0.8
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 0.02 0.04 0.06 0.08 y = 13.586x - 0.002
R2=0.9966
葡萄糖标准曲线 Standard curve of glucose
苯酚- 浓硫酸法测乳酸菌胞外多糖含量：
K2
K3 R 优水平 主次因素 优搭配
2.447
1.76 0.687 A2 B>A>C A2B3C2
1.556
2.78 1.224 B3
2.277
2.091 0.519 C2
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表3. 方差分析 Table3.Analysis of variance
方差来源 B 误差 总和
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紫外可见分光光度计, 752－PC, 上海光谱仪器有限公司
烘箱 电子恒温水浴锅，HH－6，深 圳天南海北实业有限公司
超声波细胞粉碎仪
BEA Confidential. | 6
多糖测定方法
苯酚—浓硫酸法
多糖类物质在强酸和加热条件下能迅速水解成单糖，单糖在强酸 条件下与酚反应生成橙色衍生物，该橙色衍生物在波长490nm处有 最大吸收，可用光度法进行定量分析。
BEA Confidential. | 13
超声波提取乳酸菌胞外多糖的正交实验
表1 因素水平表 Table1 Factors and levels
因素 水平
A
B
C
提取时间（min）提取功率（W）间隔保护时间（S) 1
2 3
5
10 15
100
150 200
1
2 3
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实验材料和方法
实验材料 开菲尔菌种，脱脂奶粉（完达 山乳业，购于超市），95%无 水乙醇，浓硫酸，苯酚，中性 蛋白酶氢氧化钠，均为分析纯， 实验用水为蒸馏水。 主要实验仪器
恒温培养箱 超声波细胞粉碎机，JY92－2D， 宁波新芝生物科技股份有限公 司 高速冷冻离心机，CR20B2， HITACHI(日立公司) 旋转蒸发器+恒温水浴锅+循环 水真空泵, 5升,巩义市英峪高科 仪器厂
标准曲线的绘制： 用标准品葡萄糖配成浓度各为0.1mg/ml的标准糖溶液。苯酚溶液 (质量分数5 %),称取5g的苯酚, 用蒸馏水定容于100ml的棕色容量瓶中。 精密吸取标准单糖溶液0.0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2ml,分置于具塞 试管中,加蒸馏水至体积2.0ml,再加苯酚1.0ml,迅速摇匀后滴加浓硫酸 5.0ml,摇匀后放置5min,置沸水浴中加热15min,取出迅速冷却至室温; 另以蒸馏水2.0ml,加苯酚1.0ml和浓硫酸8.0ml,同上做3个空白对照.于 490nm处测吸光度。以吸光度为纵坐标,葡萄糖加入量为横坐标绘制 葡萄糖标准曲线。
实验总结
表2上述实验结果表明乳酸菌胞外多糖的最佳提取工艺条 件为A2B3C2,即超声提取时间10min，超声波功率200W,间隔 保护时间2s.
还可以看出所选各因素对乳酸菌胞外多糖提取率影响的 主次顺序为：超声波功率 >提取时间 >间隔保护时间。
从方差分析表3的结果可以看出, 超声波功率对结果有显著性影 响,提取时间和间隔保护时间为 非显著性影响因素。
偏差平方和 自由度 0.281 0.408 0.688994 2 6 8
均方和 0.140724 0.0679243
F比 2.072
显著性水平 0.25
注：F0.25(2,6)=1.76，F0.1(2,6)=3.46，F0.05(2,6)=19，F0.01(2,6)=99.01
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•
•
两种提取方法的对比 Comparison of two extraction methods
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结论
1 2 3 4 5
考察提取时间, 间隔保护时间，超声波功率对乳酸菌胞外多糖 提取率的影响, 通过正交实验确定了最佳工艺条件: 超声提取 时间10min，超声波输出功率200W,间隔保护时间2s. 各因素影响力的大小为: 超声波波功率>提取时间>间隔保护时 间 超声波输出频率对结果有显著性影响, 提取时间和间隔保护时 间为非显著性影响因素 超声波辅助提取与传统方法比较实验得出乳酸菌胞外多糖提取 率达1.413%,与传统方法相比，提取率提高了29.39%。 用于乳酸菌胞外多糖的超声波提取技术与传统提取技术相比可 以明显提高多糖的得率, 是可行并有一定应用前景的
超声波时间对乳酸菌胞外多糖 提取率的影响
A 试样号 1 2 3 提取时间 （min） 10 20 30 B 提取功率 （W） 400 400 400 C 间隔保护时 间（S) 2 2 2
4
5
15
15
400
500
2
2
4
5
40
50
400
400
2
2
超声波提取乳酸菌胞外多糖的正交实验 在单因素试验的基础上对乳酸菌胞外多糖的提取进行正 交实验分析，最后确定乳酸菌胞外多糖最佳的提取条件。
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结果与分析
单因素优选实验的结果
不同超声波功率对多糖提取率的影响
2 1.8 1.6
多糖提取率%
1.4 1.2 1 0.8 0.6 100 200 300 超声波输出功率W 400 500
超声波功率对多糖提取率的影响 The impact of power on the extraction rate
表2正交设计表 Table2 Orthogonal design
因素 水平 1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 A 提取时间 （min） 1(5) 1(5) 1(5) 2(10) 2(10) 2(10) 3(15) 3(15) 3(15) 1.919 B 提取功率 （W） 1(100) 2(150) 3(200) 1(100) 2(150) 3(200) 1(100) 2(150) 3(200) 1.79 C 间隔保护时间 （S） 1(1) 2(2) 3(3) 2(2) 3(3) 1(1) 3(3) 1(1) 2(2) 1.758 D 空列 1 2 3 3 1 2 2 3 1 提取率 （% ） 0.68 0.347 0.892 0.8 0.889 0.758 0.31 0.32 1.13
立题依据
研究基本内容
材料和方法
结果与讨论
结论 致谢
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立题依据
乳酸菌胞外多糖是由乳酸菌在生长代谢过程中产生的分泌 到细胞壁外的粘液或荚膜多糖(LAB EPS)。 乳酸菌胞外多糖的生理作用： LAB EPS起到保护菌体的作用，包括保护细胞免受 毒害、抵御不良环境、增强抗性、鏊合金属离子、定植和 细胞识别。 乳酸菌EPS主要有以下几个方面的生理功能:
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研究基本内容
本研究利用超声波提取乳酸菌胞外多糖，通过超 声时间、功率、间隔时间的单因素试验和在此基 础上进行的正交试验确定提取乳酸菌胞外多糖的 最佳工艺条件。
探索超声波提取法提取乳酸菌胞外多糖是否可以 有效提高多糖的提取率
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苯酚硫酸法
多糖测定
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回收乙醇
超声波提取乳酸菌胞外多糖的 单因素实验
超声波功率对乳酸菌胞外多糖 提取率的影响
A 试样号 1 2 3 提取时间 （min） 15 15 15 B 提取功率 （W） 100 200 300 C 间隔保护时 间（S) 2 2 2
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单因素优选实验的结果
不同超声波时间对多糖提取率的影响
1.2 1.1
多糖提取率%
1 0.9 0.8 0.7 0.6 10 20 30 40 超声波提取时间min 50
超声波时间对多糖提取率的影响 The impact of time on the extraction rate
取0.075g样品,定容至50ml，吸取0.2ml乳酸菌胞外多糖溶液,再
加蒸馏水至2ml,另精密吸取蒸馏水2ml作空白对照,分别加入5%苯 酚溶液1ml,混合均匀后快速加入浓硫酸5.0ml,即刻摇匀,沸水浴 加热15min,取出,流水冷至室温,用紫外可见分光光度计在490nm 下测量，得到吸光度值。
1.改善乳制品的组织状态
2.改善菌株对肠道粘膜的吸附 3.抗肿瘤作用
4.对免疫系统的促进作用
5.对细胞体的保护作用
BEA Confidential. | 3
乳酸菌胞外多糖还被作为食品添加剂和发酵剂被广泛应 用。 超声波提取技术 超声波应用于生物提取技术是一个较新的研究领域。 超声波提取技术(ultrasonicwave extraction）是以超声 辐射压强产生的骚动效应、空化效应和热效应,引起机 械搅拌、加速扩散溶解的一种新型提取方法,能够更有 效地提高有效部位的提取率。 很多相关实验证明，超声波辅助提取多糖有明显优 势，但是关于超声波辅助提取乳酸菌胞外多糖还没有相 关文献。所以对超声波辅助提取乳酸菌胞外多糖的研究 具有很好的意义和前景。
脱脂牛乳Biblioteka Baidu
接种量为10%
接种
37℃，10h
超声波提取
42℃,PH=7，0.07g中 性蛋白酶，2.5h
均质
发酵酸乳
蛋白酶水解
5000r/min,4℃ 15min离心2次
上清液离心
浓缩至80ml
浓缩
乙醇：样液=3:1， 4℃，24h 6000r/min,4℃ 15min离心1次
烘干
60℃
离心
乙醇沉淀
粗制EPS
超声波提取乳酸菌胞外多糖初步研究
The preliminary study of ultrasonicwave extraction of lactic acid bacteria exopolysaccharides
报告人：聂晶晶
导 师：张铁华
吉林大学 食品科学与工程专业
超声波提取乳酸菌胞外多糖初步研究
BEA Confidential. | 8
多糖提取率的计算
粗多糖提取率 =c×50×M÷0.075÷1000÷W ×100%
式中：c为多糖含量(mg/ml)，M为烘 干后多糖的重量(g)，W为原料重量。
BEA Confidential. | 9
实验方法
工艺流程
脱脂奶粉
脱脂奶粉：蒸馏水 为7:100
BEA Confidential. | 17
超声波提取法与传统提取方法的比较
样品1经超声波提取时间10min，超声波功率200W,间 隔保护时间2s处理，样品2不经超声波处理。 经计算后得出：
1.6 1.4 1.2 1 多糖提取率% 0.8 0.6 0.4 0.2 0
•
样品1 样品2
样品1经超声波提取 后的多糖提取率为 1.413%。 样品2未经超声波提 取，多糖提取率为 1.092%。 提取率在原有基础 上提高了29.39%。
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致谢
本论文是在导师张铁华老师悉心指导下完成的，张老师在 工作繁忙之余总是抽空认真耐心负责地引导我查阅资料以及 做实验，带给我巨大的帮助和指导。在此我要对我的恩师表 示由衷的感谢。
感谢实验室各位师兄师姐和朋友们在我试验遇到困难和 阻碍的时候给予我的帮助，这为实验的成功带来了巨大帮助, 也增进了我们的友情。
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0.9
0.8
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 0.02 0.04 0.06 0.08 y = 13.586x - 0.002
R2=0.9966
葡萄糖标准曲线 Standard curve of glucose
苯酚- 浓硫酸法测乳酸菌胞外多糖含量：
K2
K3 R 优水平 主次因素 优搭配
2.447
1.76 0.687 A2 B>A>C A2B3C2
1.556
2.78 1.224 B3
2.277
2.091 0.519 C2
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表3. 方差分析 Table3.Analysis of variance
方差来源 B 误差 总和
BEA Confidential. | 20
紫外可见分光光度计, 752－PC, 上海光谱仪器有限公司
烘箱 电子恒温水浴锅，HH－6，深 圳天南海北实业有限公司
超声波细胞粉碎仪
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多糖测定方法
苯酚—浓硫酸法
多糖类物质在强酸和加热条件下能迅速水解成单糖，单糖在强酸 条件下与酚反应生成橙色衍生物，该橙色衍生物在波长490nm处有 最大吸收，可用光度法进行定量分析。
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超声波提取乳酸菌胞外多糖的正交实验
表1 因素水平表 Table1 Factors and levels
因素 水平
A
B
C
提取时间（min）提取功率（W）间隔保护时间（S) 1
2 3
5
10 15
100
150 200
1
2 3
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实验材料和方法
实验材料 开菲尔菌种，脱脂奶粉（完达 山乳业，购于超市），95%无 水乙醇，浓硫酸，苯酚，中性 蛋白酶氢氧化钠，均为分析纯， 实验用水为蒸馏水。 主要实验仪器
恒温培养箱 超声波细胞粉碎机，JY92－2D， 宁波新芝生物科技股份有限公 司 高速冷冻离心机，CR20B2， HITACHI(日立公司) 旋转蒸发器+恒温水浴锅+循环 水真空泵, 5升,巩义市英峪高科 仪器厂
标准曲线的绘制： 用标准品葡萄糖配成浓度各为0.1mg/ml的标准糖溶液。苯酚溶液 (质量分数5 %),称取5g的苯酚, 用蒸馏水定容于100ml的棕色容量瓶中。 精密吸取标准单糖溶液0.0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2ml,分置于具塞 试管中,加蒸馏水至体积2.0ml,再加苯酚1.0ml,迅速摇匀后滴加浓硫酸 5.0ml,摇匀后放置5min,置沸水浴中加热15min,取出迅速冷却至室温; 另以蒸馏水2.0ml,加苯酚1.0ml和浓硫酸8.0ml,同上做3个空白对照.于 490nm处测吸光度。以吸光度为纵坐标,葡萄糖加入量为横坐标绘制 葡萄糖标准曲线。
实验总结
表2上述实验结果表明乳酸菌胞外多糖的最佳提取工艺条 件为A2B3C2,即超声提取时间10min，超声波功率200W,间隔 保护时间2s.
还可以看出所选各因素对乳酸菌胞外多糖提取率影响的 主次顺序为：超声波功率 >提取时间 >间隔保护时间。
从方差分析表3的结果可以看出, 超声波功率对结果有显著性影 响,提取时间和间隔保护时间为 非显著性影响因素。
偏差平方和 自由度 0.281 0.408 0.688994 2 6 8
均方和 0.140724 0.0679243
F比 2.072
显著性水平 0.25
注：F0.25(2,6)=1.76，F0.1(2,6)=3.46，F0.05(2,6)=19，F0.01(2,6)=99.01
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•
两种提取方法的对比 Comparison of two extraction methods
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结论
1 2 3 4 5
考察提取时间, 间隔保护时间，超声波功率对乳酸菌胞外多糖 提取率的影响, 通过正交实验确定了最佳工艺条件: 超声提取 时间10min，超声波输出功率200W,间隔保护时间2s. 各因素影响力的大小为: 超声波波功率>提取时间>间隔保护时 间 超声波输出频率对结果有显著性影响, 提取时间和间隔保护时 间为非显著性影响因素 超声波辅助提取与传统方法比较实验得出乳酸菌胞外多糖提取 率达1.413%,与传统方法相比，提取率提高了29.39%。 用于乳酸菌胞外多糖的超声波提取技术与传统提取技术相比可 以明显提高多糖的得率, 是可行并有一定应用前景的
超声波时间对乳酸菌胞外多糖 提取率的影响
A 试样号 1 2 3 提取时间 （min） 10 20 30 B 提取功率 （W） 400 400 400 C 间隔保护时 间（S) 2 2 2
4
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400
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超声波提取乳酸菌胞外多糖的正交实验 在单因素试验的基础上对乳酸菌胞外多糖的提取进行正 交实验分析，最后确定乳酸菌胞外多糖最佳的提取条件。
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结果与分析
单因素优选实验的结果
不同超声波功率对多糖提取率的影响
2 1.8 1.6
多糖提取率%
1.4 1.2 1 0.8 0.6 100 200 300 超声波输出功率W 400 500
超声波功率对多糖提取率的影响 The impact of power on the extraction rate
表2正交设计表 Table2 Orthogonal design
因素 水平 1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 A 提取时间 （min） 1(5) 1(5) 1(5) 2(10) 2(10) 2(10) 3(15) 3(15) 3(15) 1.919 B 提取功率 （W） 1(100) 2(150) 3(200) 1(100) 2(150) 3(200) 1(100) 2(150) 3(200) 1.79 C 间隔保护时间 （S） 1(1) 2(2) 3(3) 2(2) 3(3) 1(1) 3(3) 1(1) 2(2) 1.758 D 空列 1 2 3 3 1 2 2 3 1 提取率 （% ） 0.68 0.347 0.892 0.8 0.889 0.758 0.31 0.32 1.13
立题依据
研究基本内容
材料和方法
结果与讨论
结论 致谢
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立题依据
乳酸菌胞外多糖是由乳酸菌在生长代谢过程中产生的分泌 到细胞壁外的粘液或荚膜多糖(LAB EPS)。 乳酸菌胞外多糖的生理作用： LAB EPS起到保护菌体的作用，包括保护细胞免受 毒害、抵御不良环境、增强抗性、鏊合金属离子、定植和 细胞识别。 乳酸菌EPS主要有以下几个方面的生理功能:
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研究基本内容
本研究利用超声波提取乳酸菌胞外多糖，通过超 声时间、功率、间隔时间的单因素试验和在此基 础上进行的正交试验确定提取乳酸菌胞外多糖的 最佳工艺条件。
探索超声波提取法提取乳酸菌胞外多糖是否可以 有效提高多糖的提取率
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苯酚硫酸法
多糖测定
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回收乙醇
超声波提取乳酸菌胞外多糖的 单因素实验
超声波功率对乳酸菌胞外多糖 提取率的影响
A 试样号 1 2 3 提取时间 （min） 15 15 15 B 提取功率 （W） 100 200 300 C 间隔保护时 间（S) 2 2 2
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单因素优选实验的结果
不同超声波时间对多糖提取率的影响
1.2 1.1
多糖提取率%
1 0.9 0.8 0.7 0.6 10 20 30 40 超声波提取时间min 50
超声波时间对多糖提取率的影响 The impact of time on the extraction rate
取0.075g样品,定容至50ml，吸取0.2ml乳酸菌胞外多糖溶液,再
加蒸馏水至2ml,另精密吸取蒸馏水2ml作空白对照,分别加入5%苯 酚溶液1ml,混合均匀后快速加入浓硫酸5.0ml,即刻摇匀,沸水浴 加热15min,取出,流水冷至室温,用紫外可见分光光度计在490nm 下测量，得到吸光度值。
1.改善乳制品的组织状态
2.改善菌株对肠道粘膜的吸附 3.抗肿瘤作用
4.对免疫系统的促进作用
5.对细胞体的保护作用
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乳酸菌胞外多糖还被作为食品添加剂和发酵剂被广泛应 用。 超声波提取技术 超声波应用于生物提取技术是一个较新的研究领域。 超声波提取技术(ultrasonicwave extraction）是以超声 辐射压强产生的骚动效应、空化效应和热效应,引起机 械搅拌、加速扩散溶解的一种新型提取方法,能够更有 效地提高有效部位的提取率。 很多相关实验证明，超声波辅助提取多糖有明显优 势，但是关于超声波辅助提取乳酸菌胞外多糖还没有相 关文献。所以对超声波辅助提取乳酸菌胞外多糖的研究 具有很好的意义和前景。
脱脂牛乳Biblioteka Baidu
接种量为10%
接种
37℃，10h
超声波提取
42℃,PH=7，0.07g中 性蛋白酶，2.5h
均质
发酵酸乳
蛋白酶水解
5000r/min,4℃ 15min离心2次
上清液离心
浓缩至80ml
浓缩
乙醇：样液=3:1， 4℃，24h 6000r/min,4℃ 15min离心1次
烘干
60℃
离心
乙醇沉淀
粗制EPS
超声波提取乳酸菌胞外多糖初步研究
The preliminary study of ultrasonicwave extraction of lactic acid bacteria exopolysaccharides
报告人：聂晶晶
导 师：张铁华
吉林大学 食品科学与工程专业
超声波提取乳酸菌胞外多糖初步研究
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多糖提取率的计算
粗多糖提取率 =c×50×M÷0.075÷1000÷W ×100%
式中：c为多糖含量(mg/ml)，M为烘 干后多糖的重量(g)，W为原料重量。
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实验方法
工艺流程
脱脂奶粉
脱脂奶粉：蒸馏水 为7:100
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超声波提取法与传统提取方法的比较
样品1经超声波提取时间10min，超声波功率200W,间 隔保护时间2s处理，样品2不经超声波处理。 经计算后得出：
1.6 1.4 1.2 1 多糖提取率% 0.8 0.6 0.4 0.2 0
•
样品1 样品2
样品1经超声波提取 后的多糖提取率为 1.413%。 样品2未经超声波提 取，多糖提取率为 1.092%。 提取率在原有基础 上提高了29.39%。