狂犬病实验室检测技术指南【模板】
狂犬病的实验室诊断
以提取的RNA为模板，进行逆转录聚合酶链式 反应（RT-PCR），扩增病毒特异性基因片段， 从而判断标本中是否存在狂犬病毒。
标本保存和运输要求
低温保存
标本应保存在-70℃以下的超低 温冰箱中，以确保病毒的活性 和稳定性。
避光保存
避免标本长时间暴露在光线下 ，以免影响病毒活性。
密封运输
02
预防和控制狂犬病需要政府、社会和个人的共同努力，包括加
强疫苗接种、提高公众认知、加强动物管理等措施。
通过有效的预防和控制措施，可以保护人类和动物的健康，维
03
护社会公共卫生安全。
02
实验室诊断方法概述
实验室诊断目的和意义
确诊狂犬病感染
通过实验室诊断方法，可以准确检测狂犬病病毒的 存在，从而确诊狂犬病感染，为临床治疗提供依据 。
实验室空气、表面和水源等也 应定期进行消毒处理，以减少 环境中病原体的传播风险。
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04
血清学检测方法
酶联免疫吸附试验
原理
将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行， 通过洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后根据酶作用于底物后显色来判断结果。
应用
ELISA法可用于检测狂犬病病毒抗原、抗体等，具有灵敏度高、特异性强、操作简便、 可批量检测等优点。
注意事项
操作过程中需注意避免交叉污染，设置阴阳性对照，严格控制反应条件等。
荧光抗体技术
原理
用荧光物标记抗体，与待测标 本中的相应抗原或抗体结合， 形成带荧光的抗原抗体复合物 ，在荧光显微镜下观察荧光以 判断结果。
应用
荧光抗体技术可用于狂犬病病 毒的快速诊断和病原学研究， 具有灵敏度高、特异性强、直 观快速等优点。
狂犬病抗体检测标准
狂犬病抗体检测标准狂犬病是一种由病毒引起的疾病，它主要通过动物的咬伤或唾液传播给人类。
由于狂犬病在人类中的致死率相当高，因此对疑似暴露于病毒的个体进行抗体检测是非常重要的。
这种检测有助于早期发现感染病例，采取适当的预防措施来避免病毒传播和控制疾病的传播。
狂犬病抗体检测标准包括两个关键方面：样本采集和实验室检测方法。
首先是样本采集。
狂犬病抗体检测通常通过采集个体的血清样本进行。
血清样本是血液中无细胞成分，含有抗体和其他血浆成分的部分。
采集样本时，应使用无菌的注射器或针头抽取2-5毫升的血液，并在一个无菌集装袋中保存和运输。
为了确保准确性和重复性，需要注意以下事项：1.采集血样的时间：在可能被感染的动物咬伤或暴露后，应尽快采集血液样本。
这是因为病毒会在人体内逐渐繁殖并引起感染，而早期采集血样可以确保检测到病毒的早期感染情况。
2.保存和运输：血清样本应该尽快送到实验室进行检测。
如果无法立即送达实验室，样本应在2-8摄氏度下冷藏保存，并在24小时内送达实验室。
长时间的运输和储存可能导致样本中的抗体结构发生变化，从而影响检测结果的准确性。
接下来是实验室检测方法。
狂犬病抗体检测通常使用酶联免疫吸附试验（ELISA）来检测血清中的狂犬病抗体。
这种检测方法具有高度的敏感性和特异性，可以快速而有效地检测出抗体的存在。
ELISA检测方法基于抗体和抗原之间的特异性结合原理：当抗原与其对应的抗体结合时，会发生可见的颜色反应。
在进行狂犬病抗体检测时，实验室会使用已知病毒抗原来与患者的血清样本进行反应。
如果患者的血清中存在狂犬病抗体，就会发生可见的颜色反应，以证明阳性结果。
为了确保狂犬病抗体检测的准确性和一致性，有一些标准和指南被制定出来。
这些标准包括：1.狂犬病国际标准血清：这是一种由已知抗体浓度的血清制成的标准样品。
在检测过程中，狂犬病国际标准血清被用作参考样本，以确保检测结果的准确性和可比性。
2.检测结果的解读标准：根据不同的检测方法和实验室标准，可能会存在不同的结果解释标准。
狂犬病病毒实验室检测方法
狂犬病病毒实验室检测方法摘要：狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，近年来又有感染上升的趋势。
一种准确、灵敏、快速的实验室检测诊断方法就显得极为重要。
现就酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体方法（FAT）、快速荧光抑制灶技术（RFFIT）、反转录－聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述。
关键词：狂犬病狂犬病病毒检测方法狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁、急性致死性脑脊髓炎，进行性麻痹和最终死亡为主要临床特征。
RV可感染多种温血动物引起死亡，表现为高度嗜神经性。
脑组织感染RV后遭到破坏，使得狂犬病感染的病死率几乎100%。
据WHO数据显示狂犬病在全世界150个国家和地区出现过狂犬病病例。
尽管狂犬病可以通过疫苗免疫进行预防，全世界每年仍有超过5.5 万人死于该病，主要集中在亚、非、拉等发展中国家[1]。
中国狂犬病疫情较严重，居世界第2位[2~3]，近年来，狂犬病疫情呈现回升的趋势[4]。
检测狂犬病抗原抗体、分析狂犬病的流行特点，并建立高效、快速、可靠的实验室检测方法可以有效控制此病的流行。
下面主要针对RV的形态特征和分子结构及主要的检测技术进行概述。
1、狂犬病病毒形态特征RV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）血清/基因1 型，单股负链RNA病毒。
电镜下观察病毒粒子直径为70～80nm，长160～240nm，一端钝圆，另一端平凹，整体呈子弹状[5]。
病毒有双层脂质外膜，其外面镶嵌有1072-1900个8-10nm长的纤突(spike)，为糖蛋白，每个糖蛋白呈同源三聚体形式，电镜还显示了糖蛋白具有“头”和“茎”结构。
实验动物狂犬病病原检测
实验动物狂犬病病原检测一、原理在微孔板上预包被纯化狂犬病毒抗原，使免疫反应在固相载体上进行。
当被检血清中有狂犬病病毒抗体存在时，则与孔壁上的抗原形成抗原抗体复合物，再与抗犬IgG酶标记物反应，最后通过测定酶作用底物催化后的产物，进行定性检测。
二、主要试剂和器材1、试剂：犬狂犬病毒IgG抗体检测试剂盒(定性)，包括：•预包被狂犬病毒抗原的微孔板；•狂犬病毒IgG标记物；•狂犬病毒IgG阳性对照；•狂犬病毒IgG临界对照；•狂犬病毒IgG阴性对照；•显色液A：磷酸氢钠-柠檬酸缓冲液(O.05mol∕LpH5.0)IooonIL,30%过氧化氢H202(MW340)3.5mL；•显色液B：柠檬酸L052g,乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)0.186g四甲基联苯胺(TMB)O.25g,二甲基亚飒(DMSO)8.OmL纯化水992mL；•终止液:98%硫酸278mL纯化水972.2mL；•10倍浓缩洗涤液:PBS(0.lmol∕LpH7.2~7.4)995mL吐温-20.5mL；•样品稀释液：硼酸盐缓冲液(O.01mol∕LpH8.0)956.OmL,甘油(MW92.09)40.OmL,酪蛋白(casein)10%硫柳汞钠溶液 2.OmL吐温-20,1.0mL,1%酚红溶液LomU•试剂在使用前应恢复至室温(18。
C〜25七)。
2、器材包括：•精密移液器10μL-100uL;•一次性移液器吸头；•振荡器；•酶标仪(含450nm波长滤光片);•37。
C恒温培养箱；•蒸锵水或去离子水；•IoOmL量简；•离心机；•吸水纸。
三、检测1、样品的准备将采集到的待检犬血液样品离心，分离出待检犬血清或血浆。
应避免使用染菌、溶血和高血脂的样品；室温保存样品不应超过8h,若试验在8h以后进行，需将样品保存在2。
C〜1(ΓC,如保存超过1周，则应保存在-20。
C并避免反复冻融。
2、试剂配置将10倍浓缩洗涤液恢复至室温并振摇然后用去离子水或蒸储水作10倍稀释。
狂犬病病毒实验室检测方法
狂犬病病毒实验室检测方法摘要：狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，近年来又有感染上升的趋势。
一种准确、灵敏、快速的实验室检测诊断方法就显得极为重要。
现就酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体方法（FAT）、快速荧光抑制灶技术（RFFIT）、反转录－聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量 RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述。
关键词：狂犬病狂犬病病毒检测方法狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁、急性致死性脑脊髓炎，进行性麻痹和最终死亡为主要临床特征。
RV可感染多种温血动物引起死亡，表现为高度嗜神经性。
脑组织感染RV后遭到破坏，使得狂犬病感染的病死率几乎 100%。
据WHO数据显示狂犬病在全世界150个国家和地区出现过狂犬病病例。
尽管狂犬病可以通过疫苗免疫进行预防，全世界每年仍有超过 5.5 万人死于该病，主要集中在亚、非、拉等发展中国家[1]。
中国狂犬病疫情较严重，居世界第2位[2~3]，近年来，狂犬病疫情呈现回升的趋势[4]。
检测狂犬病抗原抗体、分析狂犬病的流行特点，并建立高效、快速、可靠的实验室检测方法可以有效控制此病的流行。
下面主要针对RV的形态特征和分子结构及主要的检测技术进行概述。
1、狂犬病病毒形态特征RV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）血清/基因 1 型，单股负链RNA病毒。
电镜下观察病毒粒子直径为70～80nm，长160～240nm，一端钝圆，另一端平凹，整体呈子弹状[5]。
病毒有双层脂质外膜，其外面镶嵌有1072-1900个8-10nm长的纤突(spike)，为糖蛋白，每个糖蛋白呈同源三聚体形式，电镜还显示了糖蛋白具有“头”和“茎”结构。
狂犬病的实验室检测与诊断技术
狂犬病的实验室检测与诊断技术武汉生物制品研究所基因工程室严家新研究员一、狂犬病实验室检测与诊断技术的用途1. 狂犬病人存活期内的实验室诊断：目前尚无实验室方法可确认处于潜伏期的狂犬病人。
对可能感染狂犬病毒而尚未发病（即处于潜伏期）的人应尽快接种狂犬病疫苗，必要时还要同时接种抗血清。
国外文献上比较可靠的研究结果已证明，狂犬病的潜伏期可能超过6年。
狂犬病疫苗在暴露后接种越快越好，但只要是在发病前，接种疫苗都会有保护作用，补种疫苗可以说没有时间限制。
狂犬病人一旦发病，其死亡率为100%。
病人在发病后最初几天，检测狂犬病毒的抗原一般是敏感的，常可在其唾液、角膜印片、尿液或皮肤中检出病毒抗原。
检测抗原可用荧光抗体（FA）法检查。
但是，FA阳性标本在发病的后期更常见。
皮肤活组织检查最好从颈背部取含有末稍神经的带有毛囊的标本。
出现早期症状时检测抗原，仅有25-50%的患者为阳性；随着病情的进展阳性率也增加。
而脑脊液及血清中的病毒中和抗体常常趋向于在病后7—10天才出现。
但在国内护理条件下，狂犬病人发病后，很少能维持生命7天以上。
2. 动物和人狂犬病的死后诊断：可用抗原检测、病毒分离、病毒鉴定等方法进行死因确诊和病毒来源、演化分析。
3. 测定狂犬病毒的抗体:主要用于确定人或动物接种狂犬病疫苗是否成功。
W H O狂犬病专家委员会认为大于或等于0.5 IU/ml的抗体水平表示免疫接种成功，能得到有效的保护。
前段时间国内因狂犬病疫苗假冒伪劣产品猖獗，而狂犬病疫苗的质量又是性命攸关的事，疫苗接种者主动要求在疫苗接种后测抗体的越来越多，这是可以理解的。
但只要疫苗的质量和供货渠道（包括保存条件）可靠，通常并不要求每个接种者都检测抗体。
因为除非接种者本身可能有免疫功能方面的异常，合格疫苗的抗体阳转率应为100%。
二、狂犬病的实验室检测与诊断的必要性典型的狂犬病的临床表现十分典型，但也有约40%的狂犬病例属瘫痪型，其表现并不典型，很容易与其他疾病混淆，所以实验室检测手段对狂犬病的确诊非常必要。
家畜传染病学实验指导：狂犬病的实验室诊断 免费
实验十四狂犬病的实验室诊断目的掌握狂犬病的病理组织学和动物试验诊断技术。
内容及方法一、病理组织学检查1．病料的采取对疑为狂犬病而扑杀或死亡的小动物可送检完整的新鲜尸体，如为大动物，则送检未剖开的头或保存于30％甘油中的新鲜大脑。
采取病料时，按一般方法剖开头骨，术者须戴胶皮手套及防护眼镜，以免病料侵入皮肤或溅人眼内。
头骨打开后小心地将脑取出，置于一盘中。
作生物学试验时，可采取脑的任何部分，而检查内基氏小体时，则常采取脑海马角、小脑和延脑。
摘除海马角最简单的一种方法是从脑底面采取，即将脑底朝上放，切除小脑，此时可在内面见到海马回(图8左)。
然后将海马回的边缘稍翻转，即可在它下面看到海马角(图8右)。
2．切片及触片的检查(1) 切片的制作从海马角横切下几块3～4mm厚的组织，浸泡在固定液中，按常规制作切片。
(2) 触片的制作取海马角一小块,用锐利的外科刀或刀片取一小块组织,使断面向上贴于软木塞上或木片上,以清洁的载玻片细心地接触切面，按压2～3个捺印，一份病料做3～4张触片。
(3)切片或触片的染色镜检塞勒(Seller)氏染色法：标本不需事先固定，直接将玻片浸入塞勒氏染液中，染色3～5s。
染色液配制法如下：碱性复红饱和甲醇溶液2～4ml (100ml甲醇内加复红6～8g)；美蓝饱和甲醇溶液15～20ml (100ml甲醇内加美蓝1．5g)；甲醇(不含丙酮者)25ml；先将后两液混合，再加入前液。
经3～5s染色后用蒸馏水冲洗，干燥后镜检。
内基氏小体染成樱桃红色，嗜碱性组织与细胞核呈深蓝色，细胞浆呈蓝紫色，间质呈粉红色，而神经鞘不着色，红细胞染成古铜色，杂菌为深蓝色。
曼(Mann)氏染色法：染液配制 l％复红水溶液35ml，1％美蓝水溶液35ml，加蒸馏水l00ml。
碱性纯酒精(1％苛性钠无水酒精溶液lml，无水酒精30m1)。
微酸性水(蒸馏水l00ml加纯醋酸2～3滴)。
染色法将触片或脱脂的切片浸入前液中5min，染色后迅速在水中洗涤并用滤纸吸干，然后置于无水酒精中洗涤并置于碱性纯酒精中20s。
狂犬病病毒实验室检测方法
狂犬病病毒实验室检测方法摘要：狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，近年来又有感染上升的趋势。
一种准确、灵敏、快速的实验室检测诊断方法就显得极为重要。
现就酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体方法（FAT）、快速荧光抑制灶技术（RFFIT）、反转录－聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述。
关键词：狂犬病狂犬病病毒检测方法狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁、急性致死性脑脊髓炎，进行性麻痹和最终死亡为主要临床特征。
RV可感染多种温血动物引起死亡，表现为高度嗜神经性。
脑组织感染RV后遭到破坏，使得狂犬病感染的病死率几乎100%。
据WHO数据显示狂犬病在全世界150个国家和地区出现过狂犬病病例。
尽管狂犬病可以通过疫苗免疫进行预防，全世界每年仍有超过5.5 万人死于该病，主要集中在亚、非、拉等发展中国家[1]。
中国狂犬病疫情较严重，居世界第2位[2~3]，近年来，狂犬病疫情呈现回升的趋势[4]。
检测狂犬病抗原抗体、分析狂犬病的流行特点，并建立高效、快速、可靠的实验室检测方法可以有效控制此病的流行。
下面主要针对RV的形态特征和分子结构及主要的检测技术进行概述。
1、狂犬病病毒形态特征RV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）血清/基因1 型，单股负链RNA病毒。
电镜下观察病毒粒子直径为70～80nm，长160～240nm，一端钝圆，另一端平凹，整体呈子弹状[5]。
病毒有双层脂质外膜，其外面镶嵌有1072-1900个8-10nm长的纤突(spike)，为糖蛋白，每个糖蛋白呈同源三聚体形式，电镜还显示了糖蛋白具有“头”和“茎”结构。
狂犬病实验室诊断：重庆狂犬抗体检测指南
狂犬病实验室诊断一、狂犬病实验室诊断病人发病后（死亡前）可采集其唾液（间隔3-6小时，至少采集3份）、脑脊液、血清及颈后带毛囊的小块皮肤；病人死后最好采集其脑组织标本（小脑和脑干）进行实验室检测。
直接免疫荧光法是狂犬病诊断的金标准，可以快速、敏感、特异地检测人和动物脑组织中的病毒抗原。
临床病例活体组织标本（如颈后部皮肤毛囊）亦可进行DFA检测。
直接快速免疫组化法及酶联免疫吸附测定法亦可特异检测狂犬病病毒抗原。
病毒核酸检测可用于早期诊断，以逆转录PCR法检测体液（唾液、血清等）和脑组织等标本，但需要严格的质量控制以保证结果的准确性。
脑组织及唾液等病毒含量高的样本还可进行病毒分离。
细胞培养分离所需时间（1-2天）远少于小鼠颅内接种分离法所需时间（10-21天），且前者的生物安全风险远小于后者。
未接种过疫苗的患者，发病早期几乎没有中和抗体产生，到发病晚期（通常在临床症状出现后7-8天），病毒在脑内大量增殖后突破血脑屏障进入血液，刺激机体产生低水平的中和抗体。
通过病毒中和试验检测病人血清或脑脊液中的中和抗体，可作为狂犬病诊断的依据之一。
世界卫生组织（WHO）推荐的抗狂犬病病毒中和抗体标准检测方法包括快速荧光灶抑制试验（RFFIT）和小鼠脑内中和试验（MNT）。
由于RFFIT法无需使用小鼠，所用时间短（24小时），目前已被广泛采用。
RFFIT方法也是我国现行药典规定的检测狂犬病病毒中和抗体的标准方法之一。
此外，常用的狂犬病病毒中和抗体检测方法还有荧光抗体病毒中和试验（FAVNT）。
用ELISA法测定的抗狂犬病病毒糖蛋白抗体滴度与用病毒中和试验测定的结果有一定的相关性（约80%符合率），但相应试剂盒尚未普及。
此外，还可以通过检测中和抗体，监测暴露前抗体背景及暴露后疫苗注射的免疫效果。
WHO狂犬病专家咨询委员会认为：中和抗体水平等于或高于0．5IU/ml时，接种者才具备了有效的保护能力；如果发现中和抗体水平低于0．5IU/ml，应进行加强免疫，至达到有效保护水平为止。
狂犬病的实验诊断方法
狂犬病的实验诊断方法狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的致命的神经系统疾病。
早期的病毒检测方法依赖于动物的大脑组织或脊髓液样本，但这些方法不仅需要病毒在大脑中进行复制，而且也有传播病毒的风险。
因此，近年来，研究人员已经发展出一些实验室诊断方法来检测狂犬病病毒。
目前，主要的实验室诊断方法包括直接免疫荧光试验（Direct Immunofluorescence Assay，DFA）、滴度测定法（VirusNeutralization Test，VNT）、聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）和免疫组织化学染色（Immunohistochemistry，IHC）。
直接免疫荧光试验是一种常用的狂犬病病毒检测方法。
它使用特异性单克隆抗体来识别狂犬病病毒的抗原。
通过在疾病动物的脑组织切片上施加单克隆抗体并且经过染色，病毒抗原会与抗体结合形成荧光染色，并通过荧光显微镜观察。
这种方法的优点是快速和准确，可以在病毒分离和动物死亡之前得出结果。
然而，它需要经过训练的实验室技术人员进行操作，并且有时可能出现假阴性结果。
滴度测定法是通过将狂犬病病毒与病毒中和抗体混合来测定病毒的滴度。
该方法基于当病毒与病毒中和抗体结合时，不能侵入新宿主细胞。
这种方法需要一定时间，通常需要3-5天才能得到结果。
这种方法的优点是可以测定病毒的效价，并且可以用于评估深度冷冻疫苗的效果。
然而，该方法需要繁琐的操作步骤，并且对实验室条件要求较高。
聚合酶链式反应是一种在检测狂犬病病毒中应用广泛的方法。
它通过扩增病毒RNA或DNA的特定区域来检测病毒。
首先，通过提取样品中的RNA或DNA，然后进行逆转录反应（对于RNA）或核酸扩增反应（对于DNA）以合成相应的cDNA或DNA，并最后通过PCR扩增目标区域。
这种方法极其敏感，可以检测到非常低浓度的病毒，但在操作过程中需要谨慎处理以避免污染。
此外，PCR方法已经逐渐从传统的实验室检测中发展到快速诊断方法，如实时定量PCR。
狂犬病的实验室检测和诊断技术
生物安全级别＆对工作人员的要求
(Biological Safety Level, BSL ) (Protection, P ) BSL-1：实验人员在实验程序方面受过特殊训练，由受 过微生物学或相关科学一般训练的科学工作者监督实验。 BSL-2：实验人员均接受过病源处理方面的特殊培训， 并由有资格的科学工作者指导。 BSL-3：实验人员应在处理致病性的和可能使人致死的 病源方面受过专业训练，并由对该病源工作有经验的、 有资格的科学工作者监督。 BSL-4：实验室成员应在处理特别危险的传染源方面受 过特殊和全面的训练，应了解标准和特殊操作中一级和 二级遏制的作用、遏制设备、实验室设计性能。实验由 在有关病源方面受过训练、并有工作经验的、有资格的 科学工作者监督。
荧光标记抗 狂犬病毒抗体
狂犬病毒抗原
荧光抗体实验检测狂犬病毒抗原
FAT的技术要求：
—— 由于狂犬病毒多分布在动物脑海马回及脑干处， 因此合适的取样部位对抗原的检测很重要。 —— 脑样品印片必须用丙酮固定 5-10 分钟，因为丙酮 可去除细胞膜表面的脂类，以便抗体到达细胞内与狂 犬病毒结合。 ——脑样品必须保存在含50%甘油的生理盐水中，印片 染色前需用生理盐水洗涤数次。 ——荧光标记抗体需最大限度降低非特异性反应，因 此制备特异性、高效价的抗体是FAT的关键。
2) 唾液腺的获取
为取出颌下腺，在复盖于下颌骨间 的皮肤上作一切割，将皮肤往外侧翻， 两侧的颌下腺位于颌骨后部边缘表面。 在下颌下淋巴结的后面（这二种不要相 混淆）。
4. 标本的快速收集技术
在某些情况下可能难于或不可能尸解以便 打开颅骨取脑, 为减少这些困难已经设计出简 便的技术，即用塑料管插入颅骨采集一小块脑 组织体。 第一种技术是用吸管通过枕骨孔插入并往 前推至一眼睛部位，则吸管中的脑组织内含有 部分脑干，小脑，海马回和皮质。 第二种技术为将吸管通过眼窝后壁(用套管 穿孔)并推至枕部，脑组织内含有部分皮质、 海马回、小脑。
狂犬病毒ELISA抗体检测试验
狂犬病毒ELISA抗体检测试验一、试验材料：1．预包被狂犬病毒抗原的微孔板2．酶标记物3．狂犬病毒IgG阳性对照4．狂犬病毒IgG临界对照5．狂犬病毒IgG阴性对照6．显色液A7．显色液B8．终止液9．浓缩洗涤液（10倍）10．样品稀释液11．封板膜二、操作方法：1．试剂盒放置室温平衡20～30分钟。
取出浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水作10倍稀释备用。
2．稀释样品：将已分离好的血清用样品稀释液做1:100稀释（即取10μl血清或血浆加入到1ml样品稀释液中），并充分混匀。
3．加样：取所需量的预包被微孔板条固定于板架上，加入稀释好的样品，100μl/孔，然后将阳性、阴性对照各加1孔，临界对照加3孔，100μl/孔，另留一孔不加样品作空白对照孔，在记录纸上记录各样品和对照品的次序或位置。
剩余的板条放入密封袋中保存。
4．孵育：加样完成后，置37℃恒温箱或水浴箱（用封板膜覆盖板条，以避免水珠滴入微孔）中孵育30分钟。
5．洗板：甩净孔中液体，拍干，用稀释好的洗涤液加满每孔，停留1分钟后甩净、拍干，反复洗板3次。
6．加酶：除空白对照外，其余各孔垂直滴加酶标记物50μl（1滴），置37℃孵育30分钟。
7．显色：按第5步洗板3次，拍干后每孔（含空白孔）垂直滴加显色液A、B各50μl（1滴），置37℃避光显色15分钟。
8．终止：每孔（含空白孔）立即加入终止液50μl（1滴），混匀后用酶标仪450nm波长测定A值。
三、结果判定：1．单波长检测：以空白孔调零，用酶标仪读取450nm处的A值。
2．双波长检测：用酶标仪读取450nm和630nm处的A值，以A450nm—A630nm计算A值。
3．阴性对照A值≤0.15,0.20≤临界对照A值平均值≤0.80，临界对照A值平均值/阴性对照A值平均值≥2.0，阳性对照A值＞临界对照A值平均值，证明实验成立，否则试验结果无效，需重新试验。
4．如样品孔A值≥临界对照A值的平均值判为阳性；反之为阴性。
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附件2 狂犬病实验室检测技术指南
1、实验室条件及生物安全操作要求
（1）从事狂犬病临床和实验室的工作人员需要暴露前免疫，所有意外暴露于狂犬病毒时必需立即报告本部门负责人。
（2）操作所有潜在狂犬病感染的材料均应在P2或P3（实验室固定毒在P2，病人或动物分离的街毒在P3）生物安全实验室内进行。
（3）当实验室对接收到的动物标本进行操作时，必须在P3以上条件的专业实验室中进行。
没有安全实验室（P3级）的单位，严禁从事病毒分离工作。
（4）实验前要穿戴好防护服装、眼镜、手套，作好技术上的准备。
（5）由于空气传播狂犬病毒已经得到证实，因此高速混悬或离心操作应在密闭状态下进行。
（6）实验后要作好善后消毒处理,狂犬病毒对脂溶剂（肥皂水、醚、氯仿、丙酮），45～70%乙醇，碘制剂和四铵化合物敏感，操作完毕对操作台、实验材料等
要用相应的消毒剂或高压蒸汽进行消毒处理。
2、实验室检测网络组成及职责
（1）中国疾病预防控制中心牵头，全国各省级疾病预防控制中心及所辖区域内的各级疾病预防控制中心组成实验室检测网络。
（2）中国疾病预防控制中心职责
A.诊断试剂的研制、标准化，并推荐质量稳定可靠的诊断试剂；
B.负责毒株的鉴定和病毒变异性调查；
C.对各级实验室检测人员进行技术培训。
D.协助省级疾病预防控制中心完成标本的实验室检测。
（3）省级疾病预防控制中心职责
A.收集、保存辖区内各监测点的各种待检测标本。
B.辖区内各种标本的实验室检测。
C.对本省监测点标本采集和运送给与技术指导和协助。
（4）县级监测点疾病预防控制中心职责
采集病例标本，运送病例标本至省级疾病预防控制中心。
3、实验室检测方法
（1）病原检测：
A.免疫荧光法检测抗原：病人的脑脊髓液或唾液直接涂片、病人的角膜印片或咬
伤部位皮肤组织或脑组织印片或冷冻切片，丙酮固定，抗狂犬病毒特异性荧光
抗体染色检测狂犬病毒抗原。
B.快速狂犬病酶联免疫吸附法检测抗原：用pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释的抗狂犬
病毒核衣壳IgG包被96孔酶标板，4℃过夜；用含0.3％牛血清白蛋白和5% 蔗糖的pH9.6碳酸盐缓冲液封闭30分钟；将采集到的标本研磨，用pH 7.4 PBS 制成30％的悬液，离心取上清加入酶标板孔内，同时设阴性、阳性对照，200 µ l/孔，37℃孵育1小时；洗板四次后加入纯化的酶标记抗狂犬病毒抗体200μl/孔，37℃l小时后洗板，加入酶反应底物，室温作用30分钟，2M H2SO4终止反应，肉眼观察或酶标仪测定结果。
（2）核酸检测：
RT-PCR方法：以特异性扩增核蛋白（N）基因最保守区域为目的基因，设计一对引物：N1（＋）：5’-587TTT GAG ACT GCT CCT TTT G605-3’; N2（-）：5’-1092CC CAT ATA GCA TCC TAC605-3。
唾液、脑脊液、皮肤或脑组织标本以及感染病毒后的细胞培养物或鼠脑均可用于病毒核酸的检测。
基本步骤为：待检标本用细胞总RNA分离试剂提取病毒RNA，再通过逆转录反应合成与目的基因RNA序列互补的cDNA，PCR循环特异性扩增目的基因cDNA，电泳检测PCR扩增产物，判断检测结果。
（3）病毒分离：抗原或核酸检测阳性标本可以进行病毒分离以便进行更深入的研究。
A.细胞培养法分离病毒：将唾液、脑脊液、皮肤或脑组织标本研磨后，用PBS或
MEM制成30％悬液→4℃2000r/min离心20分钟→取上清接种在96孔或24孔培养板内已形成单层的敏感细胞（鼠神经传代细胞、Vero细胞或BHK21 细胞）上,吸附2小时后补加含2%血清的维持液，37℃5％C02 孵育约4～5天，丙酮固定感染后的细胞，用抗狂犬病毒单克隆抗体观察特异性荧光包涵体判断
结果。
阳性时吸取上清至一无菌容器内-70℃保存备用或继续传代。
病毒通过细胞的多次传代可以适应细胞培养并得到扩增。
B.乳小白鼠接种法分离病毒：30％的病人或动物脑组织悬液，离心取上清，接种
1～2日龄乳鼠脑内，每个样品注射一窝乳鼠；注射后的乳鼠应在具有高效滤过装置的负压饲养柜内饲养。
症状不典型时可于接种第一代后取脑继续传代，连
续传代后潜伏期逐渐规律，一般为5天左右。
发病乳鼠若确定为狂犬病毒感染，无菌取脑，-70℃或用含50％甘油的PBS -20℃保存，也可研磨后加灭菌脱脂牛
奶制成20％悬液，真空冷冻干燥，长期保存。
未发病存活的鼠保留至21天后杀死作免疫荧光检测
(4)抗体检测
A.特异性抗体检测：在自然感染情况下，狂犬病毒通常由被疯动物咬伤时通过其
带有病毒的唾液进入机体伤口内，在入侵部位狂犬病毒基本上不增殖，一般也不侵入血流，故不能形成病毒血症。
因此，在感染后的一段时间内狂犬病毒或其抗原不能与机体免疫系统广泛接触，不能有效刺激机体产生抗狂犬病毒感染的免疫应答反应。
狂犬病的晚期因血脑屏障作用被破坏，脑内大量病毒抗原得以进入血流，可以刺激机体的免疫系统产生大量特异性抗体。
因此，许多狂犬病人在发病早期血清中查不到抗体或抗体滴度很低，狂犬病特异性抗体只在临床疾病的晚期出现。
B.中和抗体检测：狂犬病疫苗免疫后血清中和抗体水平是测定疫苗免疫力程度的
评判指标，WHO狂犬病专家委员会认为中和抗体水平等于或高于0.5IU/ml血清，表示能得到有效的保护。
狂犬病毒中和抗体的检测可以用传统的小鼠中和试验或WHO推荐的快速荧光灶抑制试验（RFFIT）。
RFFIT试验时倍比稀释已经灭活的血清样品，同时设阴、阳性血清对照。
病毒用标准固定毒CVS株，细胞用BHK21细胞系。
首先将稀释的被检及对照血清0.1ml加入96孔细胞培养板中，再在各血清孔中加入0.1 m1标准病毒稀释液（100TCID50），37℃中和1.5小时；然后每孔加入细胞，37℃、5% C02培养过夜后弃掉培养液，PBS洗一次，丙酮固定。
干燥后，加荧光素标记的抗狂犬病毒抗体，37℃30分钟，PBS洗3次，荧光显微镜观察结果：比较实验组和阴性血清组的荧光灶，实验组中能使荧光灶抑制≥50％的血清最高稀释倍数，即为被检血清的中和抗体滴度。