微生物的生长和繁殖

②区带密度梯度离心法
将随机生长的细胞悬液置于蔗糖梯度溶 液表面，然后离心，不同生长周期的细胞由 于体积和质量大小不同，沉降系数多也不同， 于是同一生长周期的细胞聚集在离心液的一 个区带上，小细胞在上，大细胞在下。用这 种方法可以很方便地将处于较早周期的小细 胞收集起来，获得良好的同步群体。本法已 成功地应用于芽殖和裂殖酵母、大肠杆菌等 细胞的同步培养。
第四章 微生物的生长和繁殖
第一节 第二节 第三节 第四节 微生物的个体生长一细胞周期 微生物的群体生长 微生物的连续培养 影响微生物生长的主要因素
生长繁殖是生物体的一种重要生理功能。微 生物细胞在适宜的环境条件下不断地吸取营养物 质，并按一定的代谢方式进行新陈代谢活动。当 新陈代谢中同化作用的速度超过异化作用时，细 胞原生质总量不断增加，于是就出现生长． 细胞个体的增长是有限的．当细胞内的原生 质和各种细胞结构物协调地增长到一定程度时， 母细胞开始分裂，形成两个基本相同的子细胞。 在单细胞微生物中，细胞分裂导致生物个体数目 的增加，这就是繁殖。然而在多细胞生物中，如 果细胞数目的增加不同时伴有个体数目的增加， 那么仍只能称为生长。
第一节 微生物的个体生长 ---细胞周期
细胞周期是指新生的细胞长大以及最 后分裂为两个子细胞的过程。一个细胞周 期所经历的时间称为世代时间或倍增时间， 世代时间是微生物生长中极重要的概念。 一、同步生长 二、细菌细胞的表面生长和横隔形成 三、DNA复制和细胞分裂的协调
• 真核细胞的生长周期
D期
• 原核细胞的生长周期
②物理诱导
这是利用某种物理因子，使处于即将分裂的细胞的代谢 活动受到抑制，从而使细胞在分裂阶段前停步，以求得以后 分裂的同步。例如以温度为同步的诱导因子，就是基于细胞 周期不同，相对地对温度的敏感性也不同，如果分裂阶段中 某些关键反应对温度(高于或低于最适温度)的敏感性比合成 期高。那么高温(或低温)就可以阻止细胞分裂但不妨碍细胞 物质的合成(即分裂的准备)，这样可以使群体中那些分裂准 备工作进行较慢的细胞有时间赶上其他细胞，一旦恢复正常 条件就能获得同步生长，例如鼠伤寒沙门氏茵在25亿下培养 一段时间后，再置于37℃下继续培养，便可获得同步体。除 温度外，其他一些物理因子如光脉冲(对光合微生物)。x射 线等等也能诱导同步生长。有时将化学与物理诱导结合使用， 常可得到更好的同步效果。
③膜洗脱法
如果要获得比上述两种方法数量更大、同步性更高 的细胞，可采用膜洗脱法。该方浊所依据的原理是某些滤 膜可以吸附与该滤膜相反电荷的细胞。后图是目前常用的 HeIm8tetter—Cumm5n58膜洗脱法，其步骤是将非同步细 胞通过一个硝酸纤维素的微孔滤膜，这时细胞被平整地吸 附在滤膜上。将滤膜翻转置于滤器中，连续不断地缓缓加 入新鲜培养基，于是吸附在滤膜表面的细胞便生长分裂， 分裂后的一个子细胞仍然被吸附在膜上，而另一个子细胞 则随培养液洗脱下来。将收集液中刚刚分裂的子细胞进行 培养，可获得同步性较高的群体。如果滤膜的表面积很大， 那么只要被吸附的细胞分裂一次，就可以得到相当数量的 同步细胞。
生长和繁殖虽然概念不同，但却是两个紧密相 连的过程，很难截然分开，因此，单细胞微生物的 生长和繁殖需要有自己的术语。一般认为，微生物 通过新陈代谢将外界营养物质转化为自身细胞物质， 个体长大，质量增加，并进行必需的细胞结构的复 制和细胞分裂，这个过程称为微生物的个体生长； 单细胞微生物(或群体)通过分裂使群体数目或质量 增加的过程称为群体生长．对于多细胞微生物来说， 菌丝体的延长、分裂产生同类细胞的过程称为个体 生长；形成有性或无性孢子的过程称为繁殖，无性 或有性孢子萌发并通过菌丝断裂而使群体数目和质 量的增加称为群体生长。
lgN
• 微生物在有限封闭的体系内， 对数期一般不超过40代。
• 处在该期的细胞特征：生长 迅速、形态、生理、生化组 成较为一致，适合于用作研 究材料。在工业发酵中，也 需要取对数期细胞作种子， 以缩短发酵周期，提高设备 利用率。 T/h
稳定期
• 在对数期末，由于营养物质消耗， 有害代谢产物积累、pH、Eh变 化使生长速率下降、死亡率上升， 两者平衡时，就进入该期。 • 细胞特征：体积较小，开始积累 贮存物和次生代谢产物、芽胞细 菌开始形成芽胞。该期长短与菌 种特性、环境条件有关。在工业 生产中可通过补料、调温度、通 气等措施来延长稳定期。 T/h lgN
筛选法
筛选法又称淘析法，它主要依据为细菌 培养物中处于同一相的同步细胞，它们的体 积大致是相等的。筛选法种类很多，其中主 要的有过滤法、区带密度梯度离心法和膜洗 脱法等。
①过滤法
它是将培养物中的微生物细胞用滤器 过滤，让处于细胞周期较早阶段的小细胞 通过，收集这些细胞，转入新鲜培养基中, 即能获得同步细胞。
细胞通过生长，增大到一定体积后，在细 胞中间逐渐形成横隔，将细胞分裂为两个子细 胞。C14标记的二氨基庚二酸实验证明，细菌的 横隔是在杆菌的中央或球菌的赤道带上开始形 成的．粪链球菌细胞分裂过程中细胞壁和横隔 形成的过程包括以下几个步骤：
①新壁合成是在上一次分裂周期中形 成的赤道壁带上开始的。细胞壁物质从赤 道壁带处不断合成，新壁延伸，横隔开始 形成，将赤道壁带一分为二．间体附着在 横隔上，核物质已经开始分离。
在实验室中，常采用同步生长细胞研 究细胞周期。在各种微生物细胞中，细菌 芽孢和真菌孢子的萌发是高度同步的，这 是因为芽孢和孢于都处于休眠状态，各种 代谢活动都下降到最低水平，所以在供给 充分养料后，它们就从共同的起点开始生 长，也就是说绝大多数芽胞和孢子几乎都 在同一时刻萌芽。另外，如果将稳定期细 胞群体接种到新鲜培养基上，由于各个细 胞都是从“衰退”的生理状态下恢复过来， 所以几乎也是同步地进入生长阶段。
求对数，lgNt = n lg2 + lgN0 , 即
世 代 数：n = (lgNt - lgN0) / lg2 ( lg2 = 0.301 ) 世代时间：G = t / n = 0.301t / (lgNt - lgN0)
通过实验可测得 Nt, N0 , t 值，并可计算出G值。
• 各类微生物G值相差很大， 飘浮假单胞菌为9.8min，而 梅毒密螺旋体为33h。
①染色体复制开始时，染色体的特定 复制起点附着到细菌细胞膜上复制子部位 (复制区)，复制区含有与DNA复制有关的酶 类，它能启动DNA的复制并担负把复制后的 DNA分配到每一个子细胞中。
②复制叉位于复制子部位，复制时， 相邻的老复制子部位形成一个新的复制子， 断裂的一股DNA的自由端附着到新的复制 子上。通过染色体的运动，复制叉顺着染 色体前进，染色体进行复制。
革兰氏阴性杆菌细胞壁扩增时，新壁物 质分散插入老壁内。在细胞生长过程中，新 壁合成只引起细胞体积增加而不引起横隔形 成，但是当细胞进入分裂阶段，新壁在细胞 中央分裂位置向内插入形成横隔。分裂开始 时，细胞中央出现凹陷，细胞膜与横隔向内 生长，在细胞中心会合成完成一次分裂。
关于细胞膜的合成过程还不够了解，由 于膜是脂质和蛋白质组成的半流体结构，并 且处于活跃的代谢状态。所以利用特异性标 记抗体研究细胞膜的合成也没有什么成效。 但是已有一些证据说明大肠杆菌细胞膜的合 成位置限定在细胞的中心区并向两极延伸。
原核细胞的生长周期一般较 短，只有G1期（复制前期）、 R期（复制期）和D期（分裂 期），DNA复制一结束，便 立即进入细胞分裂。R期D期 长短较稳定， G1 期可变， 甚至无G1期。
G2 期
G1 期
S期
D期
G1 期
R期
一、同步生长
如果一个细胞群体中各个细胞部在同 一时间进行分裂，就可以说细胞在进行同 步分裂或同步生长，进行同步分裂的细胞 称为同步细胞．同步细胞群体在任何一时 刻部处在细胞用期的同一相，彼此间形态、 生理生化特征都很一致，因而是细胞学、 生理学和生物化学等研究的良好材料。
二、细菌细胞的表面生长和横 隔形成
细菌细胞周期中主要的细胞学变化是细胞 的表面生长．横隔形成、DNA复制分离并进 入子细胞和细胞分裂。
应用免疫学方法已成功地探明了微生物新 细胞壁的扩增部位。其方法是先将微生物细胞 壁成分制成特异性荧光抗体，然后再用这种荧 光抗体处理相应的微生物。处理后的细胞在洗 去末结合的荧光抗体后，置于新鲜培养基中继 续培养，不同时间取样，并用荧光显微镜观察 细胞壁上荧光的分布情况，其中细胞壁上带有 荧光的部位是原有的细胞壁(老壁)．而不带荧 光的部位则是新合成的细胞壁。实验结果表明， 一些微生物细胞壁的扩增方式是不同的。
③通过细胞膜在两个复制区之间的定位 合成，使复制区分离．随着膜的不断增长， 两个复制区位置也越来越远，附着于复制区 进行复制的子染色体也同时得到分离。
目前还不能肯定复制区是在DNA复制完 成后进行分离，还是像DNA复制时那样，在 复制开始时就分离，然后随着膜的增长两 复制区越离越远。不过就其结果来说，两 者是一样的。 大肠杆菌的染色体复制通常是双向的， 两个复制叉同时从同一起始点向反方向移 动。
诱导法
诱导法是利用一些生理学手段强制微 生物达到同步生长的目的．常用诱导法有 化学诱导法和物理诱导法两种。
①化学诱导
利用停止或限制供给微生物细胞分裂所必 需的某种养料，使所有细胞都进入临分裂状态 (但不分裂)，然后在某一时刻恢复供给细胞分裂 所必需的养分，就能诱导出同步细胞群体．例如 大肠杆菌胸腺嘧啶缺陷型菌株，当停止供给胸腺 嘧啶时，DNA合成立即终止，但RNA和蛋白质合成 速率却不受影响。30分钟后加入胸腺嘧啶，DNA 合成立即恢复，结果几乎所有细胞在经过35至40 分钟的延滞后都进行分裂。
lgN
1.延滞期2.对数期3.稳定期4.衰亡期
T/h
延滞期
• 处在该期的细胞特征： 个体变长，体积增大， 代 谢加 强 ，RNA含量 增 加，使细胞质噬碱性增 强；由于代谢活性的提 高，使贮存物消失。
• 该期长短取决于菌种遗 传性状、菌龄、接种前 后培养条件的差异等。
T/h lgN
对数期(指数期)
三、DNA复制和细胞分裂的协调
DNA携带了细胞全部遗传信息。细胞分 裂时，全部遗传信息也必须同步地加倍并 分配给子细胞，那么DNA复制怎样和细胞分 裂协调地进行呢? 1963年Jacob等根据Cairns对细菌染色 体环状结构的放射自显影结果的观察，提 出了称为复制子的假说。后经修正，较完 满地解释了细菌染色体的复制和分离，其 要点如下；
经过延滞期后的细胞进入对数生长期，此时细胞 生长旺盛，代谢活力强、分裂速度快，以几何级数增 加，代时稳定。以二分裂细菌为例，若在T0时总菌数 为N0，那么T1时总数为Nt 。 1 → 2 → 4 → 8 → … … …
20
→
2Baidu Nhomakorabea →
1代
22
2代
→
23 → … … … 2n
3代 … … … n代
Nt = N0 × 2n ,
然而用常规方法培养的细胞，即使是 上面所讲的同步细胞，在经过2至3个世代 之后，绝大多数细胞已是不同步了。这就 是说，明显的同步生长一股只能维持2至3 代．这是因为在同一培养条件下，各个细 胞发生分裂的时间各不相同，这种世代时 间的差异不是遗传性决定的,而是随机的。 目前常用的同步培养法有两种，即筛 选法和诱导法。
第二节 微生物的群体生长
一、微生物的繁殖速度与世代时间 二、养料的利用率 三、二峰曲线
一、微生物的繁殖速度与世代时间
• 繁殖速度：单位时间所 增加的细胞数或单位时 间内的世代数。 • 世代时间；细胞数目增 加一倍所需的时间。
• 生长曲线：以细菌的对 数为纵坐标，以时间为 横坐标，绘出的曲线。 可以分为4个时期。
②新细胞壁继续合成，间体发展 为两个，核物质分离。此时子细胞的 赤道壁带上开始出现下一个细胞周期 的标志——一个v字形凹痕。
③新壁逐渐延伸为横跨细胞的横 隔，从而完成一次分裂，产生两个子 细胞，同时又开始下一个细胞周期。
在整个细胞分裂周期中，间体依靠很纤细 的膜状柄与原生质膜相连，并始终参与新壁的 合成。新壁的生长与细胞壁上肽聚糖的限制性 裂解有关，不能自溶的类链球菌、大肠杆菌等 菌种的突变体，如果不加入溶菌酶就不能生长 和分裂。但是细菌也能够避免因扩增而破坏细 胞壁的完整性和稳定性。有人认为这是因为细 胞壁在扩增过程中，肽聚糖层中双糖链和短肽 链是逐步打开又逐步闭合的，因而在打开一层 之后，其他几层仍保持其结构和功能的完整性。