植物DNA提取方法
提取植物DNA方法
提取植物DNA方法植物DNA的提取方法是将植物细胞中的DNA分离出来，以便进行进一步的研究。
以下是常用的植物DNA提取方法：1. CTAB法：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种表面活性剂，可以溶解脂质，破坏细胞膜，从而释放DNA。
首先，将植物样品粉碎，加入CTAB缓冲液中并进行润湿，然后加入蛋白酶，破坏细胞膜。
接下来，加入CTAB-蛋白酶混合液，室温静置，使DNA与CTAB结合。
之后，将混合液经过苯酚-氯仿提取，将DNA从其他组分中分离出来。
最后，使用异丙醇沉淀法将DNA沉淀，洗涤并溶解。
2. 硅胶柱法：硅胶柱法适用于小规模提取和纯化植物DNA。
首先，将植物样品粉碎，加入提取缓冲液中，并加入蛋白酶进行细胞壁降解。
接下来，将溶有脂质的提取液加载到硅胶柱上，使用重力流动分离DNA。
然后，使用洗涤缓冲液去除残余的污染物。
最后，使用低盐缓冲液将DNA从硅胶柱上洗脱，并收集纯化的DNA。
3. 高盐法：高盐法适用于粗提植物DNA。
首先，将植物样品细碎，加入高盐缓冲液中，其中含有高浓度的盐和蛋白酶。
高盐浓度可以破坏细胞膜，并使DNA 从蛋白质中解离出来。
然后，使用异丙醇沉淀法将DNA沉淀，洗涤并溶解。
4. 快速提取法：快速提取法是一种高效和便捷的方式，适用于大规模提取植物DNA。
首先，将植物样品经过快速研磨处理，将DNA释放到提取缓冲液中。
然后，使用聚乙二醇或盐酸沉淀方法使DNA沉淀，然后洗涤并溶解。
这些方法在植物科学研究中被广泛使用。
在选择提取方法时，需要考虑样品量、样品类型、实验目的和所需纯度等因素。
植物DNA的提取方法的选择也可以根据实验室设备和研究经验进行调整，以获得满意的结果。
需要注意的是，植物样品在提取DNA之前需要进行适当的贮存和处理。
样品应在低温下保存，以保持DNA的完整性。
此外，处理样品时要避免污染和酶解，以确保提取的DNA质量。
植物dna提取方法
植物dna提取方法
植物DNA提取是从植物细胞中分离和纯化DNA的过程。
以下是一种常见的植物DNA提取方法，称为CTAB法（Cetyltrimethylammonium Bromide）：
1.材料准备：
(1)植物样品（叶片、根部、花粉等）
(2)CTAB缓冲液（含CTAB、EDTA、Tris-HCl、NaCl等成分）
(3)Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol 混合溶液
(4)高盐溶液（含NaCl）
2.样品研磨：将植物样品磨碎成细粉末状。
3.细胞破碎：将样品与CTAB缓冲液混合，加入适量的RNase，放
入65°C水浴中加热。
4.提取DNA：添加等体积的Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol混
合溶液，混合离心，将上清液转移到新的离心管中。
5.沉淀DNA：加入等体积的高盐溶液，混合后冷藏，待DNA沉淀。
6.洗涤：将上清液转移到新的离心管中，加入70%乙醇洗涤，离心，
将上清液倒掉，再次洗涤。
7.溶解：使用TE缓冲液溶解DNA，或直接使用水溶解。
8.质量检测：使用分光光度计或凝胶电泳等方法检测DNA的浓度
和质量。
以上步骤仅为一种常见的植物DNA提取方法，实际操作中可能根据实验目的、样品类型和实验室条件等进行适当的调整和优化。
植物总dna提取的原理及应用
植物总DNA提取的原理及应用1. 植物总DNA提取的原理植物总DNA提取是一种从植物细胞中分离纯化DNA的方法。
它是研究植物基因组的基础，对于植物遗传学和分子生物学的研究具有重要意义。
以下是植物总DNA提取的主要原理：1.细胞破碎：为了释放细胞内的DNA，需要先将植物细胞破碎。
这可以通过机械方法（如研磨）或化学方法（如细胞壁降解酶）来实现。
2.DNA溶解：破碎的细胞释放出来的DNA会与其他细胞组分（如蛋白质和RNA）结合在一起形成复杂的混合物。
在这一步骤中，可以通过加入特定的缓冲液和洗涤剂来溶解细胞组分，将DNA纯化。
3.酒精沉淀：为了将DNA从溶液中分离出来，可以通过加入高浓度的酒精，使DNA以固体形式沉淀。
4.洗涤和纯化：沉淀的DNA表面可能附着有其他颗粒物。
为了去除这些杂质，可以用酒精和洗涤剂进行多次洗涤和离心。
5.DNA溶解：最后，纯化的DNA溶于适当的溶液（如Tris-EDTA缓冲液），以便后续应用。
2. 植物总DNA提取的应用植物总DNA提取的成功应用于以下几个方面：2.1 植物基因组研究植物总DNA提取是进行植物基因组研究的基础。
通过提取植物总DNA，研究人员可以了解植物基因组的组成、结构和功能。
这对于理解植物的遗传特性、进化历史以及种间亲缘关系具有重要意义。
2.2 植物遗传改良植物总DNA提取技术可以帮助研究人员进行植物遗传改良。
通过提取植物总DNA，可以发现植物中的有用基因或性状相关基因，并进行基因定位和序列分析。
这为培育具有优良性状的新品种提供了基础。
2.3 植物种群遗传学研究植物总DNA提取可以用于研究植物种群的遗传结构和变异情况。
通过分析植物总DNA中的遗传标记（如微卫星和单核苷酸多态性），可以推断不同个体和种群之间的遗传关系、基因流和遗传多样性等重要参数，从而深入了解植物的遗传背景和进化过程。
2.4 植物病害诊断植物总DNA提取可以应用于植物病害的诊断。
通过提取植物总DNA，可以检测病原体的存在和种类，从而确定植物是否感染了某种病害，进而采取相应的病害防治措施。
植物叶片中DNA的提取
1. 植物叶子0.1- 0.2g, 剪碎置预冷研钵中
加入1mL提取缓冲 液，研磨成浆
2. 吸入1.5mLeppendorf 管中，摇动混匀
3. 60℃水浴保温30-60min
4. 10000rpm离心5min
5. 吸上清于新的离心管中，加入等体积氯仿，颠倒混匀
6. 再次10000rpm离心5min； 将上清小心吸入新的离心管中；
DNA样品在0.7% Agarose胶上电泳（例图）
实验注意事项
1. 微量移液枪的使用一定要规范，吸取氯仿 等有机试剂要注意不要将试剂吸入枪中； 2. 提取过程中的机械力可能使大分子 DNA 断 裂成小片段，所以为保证 DNA 的完整性， 各步操作均应较温和，避免剧烈震荡。
思考题:1.为什么构建DNA时, 一定要用大分 子DNA？ 2. 如何检测和保证DNA的质量？
实验一
植物叶片DNA的提取
DNA extraction
实验原理
• 利用基因组 DNA 较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子 DNA 分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤 维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状 沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发 生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温 和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证 , 否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行 RFLP 和 PCR 分析 , DNA 长度可短至 50kb ，在该长度以上，可保证酶切后产生 RFLP片段(20kb以下)，并可保证包含PCR所扩增的片段 (一般2kb以下)。 • 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离 方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立 相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子，尤其是组织中的多糖和酶 类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类 物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。
CTAB法提取植物DNA
清洗
• 将上清液再次离心，去除其中的杂质和蛋白质。 将得到的上清液转移到新的离心管中。
DNA的纯化与溶解
在上清液中加入等体积的异丙醇，混 匀后放置一段时间，使DNA沉淀下来。
将清洗后的DNA晾干，然后加入适量 的TE缓冲液溶解DNA。此时可以得到 高质量的植物DNA样品，可用于后续 的实验或保存备用。
利用ctab法提取的DNA进行遗传多样性 分析，有助于了解植物种群的遗传结构和 演化历程。
在植物育种中的应用
分子标记辅助育种
利用ctab法提取的DNA进行分子标 记辅助育种，能够快速准确地鉴定优 良基因型，提高育种效率。
转基因育种
通过ctab法提取的DNA可以用于构建 基因，为转基因育种提供重要的 基因资源。
DNA浓度测定
根据DNA溶液的吸光度值，计算DNA的浓度。
DNA完整性评估
通过电泳检测DNA片段的大小和完整性，评估DNA的质量。
04 ctab法提取植物DNA的 应用与展望
在植物遗传研究中的应用
基因定位
通过ctab法提取的DNA可用于基因定位 ，确定基因在染色体上的位置和功能。
VS
遗传多样性分析
实验过程中的安全注意事项
实验操作安全
在实验过程中，应遵循实验室安全规定，避免交 叉污染和意外事故的发生。
防护措施
佩戴实验服、手套、口罩等防护用品，确保实验 操作人员的安全。
化学品使用
正确使用和处理实验过程中涉及的化学试剂，避 免对实验操作人员造成伤害。
实验结果的判定与评估
DNA纯度检测
通过紫外分光光度计检测DNA溶液的A260/A280值，判断DNA 的纯度。
参考文献3
CTAB法提取植物DNA的步骤包括将植 物组织研磨成粉末，加入预热的缓冲 液和CTAB，混合均匀后进行离心，取 上清液加入乙醇沉淀，离心后取出 DNA进行洗涤和干燥。在提取过程中 需要注意避免交叉污染和样品间的混 淆。
植物DNA提取
⑷ 将上清液转入另一离心管中，向管中加入1/100体 积的 RNase A 溶液，置 37℃20-30min 。加入等体积 的氯仿/异戊醇，颠倒混匀，室温下，12000rpm离心 10分钟。（可以重复2~3次）
⑸ 将上清转入另一离心管中，加入 1 倍体积的异丙 醇或2倍体积的95%乙醇，混匀，室温下放置30分钟， 观察沉淀生成。 ⑹ 8000rpm离心10分钟，弃上清，将沉淀用70%乙 醇洗涤，吹干，溶于TE或去离子水中备用。
DNA浓度及纯度的测定 ：
用紫外分光光度计在230nm、260nm、 280nm下 的读数。
样品浓度（μg/mL）= OD260×稀释倍数×50
对于DNA纯制品，其OD260/OD280≈ 1.8， OD260/OD230应大于2。OD260/OD280 >1.8 说 明有RNA污染；OD260/OD280<1.8说明有蛋白 污染。
植物总 DNA 的提取是在破碎细胞时加入去污 剂等试剂使核蛋白体解析，然后或是使蛋白 质变性沉淀，抽提DNA，或是使DNA沉淀进 入固相而与液相中的蛋白质、多糖等杂质分 离。 RNA 的去除主要采用 RNase 消化，最后 用乙醇或异丙醇沉淀DNA。
二、植物总DNA提取传统方法概述
CTAB法
（3）氯仿：异戊醇＝24：1
注：CTAB有毒。
SDS法原理：
利用高浓度的 SDS ，在较高温度（ 55~65℃ ） 条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性， 释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度 的做法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心除去沉 淀后，上清液中的 DNA 用酚 / 氯仿抽提，反复
抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
的溶液离心和其它操作时不能在低温下进行。 转移 DNA 溶液用的枪头要剪去尖部，以避免对 DNA的机械损伤。 所得DNA沉淀应为白色或灰白色，若呈褐色则有 多酚物质污染。 吹干沉淀时，不能吹得太干，太干会使DNA断裂， 也可不采用真空抽干，将离心管置于通风柜或超 净工作台中令乙醇自然蒸干。
植物和动物的核酸dna和rna提取方法
提取植物和动物的核酸DNA和RNA是生物学研究中的重要步骤，它们可以帮助科学家们更深入地了解生物的遗传信息和基因表达。
本文将介绍植物和动物核酸DNA和RNA的提取方法，让读者对这一过程有一个清晰的认识。
一、植物核酸DNA提取方法1. 细胞破碎：需要将植物组织破碎，以释放细胞内的DNA。
这可以通过磨粉或切碎的方法来实现。
2. 细胞裂解：接下来，使用裂解缓冲液来裂解细胞膜和细胞壁，释放DNA分子。
裂解缓冲液的配方可以根据不同植物的特性进行调整。
3. 蛋白质沉淀：通过向裂解液中加入溴化苯酚等物质，可以沉淀掉大部分蛋白质，使得DNA分子得以分离。
4. 乙醇沉淀：将裂解液中的DNA用乙醇沉淀，这样可以将DNA分子从溶液中提取出来。
5. 溶解和纯化：将沉淀的DNA分子溶解在适当的缓冲液中，并进行进一步的纯化和浓缩处理，得到纯净的DNA溶液。
二、植物核酸RNA提取方法1. 细胞破碎：与DNA提取类似，首先需要将植物组织破碎，以释放细胞内的RNA。
2. 细胞裂解：使用特制的裂解缓冲液来裂解细胞膜和细胞壁，释放RNA分子。
不同植物组织的RNA特性可能有所不同，需要根据具体情况进行优化。
3. 蛋白酶处理：加入蛋白酶来降解蛋白质，使RNA得以更好地纯化。
4. 酚-氯仿提取：利用酚-氯仿混合液可以有效地将RNA从裂解液中提取出来，与DNA提取类似。
5. 洗涤和纯化：对得到的RNA进行洗涤和纯化处理，得到纯净的RNA溶液。
三、动物核酸DNA提取方法1. 组织裂解：将动物组织进行细胞破碎，释放细胞内的DNA。
2. 细胞裂解：使用特制的裂解缓冲液来裂解细胞膜，释放DNA分子。
对于硬质组织，可能需要较强的裂解条件。
3. 蛋白酶处理：加入蛋白酶来降解蛋白质，使DNA得以更好地纯化。
4. 酚-氯仿提取：利用酚-氯仿混合液可以有效地将DNA从裂解液中提取出来，与植物DNA提取类似。
5. 溶解和纯化：对得到的DNA进行溶解和纯化处理，得到纯净的DNA溶液。
植物中dna的提取方法
植物中dna的提取方法
1.取植物样品：从植物中选取新鲜的叶片、花、果实、根等样品，避免使用含有腐烂、干枯或受到污染的样品。
2. 切碎植物组织：用刀片或剪刀将植物材料切成小块，放入细碎的研钵中，加入液氮或干冰，迅速研磨碎成粉末状。
3. 加入提取缓冲液：将粉末状样品转移到离心管中，加入含有CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）的提取缓冲液，并加入蛋白酶K。
缓冲液的配方可以根据不同的植物种类和研究目的进行调整。
4. 热处理样品：将离心管放入水浴中，用80°C的温度加热30分钟，使细胞壁破裂，释放DNA。
5. 加入有机溶剂：将等体积的氯仿：异戊醇（24:1）加入样品中，充分混合后离心，分离出上清液。
6. 沉淀DNA：将上清液转移到装有冰冷乙醇的离心管中，缓慢倒入样品，轻轻摇晃后静置10分钟，将离心管放入高速离心机中离心10分钟，沉淀出DNA。
7. 溶解DNA：将沉淀的DNA用70%的乙醇洗涤，再用TE缓冲液（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0）将DNA溶解。
以上是一种常用的植物中DNA提取方法，可以根据实验需要进行调整和改进。
- 1 -。
植物提取dna的方法有哪些方法有哪些
植物提取dna的方法有哪些方法有哪些
植物提取DNA的方法有如下几种常见的方法：
1. CTAB法（Cetyltrimethylammonium bromide法）：这是一种常见的DNA 提取方法，利用CTAB和其他化学试剂来分离DNA。
2. 酚/氯仿提取法：通过酚和氯仿来提取DNA，可以有效地分离植物细胞中的DNA。
3. 细胞壁酶法：使用细胞壁酶来降解细胞壁，然后通过物理方法和化学方法提取DNA。
4. 硅胶柱法（Silica column法）：使用硅胶柱来吸附DNA，然后通过洗涤和洗脱的处理，得到纯净的DNA。
5. 盐法：通过高盐浓度和乙醇等试剂来沉淀DNA，然后经过洗涤和离心分离。
6. 磁珠法：使用具有磁性的珠子来吸附和纯化DNA，具有操作简便和高纯化度的优点。
除了以上提到的方法，还有一些其他的DNA提取方法，如酶解法、离心分离法等。
每种方法都有其特定的优缺点，适用于不同的样本和实验需求。
对于特定的
植物种类和实验目的，可根据需要选择最合适的DNA提取方法。
植物基因组dna的提取、扩增及电泳鉴定
从植物DNA中找到奥妙：提取、扩增与电泳鉴定植物基因组的研究是揭示植物遗传特性以及开展植物基础科学研究的重要手段。
在开展植物DNA研究前，需要实施植物基因组DNA的提取、扩增及电泳鉴定等步骤。
以下是生物科技领域的一些灵活和有趣的技巧，可以助您成功进行植物基因组研究。
一、提取植物基因组DNA1. 细胞破碎法植物组织通常蕴含大量的细胞壁，因此破碎细胞壁是提取植物基因组DNA的一个重要步骤。
通过粉碎植物组织，然后用试剂将细胞排出来即可提取发现植物DNA，从而用于后续步骤。
2. CTAB法这是一种常用的植物基因组DNA提取方法，包括使用CTAB（己基三甲基溴化铵）试剂破解细胞壁。
CTAB法需前期准备，但提取到的DNA质量均很高。
二、扩增植物基因组DNAPCR（聚合酶链反应）是一个非常有用的技术，可使选定DNA序列扩增成百万甚至更多的分子，使它们可用于植物基因组研究。
FBP（前向单一引物PCR）可以用于检测植物基因组单个位点的多态性，这可以用于检测种内个体之间的遗传差异。
三、植物基因组DNA电泳鉴定分子量相似的DNA分子可以通过电泳鉴定分离，因此，DNA电泳成为提纯DNA的主要方式，促进扩大研究样本大小范围的同时又允许研究DNA随时间变化的结果。
电泳是植物DNA研究中必不可少的步骤。
考虑到复杂的操作流程和数据分析过程，实施植物基因组研究的关键是建立一个可重复和可靠的实验流程。
尽管一些方法已经得到确定，但基础技术并没有发展完全需要依靠科研者们的努力和实践。
让我们一起研究植物DNA的提取、扩增及电泳鉴定，加深紧密的交流与学习，与令我们感到兴奋的植物DNA世界同在！。
7植物基因组DNA提取-CTAB法
1. 2% CTAB抽提缓冲液
CTAB 2g， NaCl 8.18g ， EDTA-Na2-2H2O 0.74g， 10ml 1mol/L Tris-HCl(pH8.0)， 先用 70ml ddH2O溶解, 再定容至100ml，灭菌, 冷却后 加入0.2% β-巯基乙醇0.2ml。
终浓度： CTAB 2%, NaCl 1.4mol/L（生理平衡 作用）, EDTA20mmol/L(螯合离子作用)，β-巯基 乙醇 100 mmol/L或PVP（聚乙烯吡咯烷酮 ）（降 低氧化酶类的活性，防止酚氧化成醌，有效去除 多酚。）
复习题（判断）
将DNA提取液65度温育20分钟，可以灭活DNase。 （）
在抽提过程中如果水相和有机层的界面不太清楚， 说明其中蛋白质含量较高，可增加氯仿/异戊醇 抽提的次数或适当延长离心的时间。（ ）
（二）获取程序及原理
1. 破壁破膜，释放染色体
利用液氮对植物组织进行研磨，破碎细胞；然后 加入CTAB缓冲液。
有效制备DNA时要考虑两个原则： 防止和抑制内源 DNase 对 DNA的降解； 尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。
在液氮冷冻条件下研磨破碎，保证材料在此过程 中DNase无法活动。
高等植物总DNA提取
—— CTAB法AB法
实验类型：验证型
一、实验目的与要求
掌握CTAB法抽提植物DNA的基本原理。 学习并掌握CTAB法抽提植物DNA的技术和方法。
二、实验原理
（一）植物细胞中DNA在哪里？怎样获得？
➢ 植物细胞中的DNA主要存在于细胞核内，称为 核DNA、染色体DNA、核基因组DNA，细胞质中 也有少量DNA，主要分布在线粒体、叶绿体内，称 为核外DNA。 ➢ 细胞内的各种DNA称为总DNA。 ➢ 程序：破壁破膜→去蛋白质→沉淀DNA
实验四 植物DNA的提取
实验四植物DNA的提取一、实验目的掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。
采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并进行纯度分析。
二、实验原理1、核酸提取的基本原理核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。
核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类，在真核细胞中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质及核仁里。
在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。
在浓氯化钠溶液(1～2 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液(0.14 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。
因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。
分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白的方法有3种：①用含异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。
用两倍体积的无水乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。
如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA。
②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA。
③用苯酚处理，然后离心分层，DNA溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内。
吸出上面水层，加两倍体积的无水乙醇溶液，得到白色纤维状DNA沉淀。
反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。
为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶处理。
生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖，在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。
在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：①化学因素，核酸的结构在pH值4.0～11.0间较稳定，pH值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。
植物DNA的提取的几种有效方法
植物ＤＮＡ的ＣＴＡＢ提取法：1 称取新鲜叶片2-3ｇ,剪碎放入研钵中,在液氮中研磨成粉末。
2 将粉末转移到的加有7ｍｌ经预热的1 5×ＣＴＡＢ提取缓冲液15ｍｌ离心管中,迅速混匀后置于65℃水浴中,温育30ｍｉｎ。
3 取出离心管,冷却至室温,加入氯仿/异戊醇(24:1),充分混匀,室温下2300×ｇ离心20ｍｉｎ。
4 将上清转移至另一新的15ｍｌ离心管中,加入1/10体积10%的ＣＴＡＢ和等体积的氯仿/异戊醇。
充分混匀,2300×ｇ离心20ｍｉｎ。
5 转移上清至另一新的15ｍｌ离心管中,加入等体积1%的ＣＴＡＢ沉淀缓冲液,轻轻摇晃至形成ＤＮＡ絮状沉淀。
1000×ｇ离心10ｍｉｎ,使ＤＮＡ沉淀于管底。
6 加入1 5-2ｍｌ的1ｍｏｌ/ＬＮａＣｌ及5μｌＲＮａｓｅ置于56℃水浴中过夜。
待ＤＮＡ完全溶解后,加2-3ｍｌ4℃预冷的95%的冰乙醇使ＤＮＡ沉淀,挑出ＤＮＡ,置于1 5ｍｌ离心管中,用70%乙醇清洗30ｍｉｎ,用离心机甩5ｓ,倒出70%乙醇,再用95%乙醇浸泡5ｍｉｎ,倒出95%乙醇,在超净工作台上吹干。
7 将风干的ＤＮＡ直接在4℃保存备用或溶于100μｌＴＥ溶液中于-20℃保存。
植物ＤＮＡ的ＳＤＳ提取法：1 取2-3ｇ新鲜叶片,在液氮中研磨成粉状(防止溶化)后转入15ｍｌ离心管中。
2 加入5ｍｌ于65℃预热的提取缓冲液,65℃水浴保温30ｍｉｎ(摇动数次),使提取液与样品充分混合。
3 加入2ｍｌ5ｍｏｌ/ＬＫＡｃ,剧烈振荡,冰浴保温20ｍｉｎ以上。
4 2700×ｇ离心20ｍｉｎ,将上清液倒入新的15ｍｌ离心管中,(若提取ＤＮＡ用于Ｓｏｕｔｈｅｒｎ等实验,一般在转移上清时加滤膜,防止样品残渣混入,可保证ＤＮＡ纯度)。
5 加入4ｍｌ氯仿/异戊醇(24∶1),摇匀,平衡,2700×ｇ离心15ｍｉｎ。
6 在另一新的15ｍｌ离心管中加入5ｍｌ预冷的异丙醇,将上清液用移液枪转入此管,在-20℃冷却30ｍｉｎ以上。
分子实验-植物DNA提取
0 1 实验原理
1、破壁：在液氮中对植物组织进行研磨，破碎细胞。并减少 研磨过程中各种酶类的作用。
2、溶解：CTAB离子型表面活性剂能溶解膜蛋白而破坏细胞膜， 使核蛋白解聚，从而使DNA游离出来。
3、分离：苯酚和氯仿等有机溶剂能使蛋白质变性，并使抽提 液分相，因核酸水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去 细胞碎片和大部分蛋白质。
三、主要仪器及耗材： 研钵及研钵棒、水浴锅、移液枪及配套枪头、2.0ml离心管、 离心机、 电子天平、通风橱、冰箱、电泳仪、 凝胶成像系统、超微量核酸蛋白测 定仪系统。
04
PART FORE
操作步骤
0 4 操作步骤
1.配置试剂： （1）10 ml 4% CTAB提取缓冲液
CTAB NaCl 1 M Tris- HCl(pH 8.0) 0.5 mol/L EDTA(pH 8. 0) ddH2O
(二)琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA:
1、将溶液加入样品槽时，勿划破或戳破加样孔，勿带入气泡; 2、使用干净的电泳溶液。
THANKS
心管，使之充分作用15 min。
0 4 操作步骤
10.重复第7步骤。 11.在上清液中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，轻柔颠倒，充分混匀，
室温放置 10min。 12.12 000 r/min 离心 5 min，弃上清，用70%的乙醇洗涤沉淀2次。 13.室温挥发乙醇5-10min，加入适量的ddH2O溶解。 14.电泳检测。取3 μL提取的植物总DNA，加入 1μL 6x Loading buffer，
0.4g 1.64g 20ml 0.8ml 7.2ml
（2）10ml 70%乙醇
无水乙醇
7ml
水
3ml
0 4 操作步骤
植物提取dna的方法
植物提取dna的方法
植物提取DNA的方法通常包括以下步骤：
1. 样品收集：选择新鲜的植物组织（如叶片、根部、种子等），避免使用死亡或腐烂的组织。
2. 组织破碎：将植物组织切碎或研磨，以释放DNA。
可以使用刀片、搅拌器、搅拌器研磨器等工具。
3. 细胞破裂：将组织样品置于研磨缓冲液中，并使用低温（如液氮）或高温（如加热至95C）进行热处理，破坏细胞壁以释放DNA。
4. 清理组织混合物：将组织破碎液通过滤纸等过滤，除掉固体残渣，获得纯净的液体样品。
5. 提取DNA：使用DNA提取试剂盒或自制的DNA提取缓冲液，根据试剂盒说明书或简单的化学反应步骤，将DNA从提取液中分离出来。
6. 纯化DNA：通过酒精沉淀、洗涤和干燥等步骤，去除可能存在的杂质和污染物，提高DNA的纯度和浓度。
7. DNA定量和质量检测：使用紫外吸收光度计或荧光探针等方法，测量提取得
到的DNA的浓度和纯度，确保其适合后续实验应用。
需要注意的是，不同植物物种的DNA提取方法可能存在差异，具体步骤和试剂使用可以根据研究目的和样品特点进行调整和优化。
同样，商业化的DNA提取试剂盒也提供了一种方便和快速的方法，避免了自制试剂的繁琐操作和优化步骤。
植物基因组DNA的提取
浴锅中保温60min；
④ 加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1），轻轻地颠 倒混匀，室温下12000rpm离心10min，移至上 清至新1.5mL EP管；（可重复④ ，抽提两次）
4、参考文献
[1] 钟卫鸿.基因工程技术实验指导[M].北京： 化学工业出版社，2007，7. [2] 王镜岩，朱圣庚，徐长法.生物化学教程[M]. 北京：高等教育出版社，2008，6. [3] 孙明.基因工程[M].北京:高等教育出版社， 2006，5. [4] 彭学贤.植物分子生物技术应用手册[M].北京 ：化学工业出版社，2006，2.
3、方法与步骤
①
②
在CTAB提取液中加入2% β-巯基乙醇，在65 ℃水浴锅中预热（CTAB需在65 ℃保温溶解 ，充分混匀后使用）； 取幼嫩的水稻叶子0.5g，洗净、吸干、剪碎 （冻存材料必须直接研磨，绝对不能化冻； 研磨后的粉末应在化冻前转移，否则内源性 DNase有可能降解）
3、方法与步骤
4、注意事项
CTAB在低于15 ℃时溶于沉淀，所以
使用之前要65 ℃时预热，用前再加 巯基乙醇或者加入亚精胺（100μL DNA加5μL 0.1M的亚精胺）； 在研磨前，研钵里不得有任何水分 ，否则加液氮时容易结冰； 在用不锈钢灭菌后的药匙移取粉末 时，可用枪头的大头移取；
4、注意事出离 心管时动作要轻缓，吸取上层溶液时所 用的枪头要减去下面尖端部分，吸取时 不要吸取中间的蛋白质层； 用70%的乙醇洗DNA后，要使乙醇完全 挥发，否则会对后续的PCR产生影响， 甚至对限制性酶作用产生非特异性；
实验一SDS法提取植物基因组DNA
实验一SDS法提取植物基因组DNA 一材料、试剂和仪器
1材料新鲜的组织材料或-80℃冻存的材料
2试剂
(1)提取缓冲液
Tris-HCl100mmol/L（pH8.0）
EDTA50mmol/L（pH8.0）
NaCl500mmol/L
灭菌后加β-巯基乙醇至10mmol/L
(2)裂解液20%SDS
(3)高盐溶液5mol/LKAc
(4)RNaseA10mg/ml
(5)异丙醇
(6)灭菌ddH2O或TE
3.仪器:离心机，恒温水浴,台式高速离心机，电泳装置
二实验程序
1、取幼嫩的组织材料1-2g,用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌
ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到加有500μL提取液的离心管中,轻轻混匀。
2、向管中加入50μL20%SDS溶液，混匀，不可过于强烈震荡以防基因组DNA断裂，65℃保温10min，并不时摇动。
3、加入150μL5mol/LKAc，混匀，置冰上20-30min。
4、4℃,15000rpm离心15min,转移上清到另一离心管中，加入0.7V的异丙醇，混匀，-20℃沉淀30min。
5、12000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀，吹干后加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。
6、加入1/10体积的RNaseA，37℃保温20min，除去RNA。
7、CI抽提后，加2V乙醇，-20℃沉淀30min。
12000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀。
8、用400μL70%乙醇洗一次后，吹干，加入适量的灭菌ddH2O 或TE溶解DNA。
9、电泳检测完整性。
植物基因组DNA提取步骤
植物基因组DNA提取实验操作步骤1取植物新鲜组织约100mg或干重组织约30mg，加入液氮充分研磨。
（植物细胞有细胞壁,液氮可以让细胞冷冻起来,变得很脆,这样容易破细胞壁。
同时,液氮的超低温可以大大降低酶活性,防止降解。
注：1、液氮的温度是-196℃，不要冻伤自己的手，带上手套。
2、用一个保温杯，大一点的，把液氮取出来放在保温杯里，盖上盖子。
3、然后用液氮将研磨棒和研钵预冷。
4、将样品快速放入研钵中，快速研磨，在液氮挥发完之前再加入液氮，一定不要让液氮挥发完或者样品呈现那种黏糊的状态，这样样品中DNA容易降解。
5、等到样品呈现细粉末状态了基本就可以了，用药勺把样品迅速舀到1.5ml 离心管里。
）2将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。
（水浴时间依实验具体情况而定，看样品裂解情况，具体看裂解液变得清澈透明为止）3加入700μL氯仿，充分混匀，12,000rpm（~13,400×g）离心5min。
注：若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可在第3步前，用酚：氯仿/1:1进行等体积抽提。
4小心的将上一步所得水层上相转入一个新的离心管中，加入700μL缓冲液GP2，充分混匀。
5将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000rpm（~13,400×g）离心30s，弃掉废液。
（吸附柱容积为700μL左右，可分次加入离心。
）6向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（~13,400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
7向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（~13,400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
植物DNA提取
7，倒掉乙醇，用枪头挑絮状DNA到管壁，将管底残余液取出
8，将管倒立于滤纸上烘干3min
9，加50-100μl无菌ddH2O溶解DNA.
试剂：
（1）DNA提取液：100 mmol/L Tris-HCl (Tris饱和酚）(pH 8.0) 15.764g
操ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ步骤
1，取银杏叶片0.5g-1.5g,加入3ml提取液（65°预热60min)研磨。研磨后转入10ml离心管；
2，取700μl至1.5ml离心管中，65°水浴30min，其间温和震荡离心管2-3次。
3，加入等体积氯仿，异戊醇（700μl），摇匀
4,10000r离心10min,分三层，取上清液
5，加800μl无水乙醇，得絮状DNA沉淀反复摇匀
(2)2100 mmol/L NaCl , 122.724g
(3)50 mmol/L EDTA（乙二胺四乙酸）, 14.6125g
（4）20g/L PVP , 20g/L CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）,
140 mmol/Lβ-ME (β-ME在使用前加) (65°预热60min再加入）
（2）氯仿：异戊醇(24:1),无水乙醇, 70%乙醇
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1.2实验方法
1.2.1 茶花基因组DNA的提取
采用CTAB法[8]提取DNA，所有试剂（有机溶剂除外）和器皿都经高压灭菌，主要步骤如下：
（1）取两片幼嫩新鲜叶片，置于预冷的研钵中，倒入适量液氮，迅速研磨成粉末状，随后加入3ml预热的2%CTAB抽提缓冲液和50ul抗氧化剂2-巯基乙醇，继续研磨成略有流动性的糊状或粥状，转入1.5ml的离心管中，于65℃水浴锅中保温约60min.
(2)待混合物冷却至室温后加入等600ul的CI（氯仿：异戊醇=24：1）溶液混匀，轻轻颠倒离心管几次使管内混合物成乳浊液，常温下10000rpm离心10min,取上清液转入另一干净的离心管中。
（3）重复步骤（2）一次。
（4）取步骤（3）上清液加入2.5倍体积无水乙醇，仔细混匀，-20冰箱30min以上，沉淀DNA
4℃，12000rpm离心10min.
(5)弃去上层有机溶剂，加500ul75%乙醇洗涤沉淀，4℃下8000rpm离心5min,弃去上清，洗涤沉淀3次。
（6）倒置或者37度培养箱烘干.
(7)加50ulTE缓冲液溶解DNA，于-20℃冷藏备用。
1.2.2 DNA含量和质量的测定
（1）紫外分光光度法：取4ml提取的DNA，将之稀释200倍，测定提取的DNA在260nm 和280nm处的吸光度值，得出OD260/280的值以及DNA和蛋白质浓度。
如蛋白质浓度过高，需纯化。
（2）琼脂糖凝胶电泳：配制1.0%琼脂糖凝胶，在0.5×TBE缓冲液中，电压5V/cm电泳约60min，溴化乙锭染色20min,在凝胶成像系统上观察并拍照。
1.2.3 PCR扩增
(1)PCR反应在Biometro PCR仪上进行，反应体系为25ul:ddH2O 14ul,10×Buffer
2.5ul,MgCl(25mM) 2.5ul,dNTPs(2.5mM) 2.0ul,primer(2.0uM) 1.0ul,DNA 2.7ul(约
40-60ng),Taq酶（5U/ul） 0.3ul.
ddH2O 13.7uL
10×buffer 2.5 uL
dNTPs 2.0 uL
MgCl2 2.5 uL
Primer 2.0 uL
DNA 2.7 uL (40-60ng)
Taq酶 0.3 uL
共25 uL
(2)反应程序为：94℃预变性3min;94℃变性30s,36℃退火1min,72℃延伸1min30s,40次循环；72℃最终延伸10min;4℃保存。
预变性94℃ 3 min
变性94℃30 s
退火36℃1min 40个循环
延伸72℃1min30s
继续延伸72℃10 min
保存4℃
1.2.4 PCR扩增产物检测
取扩增产物与6×loading buffer混匀，在1.3%的琼脂糖凝胶上电泳，缓冲液为0.5×TBE,电压5V/cm,电泳1.5-2h.经溴化乙锭染色20min后,取出凝胶在成像系统中拍照并保存结果。
1.3数据处理及RAPD分析
得出清晰，亮度较好的条带后，用laberworkers软件分析所得条带，在同一位点重复出现条带的记为“1”（包括弱带），不出现条带的记为“0”[9]，并分析扩增条带的长度。
将生成的数据输入电子表格，用NTSYSpc21软件分析得出据类图和遗传相似系数和遗传距离。
其中相似系数[10]为: s= [ 2M xy/(M x + M y ) ] ×100% (s表示相似系数,M xy 表示品种x、y 共有片段总和,M x 表示x 品种片段数,M y 表示y 品种片段数) ,遗传距离Ｄ＝１-Ｆ。
2 结果与分析
2.1 基因组DNA提取
提取的DNA经分光光度计测定，其OD260/280,DNA含量如下：
表2 基因组DNAOD260/280,DNA含量。
Table2 Results of DNA extraction from leaves of 15 Camellia samples
__________________________________________________________________
茶花品种 OD260/280 DNA含量ug/ml
Camellia species DNA content
_________________________________________________________________
杜鹃茶（Dujuancha） 1.85 0.708
凹脉（Ao′mai） 1.45 2.618
金丝玉蝶（Jinsiyudie） 1.43 1.282
连蕊茶（Lianruicha） 1.45 5.837
六角白(Liujiaobai) 1.81 1.094
玉美人（Yumeiren） 1.34 1.124
醉杨妃（Zuiyangfei） 1.43 1.807
凤仙(Fengxian) 1.35 1.537 酒中花（Jiuzhonghua） 1.33 1.165 孩儿面(Haiermian) 1.59 5.401 墨光镜（Moguangjing） 1.38 1.395 红露珍（Hongluzhen） 1.45 0.965
秋牡丹（Qiumudan） 1.41 2.792
公正评奖团 1.39 3.546
星上星(Xingshangxing) 1.32 0.857
------------------------------------------------------------------------------------------------------
基因组DNA OD260/280在1.32-1.85之间，符合RAPD扩增的要求。
附录2：所用试剂及配方
4% CTAB(十二烷基三甲基溴化胺) 称取10gCTAB，加水定容至250ml.
1mol/L EDTA（乙二胺四乙酸二钠）称取EDTA 37.224g，用NaOH(固体)调PH
至8.0,最后定容至100ml.
1mol/L Tris-HCl 称取12.114g Tris-HCl ，用80ml蒸馏水溶解，
加浓HCl ，最后定容至100ml.
4.2mol/L NaCl 称取NaCl 61.362g,定容至250ml
3mol/L NaAC 称取NaAC 4.824g，定容至100ml
Tris-HCl：54g
5×TBE 硼酸：27.5g 定容带1L
EDTA：10mol/L
4% CTAB：125ml
2% CTAB缓冲液1mol/L Tris-HCl: 25ml
4.2mol/L NaCl: 83.25ml
1mol/L EDTA: 5ml
TE缓冲液1mol/L Tris-HCl: 2.5ml
1mol/L EDTA: 0.25ml 定容至250ml 定容至250ml。