第六章外源目的基因表达和调控
真核细胞常见的表达载体及真核细胞表达外源基因的调控(精)
真核细胞常见表达载体1. pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2. pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1。
Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域：Ase1.pCMV…ccg cta gcg cta ccg gtc gcc acc atg- .EGFP…BamH1…SV40 poly A+Nhe1 Age13. pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
外源基因的导入和表达研究
外源基因的导入和表达研究随着生物技术的不断进步，人类利用基因工程技术已经可以人为地导入外源基因（即来自不同物种的基因）到特定的生物体中，并在其内部进行表达。
外源基因的导入和表达研究不仅在医学领域有重要的应用价值，而且可以用于植物和动物的育种、菌类的生产等多个领域，具有非常广泛的意义。
一、外源基因的导入方式外源基因的导入通常有三种方式：基因转染、基因克隆和基因突变。
其中基因转染是最常见的一种方法，其通过化学手段或物理手段将外源质粒导入到细胞内，使细胞内的染色体带有外源DNA序列，让生物体在遗传上发生变化。
基因克隆指的是利用重组DNA技术将外源基因插入到载体中，形成重组质粒，再将其导入到宿主细胞。
而基因突变指的是利用基因工程技术将目标基因的部分序列或全部序列进行基因剪切或点突变，从而在细胞内引入特定的改变。
二、外源基因的表达方式一旦外源基因成功地导入到宿主细胞后，就需要利用相应的机制使其被正确表达。
一般而言，外源基因的表达方式主要有两种：转录和翻译。
转录是指将某个基因的DNA序列转换成相应的mRNA序列，为后续的翻译打下基础。
而翻译则是将翻译RNA （tRNA）和核糖体结合，将mRNA的密码子转化成氨基酸序列，最终形成蛋白质。
在这个过程中，外源基因所编码的蛋白质需要能够正确地折叠和组装。
三、外源基因的应用外源基因的应用非常广泛。
在医学领域，外源基因的导入和表达技术已经成为了基因治疗的基础。
通过将正常的基因序列导入到受损或异常的细胞中，可以纠正基因缺陷，并且达到治疗某些遗传病的目的。
同时，外源基因导入技术也可以用于生产重组蛋白，如人类重组胰岛素、重组干扰素、重组免疫球蛋白等，这些蛋白对于多种疾病的治疗都有重要的作用。
在植物和动物育种领域，利用外源基因导入和表达技术也可以获得一些长期以来难以获得的农作物，如对抗虫害、抗病性更强的水稻、高营养价值的谷物等。
此外，外源基因导入技术还可以用于菌类的生产和制药领域。
基因表达调控(分组)
RNA聚合酶相互作用的蛋白质因子。其编码基因与作用的靶 DNA序列不在同一DNA分子上
（基因调节蛋白）
RNA聚合酶和 通用转录因子
（基因调节蛋白）
（二）反式作用因子 1. 转录调节因子分类（按功能特性）
* 通用转录因子(general transcription factors)
•
（《自然》（Nature））
发展历史
• 起于上世纪40-50年代,法国巴斯德研究院的Andre Lwoff等人 • 1950年 Monod等发现,在培养基中加入乳糖可启动E.coli的β-半乳 糖苷酶的从头合成,极大提高该酶活性 • 1961年, F.Jacob和J.monod 首先提出原核生物基因表达的操纵子 学说 • 1966年,Walter Gilbert和Benno Muller-Hill证明了阻遏蛋白的存在 • 1970年,Mark Ptashne和Gilbert详尽的阐述了基因阻遏机制 • 1975年，Roy Britten和Eric Davison在操纵子学说的基础上提出 了真核生物基因的表达调控模式 • 1981年，Charles Yanofsky等发现色氨酸操纵子的转录衰减与基 因特异性序列有关 • 很多原核、真核基因的顺式作用元件陆续被鉴定 • DNA-蛋白质相互作用分析成为基因表达调控的热门课题
Structure of the enhancer of SV40
增强子（enhancer)：是使启动子的基因转录效率显着提高(增强转录
活性)的一类顺式作用元件，其本身不具有启动子活性，是由多个独
立的、具有特征性的核苷酸序列所组成。
RNA剪接信号 :内含子序列
目的基因导入受体细胞
（6）利用遗传选择标记筛 选哺乳动物转基因细胞
• 在植物转基因研究中采用的氯霉素乙酰转移 酶(Cat)基因和新霉素磷酸转移酶(NptⅡ)基 因也可用于哺乳动物转基因细胞的筛选。
• 常用的标记基因还有： • -- 胸腺核苷激酶基因（tk）、 • -- 二氢叶酸还原酶基因（dhfr） • -- 次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因
斑点杂交法
狭缝式点样器
斑点及狭缝印迹杂交的特点
1、斑点印迹为圆形 2、狭缝印迹为线状 3、鉴别DNA、RNA 4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品 5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量
4、菌落（或噬菌斑）原位杂交
基本原理 直接把菌落和噬菌斑转移到滤膜上 溶菌、变性 DNA暴露并于滤膜原位结合
第六章 目的基因导入受体细胞
第三节 重组子的筛选
在重组DNA分子的转化、转染或转导过程 中，一般仅有少数受体细胞成为克隆子。必 须采用合适的方法从大量的细胞背景中筛选 出期待的克隆子。
• 概念
–克隆子 –转化子 –重组子
将摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维持的 受体细胞统称为克隆子。
把采用各种转化方法或转导方法获得的克隆子叫做转化 子（导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为 转化子 ），现在这两者有通用的趋向。
含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子，如果重组 子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重组 子。
经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得 所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选。
一、遗传表型直接筛选法
• （一）根据载体选择标记初步筛选转化子
• 在构建基因工程载体系统时，通常在载体DNA分 子中组装了一种或两种选择标记基因，在受体细 胞内进行表达，呈现出特殊的表型或遗传学特性， 作为筛选转化子的依据。
外源基因的表达
•Ⅱ型启动子
Ⅱ型启动子所属基因绝大多数编码蛋白质。
转录起始位点
TATA框（Hogness框）：富含AT的保守序列区，它 启动子 与DNA双链的解链有关，并决定转录起始点的选择。 基本区 其中心点位于转录起始点上游－20～－30bp的位置。 CAAT框：位于转录起始位点上游－75bp处，与RNA 聚合酶的结合有关。 GC框：位于转录起始位点上游－100～－300bp处， 与转录因子的结合有关。
s factor:
6.2.1.4 启动子的分离
随机克隆法 聚合酶保护法 过滤膜结合法 PCR扩增法
6.2.2 增强子
增强子（enhancer）：是能够增强启动子转录活性的DNA 顺式作用序列，又称强化子。 增强子的特性：
双向性。
重复序列。 增强子行使功能与所处的位置无关。
特异性。
增强子不仅与同源基因相连时有调控功能，与异 源基因相连时也有功能。
序列特异性
*启动子的特征 方向性 位置特性 种属特异性
6.2.1.1 原核生物的启动子
•转录起始位点：大多数细菌启动子转录起始区的序列为 CAT，转录从第二个碱基开始，该碱基为嘌呤碱基 （A/G）。 •Pribnow框： －10bp处的TATA区，又称－10序列区。 •Sextama框： －35bp处的TTGACA区，又称－35区。 •间隔区：内部无明显的保守性，其序列的碱基组成对启 动子的功能不十分重要，但其长度却是影响启动子功能的 重要因素。
6.1.3 外源基因mRNA的有效翻译
外源基因mRNA有效翻译必须考虑的基本原则：
AUG(ATG)是首选的起始密码子。
SD序列为与核糖体16S rRNA互补结合的位点，该序 列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基。
外源基因的表达
小节
外源基因的转录系统
蛋白质的翻译系统
基因表达载体
复制子 选择标记
*
4.3.1 重组异源蛋白在大肠杆菌中不稳定的原因
4.3 宿主菌
1
大肠杆菌缺乏复杂的翻译后加工和蛋白质折叠系统
2
大肠杆菌不具备类似真核细胞的亚细胞结构和表达产物稳定因子。
3
大量的异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度的微环境，导致蛋白质分子之间的作用增强。
*
终止子
2.4 衰减子 转录终止的位置 分为本征终止子和依赖终止信号的终止子两类。 调节转录的起始和终止. Trp操纵子
1
2
第三节 外源基因表达系统
3.1 定义 外源基因表达系统：泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物（目的蛋白）。
*
3.2 种类
*
起始密码子是翻译的起始位点，通常为AUG（ATG），编码甲硫氨酸（MET），是首选的起始密码子。 GUG、UUG：有极少数生物利用。
翻译起始密码子
③翻译终止密码子
翻译终止密码子：能使核糖体从mRNA模板上脱落下来，终止蛋白质的翻译过程。 在大肠杆菌中，新合成的多肽链的释放由RF1和RF2两个释放因子所调控。 RF1识别终止密码UAA和UAG， RF2识别终止密码UAA和UGA 由于UAA同时为两个释放因子所识别，一般被选作翻译的终止密码。 通常将几个终止密码串连在一起，以保证翻译的有效终止。
启动子和终止子：因宿主的不同而有差别，往往在不同的宿主中表达的效率也不一样，特别是原核生物和真核生物宿主间完全不同，相互间不能通用。
1
2
*
①启动子
外源目的基因转录的起始是基因表达的关键步骤。
6.目的基因的表达
IPTG
mRNA
Tac 表达系统
tac 启动子是由 trp 的 –35 序列和 lacUV5 的 –10 序列 拼接而成的杂合启动子。 拼接而成的杂合启动子。
启动子 P lac P trp P tac -35 区序列 TTTACA TTGACA TTGACA -10 区序列 TATAAT T TAA C T TATAAT
成一个操纵子 – 操纵子—原核生物转录单位
– 启动序列决定转录活性大小 – 操纵序列是阻遏蛋白的结合位点 • 负性调节 为主 • 正性调节 • 真核生物： 真核生物： • 顺式作用元件（cis-acting element）-顺式作用元件（ ） 指可影响自身基因表达活性的DNA序列。 自身基因表达活性的 序列。 指可影响自身基因表达活性的 序列 – 非编码序列 – 启动子 – 调控元件 位于远端调控区的顺式作用元 调控元件: 增强子,沉默子 件(增强子 沉默子 增强子 沉默子)
发热量低、需氧低、 发热量低、需氧低、适当的发酵温 度和细胞形态； 度和细胞形态； 容易进行代谢调控； 容易进行代谢调控； 容易进行DNA重组技术操作； 容易进行DNA重组技术操作； DNA重组技术操作 产物的产量、产率高， 产物的产量、产率高， 产物容易提取纯化。 产物容易提取纯化。
宿主细胞分为两大类： 宿主细胞分为两大类： 第一类为原核细胞： 第一类为原核细胞：常用有大肠杆 菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 第二类为真核细胞：常用有酵母、 第二类为真核细胞：常用有酵母、 丝状真菌、哺乳动物细胞等。 丝状真菌、哺乳动物细胞等。
Lac 表达系统 负调节因子 lac I 表达系统:
在无诱导物情形下， lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白， 与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。
基因工程复习资料
基因工程复习资料第一章核酸的制备1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表2.基因工程的概念：基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
第二章基因工程工具酶1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。
2.限制性内切核酸酶：定义：限制性内切核酸酶是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列（识别序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
命名：限制性内切核酸酶一般是以第一次提取到这类酶的生物的属名的第一个字母和种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。
如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示。
并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。
3.DNA连接酶：定义：DNA连接酶也称DNA黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接DNA链3‘-OH末端和，另一DNA链的5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链的一种酶。
种类：大肠杆菌DNA连接酶、T4DNA连接酶、TscDNA连接酶、真核生物细胞发现的连接酶，如酶Ⅰ、酶Ⅱ、酶Ⅲ等多种类型。
4.DNA片段的连接方法：①具互补黏性末端DNA片段之间的连接：可用E?coli DNA连接酶，也可用T4 DNA连接酶。
②具平末端DNA片段之间的连接：只能用T4 DNA连接酶，并且必须增加酶的用量。
③DNA片段末端修饰后进行连接：DNA片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；DNA片段5′端脱磷酸化后进行连接；DNA片段加连杆或衔接头后连接。
5.DNA聚合酶：①定义：DNA聚合酶是指以DNA单链为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，催化合成一条与模板链序列互补的DNA新链的酶。
第六章I 目的基因与载体的连接解读
1
一.基因重组—基因工程的核心
1、 外源DNA片段同载体分子连接的方法，即 DNA分子体外重组技术，主要是依赖于限制 性核酸内切酶和DNA连接酶的作用. 基因重组: 就是利用 限制性内切酶及其他一 些酶类，切割和修饰载体DNA和目的基 因．将两者连接起来，将目的基因插入于可 以自我复制的载体内，再转入受体细胞，以 期这种外源性的目的基因在受体细胞内得到 扩增或正确表达。
屈艾制作 27
徐师大屈艾老师制作
（五）加DNA衔接物连接法
DNA衔接物也是人工合成的一小段双链寡 核苷酸，与人工接头不同的是一头为平整 末端（与双链目的DNA平端连接），另一 头带有某种限制酶的粘性末端（与载体的 相应粘端连接）。它在与双链目的DNA连 接后无需限制酶消化，便可与去磷酸化载 体DNA进行连接反应，如图所示。
③ 平端加上人工合成接头：合成接头是 自相互补的两个化学合成的寡核苷酸的 等摩尔混合物，而两个寡聚体可形成带 一个或多个限制性酶切位点的平端双链 体。因此在平端DNA加接头可为其亚克 隆操作增加一个或多个限制性酶切位点。
屈艾制作 10
三．基因与载体的连接(5种方法)
载体DNA和目的基因DNA的连接,按 DNA片段末端性质不同，可有下述不同的 连接方法： ① 粘性末端连接法 ② 平端连接法 ③ 同聚物加尾连接法 ④ 人工接头连接法 ⑤ 加衔接物连接法
报告基因
5’
3’
5
二、连接前的处理
为了将目的基因重组于载体分子之中，需要将载 体DNA和目的基因分别进行适当处理，使其可以互相 连接，形成新的重组分子。 1.对载体的要求： 一般采用限制性内切酶法将载体DNA分子切割成可 与外源基因连接的线性分子.载体DNA通常有着许多 酶切位点．但是并不是所有的酶切位点都可用于重 组切割，理想的酶切位点应该符合下列几个条件: 1） 位于载体上特定的酶切位点要尽可能少,最好 是单一酶切位点,这样才能保证目的基因和载体DNA 以最高的几率正确组合.
大学《基因工程学》教学大纲
《基因工程学》课程教学大纲（Genetic Engineering）一、课程说明课程编码：02200200课程总学时（理论总学时/实践总学时）：48（48/0）周学时（理论学时/实践学时）：4（4/0）学分：31．课程性质：专业必修课。
2．适用专业与学时分配：适用生物技术专业。
教学内容与学时分配3．课程教学目的与要求：本课程的授课对象是生物技术专业的本科生。
课程简介：《基因工程》是生物技术专业的专业必修课程。
其以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段而建立起来的一门技术学科。
基因工程兴起于20世纪70年代初，它的问世带动了生物技术的兴起和发展，是现代生物技术的核心内容。
基因工程课程的主要内容包括基因的分离、基因的克隆、基因的表达、植物基因工程、动物基因工程、药物基因工程和基因治疗等。
它是生命科学学院生物技术专业本科生的主干专业课程之一，它是生物工程（包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程）中最重要的课程，其它三大工程是建立在基因工程基础之上的，同时也为生物技术制药等后继学科奠定了重要的理论基础。
课程目标：设置本课程是为了让生物技术专业的学生理解和掌握基因工程的技术原理，通过本课程学习，掌握基因操作的工具酶，基因克隆常用载体，目的基因的分离与合成，重组体的构建，重组体向宿主细胞的导入，重组体克隆的筛选与鉴定以及克隆基因的表达，同时了解基因工程在生物学领域中的应用与发展前景。
对学生达到毕业要求贡献如下：1）了解基因工程学的历史、发展和前沿知识。
2）掌握基因工程学的基础理论、基本知识和基本技能；教学要求：学完基因工程学后，学生将具备以下能力：1）具有良好的自学能力；2）综合运用所掌握的基因工程学理论知识和技能、从事生物科学及其相关领域科学研究的能力。
4．本门课程与其它课程关系：先修课程为生物化学、微生物学、分子生物学、细胞学等，具备基础理论知识及实验能力是基因工程学课程的基础。
(参考)基因工程 第六章 DNA重组的操作
(三) 酶联免疫吸附测定（ELISA） Enzyme-linked immunosorbant assay 1. 原理：
一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。
2. 酶联（enzyme-link）： 二抗上携带一种酶能催 化无色底物转变为有色的物质（或发光），再通 过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而
其中载体介导的转化方法是目前植物基因工程中使用最多、 机制最清楚、技术最成熟的一种转化方法，而转化载体中 又以Ti质粒转化载体最为重要。
26
（三）重组DNA导入动物细胞
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 磷酸钙沉淀法 脂质体介导感染法 显微注射法 病毒感染法 DEAE葡聚糖转染技术 电击法 血影细胞介导法
为了克服以上弊端，目前对平末端连接常采用同 聚物加尾法、衔接物连接法和DNA接头连接法等改 进方法。
9
三、PCR产物的连接
PCR扩增是获得目的基因的重要途径 PCR产物的连接是基因工程实验中经常性的工作， 其主要方法有：
引入酶切位点克隆法、T-A克隆法和平末端克隆法等
10
（一）引入酶切位点连接法
21
电转化的原理图（引自孙明，2006）
22
（二）感染 将以λ噬菌体DNA为载体的DNA重组分子包装成病毒 颗粒，使其感染受体菌的过程称为感染，由噬菌体 和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导 （transduction）
23
二、重组DNA导入真核细胞的方法
常用的方法有电击法、磷酸钙沉淀法、脂质体 介导法等； 进入细胞的DNA可以被整合至宿主细胞的基 因组中，也可以在染色体外存在和表达。
基因工程原理智慧树知到课后章节答案2023年下宁波大学
基因工程原理智慧树知到课后章节答案2023年下宁波大学宁波大学第一章测试1.从广义上来说，转基因生物可以是基因的“转入”，也可以是基因的“转出”。
（）A:对 B:错答案:对2.基因工程技术诞生的标志通常认为是（）。
A:第一个基因工程药物，生长激素抑制素，的成功生产和上市。
B:限制性核酸内切酶的发现。
C:Berg教授首次成功构建SV40和DNA的重组分子。
D:Cohen教授第一次获得既抗卡那霉素又抗四环素的双重抗性特性的大肠杆菌转化子菌落。
答案:Cohen教授第一次获得既抗卡那霉素又抗四环素的双重抗性特性的大肠杆菌转化子菌落。
3.辨别转基因作物应该根据它们的（）。
A:形状B:颜色C:转入基因所展现的性状D:产量答案:转入基因所展现的性状4.基因工程技术的诞生得益于技术上的几大发明，它们包括：（）。
A:限制性核酸内切酶、DNA连接酶等工具酶的发现。
B:逆转录酶的发现。
C:胚胎干细胞技术的发展。
D:载体DNA分子的获得。
答案:限制性核酸内切酶、DNA连接酶等工具酶的发现。
;逆转录酶的发现。
;载体DNA分子的获得。
5.基因工程的基本流程包括为（）。
A:外源目的基因的表达。
B:重组DNA分子导入受体细胞以及阳性克隆的筛选。
C:核酸分子杂交和DNA测序。
D:目的基因的分离、获取以及重组载体的构建。
答案:外源目的基因的表达。
;重组DNA分子导入受体细胞以及阳性克隆的筛选。
;目的基因的分离、获取以及重组载体的构建。
第二章测试1.基因是遗传的基本单位、突变单位和控制性状的功能单位，是DNA分子中一段编码蛋白质的核苷酸序列。
（）A:对 B:错答案:错2.结构基因转录区的基本结构组成依次为（）。
A:启动子、ORF和3‘-UTR。
B:启动子、5’-UTR和ORF。
C:5’-UTR、ORF和3‘-UTR。
D:启动子、上游启动元件和增强子。
答案:5’-UTR、ORF和3‘-UTR。
3.原核生物的终止子为（）。
A:寡聚U形成的发夹结构。
第六章 目的基因获取和DNA重组
DNA片段的组装连接方法有2种：
第一种方法：粘末端连接法
第 二 种 方 法二、 基因法获取目的基因即直接从基因中生物基因组所程
第一节 目的基因的获得
获得目的基因的方法：主要有4种 1
一、基因合成技术
基因合成，指利用4种单体脱氧核糖核苷酸 (Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ），通过化学反应，合成出一 条与已知基因序列完全相同的DNA链。
对不参加反应的集团加保护基
◆合成过程使用的保护基团，有些可以通过酸处理 移去，有的可通过碱处理移去。所以不论是5′端 的保护基团、还是3′端的保护基团，都可以通过 酸或碱的脱保护，消除掉保护集团。这样的一个 带有5′端保护的合成的二核苷酸分子，又可以同 下一个带3′端保护的单核苷酸或二核苷酸进行第 二次缩合反应，形成一个三核苷酸或四核苷酸分 子，这种从缩合反应开始，到保护基团消除，进 而再进行新的缩合反应的循环周期库是一项十分繁重的工作，一般的 基因工程实验室都难以完成此亿碱基对，即3×106kb. (2)常用的克隆载体质粒、λ噬菌体和COS质粒克隆外 源DNA的能力分别为15kb、25kb和45kb. （3）选取克隆能力最大的COS质粒载体，则需要构建 至少6.8万个克隆才可能包含整个人的基因组DNA
（2）mRNA的纯化和完整性鉴定
在典型的哺乳动物细胞中含有10000～30000种不同的 mRNA序列，但并不是任一基因的mRNA在每一细胞中都有同样 的转录数量，在特定的mRNA分子集群中，有些基因的mRNA数 量很高，而另一些基因的mRNA数量却很低，例如编码像珠蛋 白、免疫球蛋白质和卵清蛋白的mRNA，占特定类型的分化细 胞总mRNA的50%～90%，属高丰度mRNA，而相当数量的其它基 因mRNA的含量在细胞总mRNA中少于0.5%，属低丰度mRNA或稀 有mRNA。 对高丰度mRNA来讲，其所对应的A之前不需要进一步纯化和富集。但对低丰度mRNA的分离 则需要采用特殊是脱氧核糖核苷三磷酸为合成原材料。
外源基因在大肠杆菌中的表达调控
• 第一节 基因表达的概述和基本条件 • 第二节 在大肠杆菌中影响外源基因 表达的因素
第一节
基因表达的概述和 基本条件
• 一、基因表达的基本概念 • 二、基因表达的基本条件 • 三、真核基因在原核细胞中表达及调控
第二节 在大肠杆菌中影响 外源基因表达的因素
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
一、基因表达的基本概念
生物体的遗传信息都是以核苷酸序列 编码的形式储存在遗传物质DNA上, 基因 表达是目的基因DNA在导入的细胞内转 录成mRNA, 再以mRNA指导翻译成蛋白 质。基因的表达依赖于有效的转录和 mRNA的正确翻译以及翻译后的加工处 理等各个环节的调节作用，其中转录最 为关键，原核的基因表达过程和方式与 真核细胞有显著不同。
Tac启动子
• Tac启动子是由Trp启动子和Lac启动子构 建而成的杂合启动子，-35区为Trp启动子 顺序，-10为LacUV5启动子顺序，二者之 间距离为16bp者为pTrc，17bp者为pTac。 该启动子只需用IPTG诱导转录即可。如 图6-7
噬菌体的PL和PR启动子
• PL为λφ左向启动区，PR为右向转录启动 区，与CI阻遏蛋白结合，可抑制OL或OR 转录，但CI在42℃诱导转录（如图6-8）。
RNA聚合酶
• 原核细胞只有一种RNA聚合酶，当其核 心酶与σ因子结合，形成全酶后，才能识 别DNA上的启动子进行转录。
启动子的概念
• 启动子是位于结构基因上游，转录起始 调控所必需的一段DNA序列，内含-35区 （与σ因子结合）和-10区（和核心酶结 合）的保守序列。当启动子与全酶结合 后可在+1转录起始点开始转录，如图6-1。
• 转录的弱化作用使转录没有到达终止信 号处而中途停止转录，使mRNA转录发 生部分停止，而不是发生全部停止。
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质粒拷贝数
(一)大肠杆菌基因表达载体
R
－35 －10
SD
编码序列
TT Tcr Ori
启动子
起始密码子
AUG、GUG、UUG
终止密码子
UAAU、UGA、UAG
大肠杆菌基因表达系统的表达载体一般是质粒表达载体， 含有大肠杆菌内源质粒复制起始位点和有关序列组成的能在大 肠杆菌中有效复制的复制子。
启动子
第一节 外源基因表达机制
一、外源基因的起始转录
外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤。选 择可调控的启动子和相关的调控序列，是构建一 个表达系统首先要考虑的问题。
理想的可调控的启动子在细胞生长的初期不表 达或低水平表达，当细胞增殖达到一定的密度后， 在某种特定诱导因子的诱导下，RNA聚合酶开始 启动转录，合成mRNA。
Lac 表达系统
负调节因子 lac I 在无诱导物情形下， lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动 子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。
RNA
聚合酶
lacI
Plac
lacO
本底水平转录
lacZ lacY lacA
RNA
聚合酶
lacI
Plac
lacO
高效转录
lacZ lacY lacA
IPTG
三、外源基因mRNA的有效翻译
外源基因在原核生物中的有效翻译需要考虑：
1. AUG(ATG)是首选的密码子； 2. SD序列为与核糖体16S rRNA互补结合的位 点，该序列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基； 3. SD序列与翻译起始密码子之间的距离为3~9 个碱基； 4. 在翻译起始区的周围的序列不易形成明显的 二级结构。
第六章 外源目的基因表达与调控
生物体的遗传信息都是以核苷酸序列编 码的形式储存在遗传物质DNA上, 基因表达 是 目 的 基 因 DNA 在 导 入 的 细 胞 内 转 录 成 mRNA, 再以mRNA指导翻译成蛋白质。基 因 的 表 达 依 赖 于 有 效 的 转 录 和 mRNA 的 正 确翻译以及翻译后的加工处理等各个环节 的调节作用，其中转录最为关键，原核的 基因表达过程和方式与真核细胞有显著不 同。
二、mRNA的延伸与稳定性
外源基因起始转录后，保持mRNA的有效延伸、 终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键。
为了防止mRNA在转录过程中的非特异性终止， ห้องสมุดไป่ตู้以在构建表达载体时加入抗终止的序列元件。
在表达载体中加入正常转录终止序列，可以防 止产生不必要的转录产物，使mRNA的长度限制 在一定的范围内，增加外源基因表达的稳定性。
目的基因沉默是在核酸水平上DNA与DNA、 DNA与RNA、RNA与RNA相互作用的结果。重 复序列或同源序列是基因沉默的普遍原因之一， 在构建表达载体时，应尽可能避免与内源序列有 较高的同源性。
第二节 基因表达的调控元件
一、启动子
启动子是一段提供RNA聚合酶识别和结合的 DNA序列，一般位于表达基因的上游。
外源基因在受体细胞中的表达包括转录和翻译 两个重要环节。
基因的转录是在RNA聚合酶的作用下合成 mRNA，原核生物mRNA一般不需要转录后加工。
真核生物mRNA在细胞内合成，且需要经过一 繁殖加工过程：RNA剪接、5′端加帽、 3′端加上 poly(A)尾巴。
原核生物一般没有翻译后加工，真核生物有较 复杂的翻译后加工。
终止子
外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即 RNA 聚合
酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的 DNA 序列，形成长短不一的
mRNA 混合物过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原
因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子 mRNA 所需的时间就相应增加，
外源基因本身的转录效率下降； 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或 DNA功能区域，如
第一, 必须是强启动子，能够克隆基因的蛋白 质产物的表达量占细胞总蛋白的10%-30%以上
第二, 这个启动子应能呈现出一种低限的基础转 录水平，因为在表达毒性蛋白质或是有损于寄主 细胞生长的蛋白质的情况下，使用高度抑制型的 启动子是一种极为重要的条件
第三, 这种启动子应是诱导型的，能通过简单 的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。
1.序列特异性。在启动子的DNA序列中，通常 含有几个保守的序列框。
2.方向性。启动子是一种有方向性的顺式调控 元件。
3.位置特性。一般启动子只能启动其下游基因 的转录。
4.种属特异性。
二、增强子
增强子是能够增强启动子转录活性的DNA顺式作 用序列。
1.双向性。正反两个方向调节活性。 2.重复序列。增强子一般含有能独立行使功能 的重复序列。 3.功能与位置无关。 4.特异性。组织特异性，或在特定细胞阶段。 5.对异源基因也有调节功能。
大肠杆菌细胞中结构不同的 mRNA分子具有不同的翻译效率，它 们之间的差别有时可高达数百倍。
mRNA 翻译的起始效率主要由其 5’ 端的结构序列所决定，称为核 糖体结合位点（RBS）。
大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素： 位于翻译起始密码子上游的 6–8 个核苷酸序列 5’ UAAGGAGG 3’ 即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚 基中的 16S rRNA 3’ 端区域 3’ AUUCCUCC 5’ 并与之专一性结合 将mRNA 定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以 AUG作为阅读框架的 起始位点，有些基因也使用 GUG 或 UUG 作为翻译起始密码子 SD 序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成 基因编码区 5’ 端若干密码子的碱基序列
真核细胞mRNA的5′非翻译区不存在SD序列， 但绝大多数mRNA的起始序列含有共同序列。
不同生物使用密码子具有不同的偏好性。如果 外源基因的mRNA密码子使用受体的偏好密码子， 则表达效率高。
mRNA上的终止密码对正确翻译的效率有很大 影响。在原核细胞中，UAA为最常用的终止密码 子。
四、表达蛋白质在细胞中的稳定性
P tac = 3 P trp = 11 P lac
-10 区序列 TATAAT T TAA C T TATAAT TAAT G T GATACT TATAAT
Lac 表达系统
以大肠杆菌 lac 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统 转录调控机理
具有多顺反子结构，基因排列次序为： 启动子（lacP）- 操纵基因（lacO） - 结构基因（lacZ-lacY-lacA） 正调节因子 CAP 负调节因子 lac I
三、终止子
终止子是提供终止信号使RNA聚合酶停止转录 的DNA序列。
本征终止子指不需要其他蛋白辅助因子便可在 特殊的RNA结构区内实现终止作用。属于强终止 子。
依赖型终止子需要ρ因子的辅助，属于弱终止 子。
四、衰减子
衰减子是基因表达调控的精细调节装置，利用 原核生物转录与翻译相偶联的特性，依赖自身巧 妙的特征序列和相应的RNA二级结构，对基因转 录进行地开关式的微调作用，从而保证原核生物 在相关操纵子处于阻遏的状态下仍能以一个本底 水平合成氨基酸、核苷酸和抗生素等。
mRNA
Tac 表达系统
tac 启动子是由 trp 的 –35 序列和 lacUV5 的 –10 序列拼接而成的杂 合启动子。
启动子 P lac P trp P tac
-35 区序列 TTTACA TTGACA TTGACA
-10 区序列 TATAAT T TAA C T TATAAT
调控模式与 lacUV5 相似，但 mRNA 转录水平高于 trp 和 lacUV5 启动子（P tac = 3 P trp = 11 P lac），因此在要求有较高基因表达 水平的情况下，选用 tac 启动子比用 lacUV5 启动子更优越。
RNRANA 聚聚合合酶酶
Plac
lacO
高效转录
lacZ lacY lacA
葡萄糖代谢 cAMP浓度降低
cAMP
cAMP CAP
CAP lacI
RNA 聚合酶
Plac
本底水平转录
lacO
lacZ lacY lacA
Lac 表达系统
lac UV5 突变体 Plac UV5 突变体能够在没有 CAP 存在的情形下非常有效的起始 转录，受它控制的基因在转录水平上只受 lacI 的调控，因此用它 构建的表达载体在使用时比野生型 Plac 更易操作。
选择性标记基因和复制子结构等，则 RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质 粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；
过长的 mRNA 往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量 消耗；
更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构， 从而大 大降低外源基因编码产物的翻译效率。
强终止子的选择与使用
4.密码子
不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白 质编码基因，对简并密码子使用频率并不 相同，具有一定的偏爱性。外源基因在大 肠杆菌中的表达需考虑密码子的偏好性。
5.选择标记
大肠杆菌的选择标记一般采用抗生素抗 性基因。
(二)宿主菌
外源基因表达产物在大肠杆菌细胞内容易被降 解，为了避免降解，需要构建与表达载体相适应 的大肠杆菌宿主菌。如BL21。
目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌 rRNA 操纵子上
的 rrnT1T2 以及 T7 噬菌体 DNA 上的 Tf。
对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特 殊结构，以增强其转录终止作用
3.核糖体结合位点
外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频 率，而且在很大程度上还与 mRNA 的翻译起始效率密切相关。
核糖体结合位点