钙调蛋白的提纯与检测资料
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材料的预处理: 将 切 取 的 组 织 用 4℃ 预 冷 的 0.01mol/l的PBS漂洗去血渍， 再 用 滤 纸 吸 干 残 留 的 PBS （磷酸盐缓冲液 ）。
钙调蛋白的提纯及检测 实验目的 实验原理 实验步骤 实验反思 参考文献
组织破碎和细胞破碎
加 入 0.02mol/L~0.05mol/L 磷酸盐和碳酸盐等渗盐缓冲液 （用量是原材料体积的1-5倍) 或 0.09 mol/L ～ 0.15mol/LNaCl 溶液。再加入降解抑制剂：二 异丙基氟磷酸（DFP），碘乙 酸、苯甲磺酰氟化物（PMSF） 等调节PH至6—8，必须在冰水 中（0℃～5℃的低温操作）并 均匀温和搅拌。研磨，有条件 的话采用玻璃匀浆器匀浆，但 一定要低温下进行。
m/Z
钙调蛋白的提纯及检测 实验目的 实验原理 实验步骤 实验反思 参考文献
分析检测之定性分析
➢PDE激活度反馈法
钙调蛋白可激活依 赖于钙的磷酸二酯酶活 性，故可用特异性激活 的磷酸二酯酶（可自牛 心中提取）的激活程度 来分析样品钙调蛋白的 活性。 以标准钙调蛋白制作标 准曲线。
钙调蛋白的提纯及检测 实验目的 实验原理 实验步骤 实验反思 参考文献
钙调蛋白的提纯及检测 实验目的 实验原理 实验步骤 实验反思 参考文献
分析检测之定性分析
➢质谱法 MALDI-TOF-MS测定蛋白质的分子量和纯度
1600 1200
17697.72 8849.63
800
400
0 0
35380.80
53232.76
8000
16000 24000 32000 40000 48000 56000
用SDS—PAGE检测不同纯化阶 段所获得的提取液样品中CaM的 纯度与相对分子质量。 电泳采用 质量分数为15%的分离胶和质量 分数为5%的浓缩胶, 120V电压条 件下进行电泳, 直至溴酚蓝到达凝 胶底部. 考马斯亮蓝染色, 凝胶成 像仪成像。
钙调蛋白的提纯及检测 实验目的 实验原理 实验步骤 实验反思 参考文献
上 柱 后 依 次 用 50mLbufferB 、 200mL 含 0.5mol/LNaCl 的 bufferB 淋 洗；再用bufferC洗脱。下方流出为 目的蛋白液，用大试管或者烧杯盛 装之。
钙调蛋白的提纯及检测 实验目的 实验原理 实验步骤 实验反思 参考文献
精细纯化
本步骤目的除去蛋白液中配体离子
钙调蛋白的提纯及检测 实验目的 实验原理 实验步骤 实验反思 参考文献
实验流程
提取
细胞的 破碎
材料的 选择和 预处理
纯化
分析检测
钙调蛋白的提纯及检测 实验目的 实验原理 实验步骤 实验反思 参考文献
实验步骤
材料的选择: 成年健康雄性大鼠脑组织 500g （ 比 雌 鼠 体 积 大 、 成 本 较低物种易获得）
分析检测之定性分析
➢SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量及纯度
当分子量在15KD到200KD之 间时，蛋白质的迁移率和分 子量的对数呈线性关系，符 合下式： logMW=K-bX 将已知分子量的标准蛋白质 的迁移率对分子量对数作图， 可获得一条标准曲线，将提 纯出来的钙调蛋白在相同条 件下进行电泳，根据它的电 泳迁移率即可在标准曲线上 求得分子量。
实验目的
1 了解钙调蛋白的提纯和检测步骤 2 理解钙调蛋白的相关特点及性质 3 理解亲和层析的原理及方法 4 感悟一般蛋白提纯、检测的流程
钙调蛋白的提纯及检测 实验目的 实验原理
钙 调 蛋 白 （ CaM ） 是 由 148 个 氨 基 酸组成的单链分子,其pI值在3.9-4.3之 间,分子量约为16700KDa.该蛋白能够耐 一定的高温，在90℃加热3-4min后仍然 能够保持80%的活性。该蛋白分子中含 有较多的疏水性残基，与Ca2+结合后可 以暴露出它的疏水基团。
分析检测之定量分析 ➢Folin-酚试剂法（Lowry法）
蛋白质中的酪氨酸或半胱氨酸，能与Folin-酚试剂起 氧化还原反应，生成蓝色化合物，500nm比色测定，可 能钙调蛋白的含量。
钙调蛋白的提纯及检测 实验目的 实验原理 实验步骤 实验反思 参考文献
实验反思
为达到分离提纯目的蛋白：钙调蛋白并且保持钙调蛋白活性 并尽力提高产品的质量和产量的目的。本实验设计考虑到实验室 可能条件，以及钙调蛋白的特异性的前提下，尽量采用最高效、 最合适、最专一的方法，如金属螯合亲和层析以及分级盐析等实 验操作，进行提纯和检测。但是仍然有很多地方有待改进，比如： 亲和层析是得到的是钙调蛋白—配体结合物，如何使配体钙离子 离去呢？等等。
钙调蛋白的提纯及检测 实验目的 实验原理 实验步骤 实验反思 参考文献
提取蛋白质等大分子
对上面所获匀浆液差速 离心、丢弃沉淀部分、 获得上清液。上清液中 含有大量的目的蛋白： 钙调蛋白、非蛋白质如 核酸及小分子
钙调蛋白的提纯及检测 实验目的 实验原理 实验步骤 实验反思 参考文献
初级纯化
盐析法结合等电点沉淀：利用蛋白质盐析不变性的性质，加入硫酸铵 使达到40%饱和度，调PH至7，静置两小时后离心取上清液。加硫酸铵 使 成 60% 饱 和 度 ， 并 加 入 1mol/LMgAC2, 使 其 浓 度 达 到 0.01mol/L, 调 PH=4，一段时间后，过滤获得沉淀。
钙调蛋白的提纯及检测 实验目的 实验原理 实验步骤 实验反思 参考文献
精细纯化
方法：金属螯合亲和层析的方法
制作金属螯合亲和色谱柱：用 1倍柱体积浓度为 0.2mol/L的钙离 子中性溶液上柱。
将上清液PH调制6—8，加入少 了蛋白质解离抑制剂。将处理好的 层析液从层析住上方慢速上样。下 方用大试管或烧杯收集杂质液。
热 变 性 选 择 性 沉 淀 ： 将 蛋 白 质 沉 淀 溶 于 少 量 缓 冲 液 （ 20mMTrisHCl,PH=7.0,1mM咪唑，1mMMgAC2,10uMCaCl2)中，加入少量蛋白酶抑制剂 配置成溶液，调PH=8。置90℃水浴中煮沸3—4分钟；冰水浴冷却后离心 20 分钟，获取上清液。
方法一： 半透膜进行透析 方法二： 将上次获得目的蛋白溶液经凝胶过 滤色谱柱上方以适中速度淋洗。在 色谱柱下方首次接收的溶液即为高 纯度的钙调蛋白溶液；第二次接收 到的即为配体离子的溶液。
钙调蛋白的提纯及检测 实验目的 实验原理 实验步骤 实验反思 参考文献
分析检测之定性分析
➢SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量及纯度
钙调蛋白的提纯及检测 实验目的 实验原理 实验步骤 实验反思 参考文献
组织破碎和细胞破碎
加 入 0.02mol/L~0.05mol/L 磷酸盐和碳酸盐等渗盐缓冲液 （用量是原材料体积的1-5倍) 或 0.09 mol/L ～ 0.15mol/LNaCl 溶液。再加入降解抑制剂：二 异丙基氟磷酸（DFP），碘乙 酸、苯甲磺酰氟化物（PMSF） 等调节PH至6—8，必须在冰水 中（0℃～5℃的低温操作）并 均匀温和搅拌。研磨，有条件 的话采用玻璃匀浆器匀浆，但 一定要低温下进行。
m/Z
钙调蛋白的提纯及检测 实验目的 实验原理 实验步骤 实验反思 参考文献
分析检测之定性分析
➢PDE激活度反馈法
钙调蛋白可激活依 赖于钙的磷酸二酯酶活 性，故可用特异性激活 的磷酸二酯酶（可自牛 心中提取）的激活程度 来分析样品钙调蛋白的 活性。 以标准钙调蛋白制作标 准曲线。
钙调蛋白的提纯及检测 实验目的 实验原理 实验步骤 实验反思 参考文献
钙调蛋白的提纯及检测 实验目的 实验原理 实验步骤 实验反思 参考文献
分析检测之定性分析
➢质谱法 MALDI-TOF-MS测定蛋白质的分子量和纯度
1600 1200
17697.72 8849.63
800
400
0 0
35380.80
53232.76
8000
16000 24000 32000 40000 48000 56000
用SDS—PAGE检测不同纯化阶 段所获得的提取液样品中CaM的 纯度与相对分子质量。 电泳采用 质量分数为15%的分离胶和质量 分数为5%的浓缩胶, 120V电压条 件下进行电泳, 直至溴酚蓝到达凝 胶底部. 考马斯亮蓝染色, 凝胶成 像仪成像。
钙调蛋白的提纯及检测 实验目的 实验原理 实验步骤 实验反思 参考文献
上 柱 后 依 次 用 50mLbufferB 、 200mL 含 0.5mol/LNaCl 的 bufferB 淋 洗；再用bufferC洗脱。下方流出为 目的蛋白液，用大试管或者烧杯盛 装之。
钙调蛋白的提纯及检测 实验目的 实验原理 实验步骤 实验反思 参考文献
精细纯化
本步骤目的除去蛋白液中配体离子
钙调蛋白的提纯及检测 实验目的 实验原理 实验步骤 实验反思 参考文献
实验流程
提取
细胞的 破碎
材料的 选择和 预处理
纯化
分析检测
钙调蛋白的提纯及检测 实验目的 实验原理 实验步骤 实验反思 参考文献
实验步骤
材料的选择: 成年健康雄性大鼠脑组织 500g （ 比 雌 鼠 体 积 大 、 成 本 较低物种易获得）
分析检测之定性分析
➢SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量及纯度
当分子量在15KD到200KD之 间时，蛋白质的迁移率和分 子量的对数呈线性关系，符 合下式： logMW=K-bX 将已知分子量的标准蛋白质 的迁移率对分子量对数作图， 可获得一条标准曲线，将提 纯出来的钙调蛋白在相同条 件下进行电泳，根据它的电 泳迁移率即可在标准曲线上 求得分子量。
实验目的
1 了解钙调蛋白的提纯和检测步骤 2 理解钙调蛋白的相关特点及性质 3 理解亲和层析的原理及方法 4 感悟一般蛋白提纯、检测的流程
钙调蛋白的提纯及检测 实验目的 实验原理
钙 调 蛋 白 （ CaM ） 是 由 148 个 氨 基 酸组成的单链分子,其pI值在3.9-4.3之 间,分子量约为16700KDa.该蛋白能够耐 一定的高温，在90℃加热3-4min后仍然 能够保持80%的活性。该蛋白分子中含 有较多的疏水性残基，与Ca2+结合后可 以暴露出它的疏水基团。
分析检测之定量分析 ➢Folin-酚试剂法（Lowry法）
蛋白质中的酪氨酸或半胱氨酸，能与Folin-酚试剂起 氧化还原反应，生成蓝色化合物，500nm比色测定，可 能钙调蛋白的含量。
钙调蛋白的提纯及检测 实验目的 实验原理 实验步骤 实验反思 参考文献
实验反思
为达到分离提纯目的蛋白：钙调蛋白并且保持钙调蛋白活性 并尽力提高产品的质量和产量的目的。本实验设计考虑到实验室 可能条件，以及钙调蛋白的特异性的前提下，尽量采用最高效、 最合适、最专一的方法，如金属螯合亲和层析以及分级盐析等实 验操作，进行提纯和检测。但是仍然有很多地方有待改进，比如： 亲和层析是得到的是钙调蛋白—配体结合物，如何使配体钙离子 离去呢？等等。
钙调蛋白的提纯及检测 实验目的 实验原理 实验步骤 实验反思 参考文献
提取蛋白质等大分子
对上面所获匀浆液差速 离心、丢弃沉淀部分、 获得上清液。上清液中 含有大量的目的蛋白： 钙调蛋白、非蛋白质如 核酸及小分子
钙调蛋白的提纯及检测 实验目的 实验原理 实验步骤 实验反思 参考文献
初级纯化
盐析法结合等电点沉淀：利用蛋白质盐析不变性的性质，加入硫酸铵 使达到40%饱和度，调PH至7，静置两小时后离心取上清液。加硫酸铵 使 成 60% 饱 和 度 ， 并 加 入 1mol/LMgAC2, 使 其 浓 度 达 到 0.01mol/L, 调 PH=4，一段时间后，过滤获得沉淀。
钙调蛋白的提纯及检测 实验目的 实验原理 实验步骤 实验反思 参考文献
精细纯化
方法：金属螯合亲和层析的方法
制作金属螯合亲和色谱柱：用 1倍柱体积浓度为 0.2mol/L的钙离 子中性溶液上柱。
将上清液PH调制6—8，加入少 了蛋白质解离抑制剂。将处理好的 层析液从层析住上方慢速上样。下 方用大试管或烧杯收集杂质液。
热 变 性 选 择 性 沉 淀 ： 将 蛋 白 质 沉 淀 溶 于 少 量 缓 冲 液 （ 20mMTrisHCl,PH=7.0,1mM咪唑，1mMMgAC2,10uMCaCl2)中，加入少量蛋白酶抑制剂 配置成溶液，调PH=8。置90℃水浴中煮沸3—4分钟；冰水浴冷却后离心 20 分钟，获取上清液。
方法一： 半透膜进行透析 方法二： 将上次获得目的蛋白溶液经凝胶过 滤色谱柱上方以适中速度淋洗。在 色谱柱下方首次接收的溶液即为高 纯度的钙调蛋白溶液；第二次接收 到的即为配体离子的溶液。
钙调蛋白的提纯及检测 实验目的 实验原理 实验步骤 实验反思 参考文献
分析检测之定性分析
➢SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量及纯度