酵母双杂交系统
酵母双杂交
酵母转录因子(Gal 4)
与BD-fusion ---诱饵蛋白(bait protein ) 与AD-fusion ---猎物或靶蛋白(prey or target protein)
报告基因(reporter gene)
---Lac Z(编码β -半乳糖苷酶)
报道株
经改造的、含报告基因的重组质粒的宿 主细胞。 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有 许多优点:
酵母双杂交系统
一、酵母双杂交系统的简介
酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system) 是由Fields和song等在1989年提出的一种在真 核模式生物酵母中进行的,研究活细胞内蛋 白质相互作用的遗传系统。 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细 胞调控转录起始过程的认识。研究发现,许 多真核生物的转录因子都是由两个可以分开 的、功能上相互独立的结构域组成的。
DNA结合结构域(BD)
(DNA binding domain)
转录激活因子
转录激活结构域(AD) (activation domain)
•这两个结构域各具功能,互不影响,
•单独存在时都没有转录激活的功能,
•只有二者在空间上充分接近时,才表现出一个完整的
激活特定基因表达的激活因子的功能。
二、酵母双杂交系统的建立
五、酵母双杂交的应用
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的, 研究活细胞内蛋白质相互作用,对蛋白质之间微弱的、 瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检 测得到,它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间 关系的技术。
大量的研究文献表明,酵母双杂交技术既可以用 来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作,也 可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互 作。因此,它在许多的研究领域中有着广泛的应用。
酵母双杂交体系Yeasttwo-hybridsystem酵母双杂交
同时用上述两种载体转化改造后的酵
母,这种改造后的酵母细胞的基因组 中不能产生GAL4结合形成杂种 蛋白,与GAL1的UAS序列结合,但由于无 AD的参与,报告基因不转录。 蛋白质X DNA-BD
基本原理
DNA结合域(DNA-BD):N端1-147 氨基酸 转录激活域(AD):C端786-881氨基 酸
DNA-BD:识别GAL4效应基因上游的 激活序列(UAS) ,并与之结合 AD:通过同转录机制(transcription machinery)的其它成分之间的结合以启 动上游激活序列(UAS)下游的基因转录。
用DNA重组技术,将DNA-BD和AD分 开,并放在同一宿主细胞中表达。
将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质 Bait protein的基因构建在同一个表达 载体上,在酵母中表达两者的融合蛋白 BD-Bait proteiRARY表达载体上。
上游更远处 增强子 统称顺式作用元件
转录因子
能直接或间接辨认和结合上游区段DNA 的蛋白质----反式作用因子. 其中能直接或间接与RNA聚合酶结合的 称为转录因子(TF). 相应于RNA聚合酶ⅠⅡⅢ的转录因子为 TF Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ 真核生物的TFⅡ又分为TFⅡ A与TFⅡ B
真核生物转录起始前复合物
(ADH1:醇脱氢酶1)
实验程序
1 2 3 4 5
分别重组两种穿梭质粒载体。 分别导入E.coli培养。 分别提取两种质粒。 转化酵母菌 筛选阳性克隆
应用---蛋白质相互作用
酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交课件
酵母单杂交系统的应用
寻找与特定DNA序列相互作用的蛋白质
01
通过将待研究的蛋白质与转录因子融合,可以筛选出与特定
DNA序列相互作用的蛋白质。
研究蛋白质的功能
02
通过分析蛋白质与DNA的相互作用,可以深入了解蛋白质的功
酵母杂交技术的发展趋势
操作简便化
随着技术的发展,酵母杂交技术 的操作将越来越简便,使得更多 的实验室和研究人员能够利用该
技术进行研究。
应用广泛化
随着研究的深入,酵母杂交技术 的应用范围将越来越广泛,不仅 局限于蛋白质之间的相互作用研 究,还可以应用于转录因子活性
等方面的研究。
系统化与自动化
未来,随着技术的发展,酵母杂 交技术将逐渐实现系统化和自动 化,进一步提高实验的准确性和
该方法基于真核生物的转录调控机制,通过将两个蛋白质的 编码基因分别与酵母的转录激活因子基因GAL4的N端和C端 融合,形成两个融合蛋白,再观察这两个融合蛋白在酵母细 胞中的相互作用对转录的影响。
酵母双杂交系统的应用
基因表达调控研究
药物筛选
通过分析不同条件下蛋白质之间的相 互作用,了解相关基因的表达调控机 制。
酵母三杂交系统
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酵母单Байду номын сангаас交
酵母双杂交系统原理(一)
酵母双杂交系统原理(一)酵母双杂交系统1. 什么是酵母双杂交系统?•酵母双杂交系统是一种常用的蛋白质相互作用研究方法,用于测试两个蛋白质是否相互作用,并进一步研究其相互作用的特点和机制。
•这个系统基于酵母菌(酿酒酵母或拟南芥酵母)的特性,当两个蛋白质相互作用时,可以触发酵母的生长或表达特定的报告基因。
2. 酵母双杂交系统的原理•酵母双杂交系统基于两个重要的分子域:DNA结合域(DBD)和激活域(AD)。
•DBD通常来自于一个转录因子,可以与DNA结合并调节基因的转录水平。
•AD则是一个激活域,可以与其他蛋白质相互作用并激活报告基因的表达。
•在酵母双杂交系统中,将待测蛋白的DBD与一个对照蛋白的AD 融合,构建成DBD-融合蛋白,而待测蛋白的AD与一个对照蛋白的DBD融合,构建成AD-融合蛋白。
•当两个融合蛋白相互作用时,DBD和AD相互结合,激活报告基因的表达,从而观察到酵母生长或报告基因的表达。
3. 酵母双杂交系统的应用•酵母双杂交系统广泛应用于蛋白质相互作用和功能研究领域。
•可以用于筛选蛋白质相互作用的伙伴,发现新的蛋白质复合物。
•可以用于研究蛋白质的亚细胞定位和功能等特性。
•可以用于研究蛋白质结构和功能的变异。
•可以用于研究蛋白质与其他生物分子(如DNA、RNA、小分子化合物等)的相互作用。
•可以用于研究蛋白质的信号传导途径和调控机制。
4. 酵母双杂交系统的优缺点优点:•酵母双杂交系统是一种简单、快速、高通量的方法,可以同时测试多个蛋白质相互作用。
•可以研究蛋白质相互作用的强度和特异性。
•可以在活细胞环境下进行研究,更接近生物体内的情况。
缺点:•酵母双杂交系统可能存在假阳性和假阴性的问题,需要进行进一步的验证。
•酵母双杂交系统对蛋白质的折叠状态和局部结构要求较高,对于某些复杂蛋白质可能不适用。
•酵母双杂交系统无法直接观察蛋白质相互作用的动力学过程,只能得到静态的结果。
总结酵母双杂交系统是一种重要的蛋白质相互作用研究方法,基于酵母菌的特性,通过构建融合蛋白实现对蛋白质相互作用的测试。
酵母双杂交系统名词解释
酵母双杂交系统名词解释
嘿,你知道啥是酵母双杂交系统不?这可不是一般的东西啊!就好像是一把神奇的钥匙,能打开好多未知的大门。
酵母双杂交系统呢,简单来说,就是一种用来研究蛋白质相互作用的技术。
比如说吧,蛋白质 A 和蛋白质 B,它们之间有没有啥特别的关系呢?酵母双杂交系统就能帮我们搞清楚。
想象一下,酵母就像是一个小小的实验室,在里面各种蛋白质跑来跑去。
如果蛋白质 A 和蛋白质 B 能相互结合,那就像两个小伙伴手牵手一样,会产生一些特别的信号。
这就好比在黑暗中突然亮起了一盏灯,告诉你:嘿,它们俩有关系呢!
咱再具体点说,它是通过巧妙的设计,把要研究的蛋白质分别和特定的结构融合在一起。
然后把这些融合体放到酵母细胞里。
如果这时候出现了特定的反应,那就说明这两个蛋白质之间有互动。
这就好像是一场精心设计的游戏,只有符合条件的才能通关。
“哎呀,那这有啥用啊?”你可能会这么问。
用处可大啦!它能帮助我们理解细胞里各种复杂的过程,像是基因表达调控啊,信号转导啊等等。
就好像是在拼图,一块一块地拼凑出生命的奥秘。
而且哦,这个酵母双杂交系统就像一个超级侦探,能找出那些隐藏在细胞深处的蛋白质之间的秘密关系。
它让我们对生命的运行机制有了更深入的了解。
总之,酵母双杂交系统是生物学研究中非常重要的工具,它就像一
把开启生命奥秘之门的钥匙,让我们能更深入地探索生命的神奇世界。
怎么样,是不是很厉害?。
大肠杆菌酵母双杂交系统在基因互作研究中的应用
大肠杆菌酵母双杂交系统在基因互作研究中的应用生命科学研究中,基因互作是一个重要的研究领域,对了解基因的功能,及其在生物学中的重要性具有关键性意义。
近年来,越来越多的研究者运用酵母双杂交系统来研究基因互作。
其中,大肠杆菌酵母双杂交系统在基因互作研究中的应用越来越广泛。
1. 大肠杆菌酵母双杂交系统简介酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)最早是由Fields与Song在1989年提出的,它是一种通过互补形成基因蛋白质互作物的方法。
大肠杆菌酵母双杂交系统(E. coli yeast two-hybrid system)是在酵母双杂交系统的基础上发展而来的。
它是通过将酵母双杂交系统中的酵母菌GAL4基因融合到大肠杆菌中的一种表达载体,并在其上构建相应的表达基因来实现的。
通过这种方法,大肠杆菌系能够鉴定出与目标蛋白质相互作用的蛋白质,并通过一些方法进行确认和鉴定。
2. 大肠杆菌酵母双杂交系统的优点(1)鉴定简单:大肠杆菌酵母双杂交系统只需要一些特定的基因表达载体,而不需要其他繁琐的操作,使其鉴定基因互作关系的过程变得更加简单。
(2)兼容成熟技术:大肠杆菌酵母双杂交系统是在酵母双杂交系统技术的基础上发展起来的,因此,其技术兼容性是酵母双杂交系统的一个很好的特点。
大肠杆菌酵母双杂交系统可以通过一定的改变来应对不同的研究需求。
(3)识别特异性高:大肠杆菌酵母双杂交系统的识别特异性非常高,能够鉴定出相互作用蛋白的特异性差异。
3. 大肠杆菌酵母双杂交系统的应用大肠杆菌酵母双杂交系统的主要应用是用于了解蛋白质之间的定向互作关系。
例如,研究一个特定的基因是如何参与一个生物功能的,就需要找到与之相关的其他基因,以了解它们之间是否发生了相互作用。
在研究基因调控的过程中也能使用它进行分析。
此外,大肠杆菌酵母双杂交系统还能运用于感染病毒的分析。
例如:通过大肠杆菌酵母双杂交系统的研究,有学者发现存在于整个病毒基因组中、并参与了其复制的两个产生蛋白质。
酵母双杂交.三杂交
其中第一个融合蛋白由两部分组成,一部分为能 结合lexA启动子的DNA结合结构域,另一部分为噬菌 体衣壳蛋白MS2。第二个融合蛋白也由两部分组成, 一部分为能激活lexA启动子的转录激活结构域,另一 部分为有待研究的RNA结合蛋白“Y”。
这两个融合蛋白通过第三个融合的RNA分子相连,其一 端为含有噬菌体衣壳蛋白MS2结合位点的MS2RNA,另 一端为有待研究的RNA“X”。一旦“X”和“Y”能有相互 作用就使得这个复合物形成一个功能性的转录激活因 子,从而使得下游的LacZ基因和His3基因得以表达。 LacZ基因的表达水平能够通过在体外检测β半乳糖苷酶 的活性来确定,His3基因的表达赋予了酵母细胞在缺乏 组氨酸的培养基上生存的能力。通过缺陷培养基及β半 乳糖苷酶的活性的测定就能判断在酵母菌内是否发生 了RNA“X”和蛋白质“Y”的相互作用。
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酵母双杂交操作主要流程
1. 分别构建BD和AD融合蛋白载体
BD
2. 分别将重组载体转化酵母菌细胞
BD
3. 对酵母转化子进行自激活检测
AD AD
酵母双杂交检测(Yeast
酵母双杂交检测(Yeast Two酵母双杂交检测(Yeast Two-Hybrid Assay)产品专题检测原理:酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid assay)是⽤于体内研究蛋⽩相互作⽤的⼀种⾮常便利的⼯具,常⽤的如GAL4为基础的系统,使⽤酵母转录因⼦GAL4来检测转录激活后的蛋⽩相互作⽤。
某些转录因⼦(如GAL4)由两个可以分开,功能上相互独⽴的结构域组成,N端有⼀个147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD),C端有⼀个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。
BD可以和上游激活序列(UAS)结合,⽽AD能激活UAS下游基因进⾏转录。
单独的BD或AD不能激活基因转录,两者只有通过某种⽅式结合在⼀起形成完整的转录激活因⼦的功能【见图1】。
酵母双杂交系统主要利⽤酵母GAL4的这个特性通过两个杂交蛋⽩在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来研究活细胞内蛋⽩质的相互作⽤,对蛋⽩质之间微弱、瞬间的作⽤都能通过报告基因敏感的检测到。
酵母双杂交系统应⽤:1)对新的与已经蛋⽩相互作⽤的鉴定2)对预测蛋⽩相互作⽤的确认3)对蛋⽩相互作⽤区域的鉴定双杂交检测原理图。
两个蛋⽩分别表达,⼀个(诱饵蛋⽩bait protein)融合到Gal4 DNA 图1.双杂交检测原理图。
结合域表达,另⼀个(诱捕蛋⽩prey protein)融合到Gal4转录激活结构域(AD)表达。
在Y2HGold酵母菌株中,只有当两个蛋⽩之间相互作⽤并结合到Gal4反应性启动⼦上才能活化报告基因(AUR1-C, ADE2, HIS3, 和MEL1)的表达。
酵母双杂交系统重要元件介绍(以Matchmarker GAL4-based two hybrid assay为例)诱饵(the bait)⼀、⼀、诱饵(为了建⽴GAL4 DNA-BD/bait融合蛋⽩,推荐使⽤质粒pGBKT7;要调查三元蛋⽩复合物,推荐使⽤含2个MCS区域的三杂交载体,能表达GAL4 DNA-BD/bait融合蛋⽩和第⼆个感兴趣蛋⽩,在bait和prey蛋⽩之间发挥桥梁作⽤。
第18章酵母双杂交系统 83页
a接合型和接合型(两者之间可,但自 身不能形成二倍体)
多克隆位点
DNA-BD
转化
a接合型酵母细胞
转化
接合型酵母细胞
筛选平板
筛选平板
生长菌苔
生长菌苔
同一个三重筛选平板
利用酵母双杂交技术,将因之间的联系,建立基因组蛋白连锁图。 对于认识一些重要的生命活动:如信号传导、代谢途 径等有重要意义。
五、酵母双杂交系统中常见问题的解决和 改进措施
(一) 假阳性较多 (二) 转化效率偏低 (三) 阴性干扰
可检测存在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用。
三、酵母双杂交系统的优点
1. 高敏感性。 2. 真实性。检测在活细胞内进行,作用条件与作用力
无需模拟,在一定程度上代表细胞内的真实情况。 3. 简洁性。融合蛋白相互作用后,减少了制备抗体和
纯化蛋白质的繁琐步骤。 4. 广泛性。采用不同组织器官细胞类型和分化时期的
研究蛋白质相互作用的常用方法
•酵母双杂交(yeast two hybridization) •亲和层析 •免疫共沉淀 •蛋白质交联 •基于GFP的细胞内蛋白质相互作用的研究方法 •噬菌体显示系统筛选
第一节 酵母双杂交系统简介
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母 中进行的,研究活细胞内蛋白质相互作用, 对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过 报告基因的表达产物敏感地检测得到。
克隆(诱饵与靶蛋白相互作用)
β-半乳糖苷酶
鉴定
(三)阴性干扰
两个蛋白本应发生相互作用,但报告基因不表达或表 达程度甚低以至于检测不出来。
原因:
融合蛋白的表达对细胞有毒性,该怎么办?
酵母双杂交自激活
蛋白质相互作用在细胞生物学和疾病中的作用。
此外,酵母双杂交系统还可以用于筛选新的药物靶点或鉴定新
03
的治疗策略。
酵母双杂交系统的优缺点
优点
酵母双杂交系统具有高灵敏度和特异性,能够检测到低亲和力的相互作用。此外 ,它还具有高通量和高可重复性的特点,可以同时检测多个蛋白质之间的相互作 用。
缺点
然而,酵母双杂交系统也存在一些局限性。例如,它可能受到酵母细胞内其他因 素的影响,导致假阳性结果。此外,由于酵母细胞与人类细胞存在差异,因此某 些在酵母细胞中检测到的相互作用可能无法在人类细胞中重现。
蛋白质的相互作用可以通过多种方式进 在酵母双杂交实验中,了解蛋白质之间 行,例如通过蛋白质的直接接触或通过 的相互作用有助于预测自激活的可能性, 与它们相关的其他分子之间的相互作用。 并采取措施避免或减少这种现象的发生。
基因表达水平的影响
基因表达水平对酵母双杂交自激活也有重要影响。当一个基因的表达水平过高时, 它可能会产生过多的蛋白质,导致自激活。
2
该系统基于两种基本的酵母转录因子,即GAL4 和STE12,它们可以分别与DNA结合并激活转录。
3
当一个转录因子与另一个转录因子结合时,它们 可以形成一个杂合二聚体,从而激活转录。
酵母双杂交系统的应用
01
酵母双杂交系统被广泛应用于研究蛋白质之间的相互作用,特 别是在信号转导和转录调控领域。
02
它可以帮助科学家确定蛋白质相互作用的结构基础,以及研究
酵母双杂交自激活
目录
• 酵母双杂交系统简介 • 酵母双杂交自激活的发现与确认 • 酵母双杂交自激活的影响因素
目录
• 酵母双杂交自激活的调控策略 • 酵母双杂交自激活的实际应用 • 未来展望与研究方向
酵母双杂交系统原理
酵母双杂交系统原理酵母双杂交系统是一种常用的蛋白质相互作用研究方法,它通过酵母细胞内两个蛋白质的相互作用来筛选出蛋白质间的相互作用关系,从而揭示细胞内蛋白质相互作用的网络。
酵母双杂交系统的原理主要包括构建酵母表达载体、转化酵母细胞、筛选阳性克隆和验证蛋白质相互作用。
下面将详细介绍酵母双杂交系统的原理。
首先,构建酵母表达载体。
在酵母双杂交系统中,需要构建两个不同的表达载体,一个用于携带“诱饵”基因,另一个用于携带“靶标”基因。
诱饵基因编码的蛋白质与靶标基因编码的蛋白质是我们想要研究的两个相互作用蛋白。
这两个基因分别被插入到酵母表达载体的多个位点上,以便在酵母细胞内进行表达。
其次,转化酵母细胞。
构建好的酵母表达载体需要通过转化的方式导入到酵母细胞内。
在酵母细胞内,这两个载体会分别表达诱饵蛋白和靶标蛋白,从而在细胞内形成一种相互作用的条件。
接着,筛选阳性克隆。
经过转化后的酵母细胞需要进行筛选,以筛选出表达了诱饵蛋白和靶标蛋白的阳性克隆。
这一步通常通过对酵母细胞进行培养和筛选培养基来实现,只有表达了两个蛋白质的酵母细胞才能生长并形成克隆。
最后,验证蛋白质相互作用。
经过筛选得到的阳性克隆需要进行蛋白质相互作用的验证。
这一步通常通过蛋白质相互作用实验来进行,例如酵母双杂交实验、共免疫沉淀实验等。
通过这些实验,可以验证诱饵蛋白和靶标蛋白之间是否存在相互作用关系。
总的来说,酵母双杂交系统的原理是通过构建酵母表达载体、转化酵母细胞、筛选阳性克隆和验证蛋白质相互作用来揭示蛋白质间的相互作用关系。
这一方法在蛋白质相互作用研究中具有重要的应用价值,可以帮助科研人员更好地理解细胞内蛋白质相互作用的网络,从而为疾病治疗和药物开发提供重要的理论基础。
LexA酵母双杂交系统简介
LexA酵母双杂交系统简介一、LexA酵母双杂交系统的设计原理报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除,因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下,报告基因LacZ的转录活性为零,该基因的筛选标志为URA3,可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中,也可以被整合到EGY48基因组DNA上。
质粒pLexA的筛选标志为HIS3,在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵,Bait)的融合蛋白,该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控,选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。
质粒pB42AD的筛选标志为TRP1,在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游,含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于E.coli的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列,共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。
在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu,它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA,但两者启动子不同。
根据双杂交系统的原理,如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性,即可激活报告基因的转录和表达。
分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中,然后共同转入含有报告基因的酵母菌株,如果蛋白X与Y能相互作用,则启动报告基因的转录和表达,通过检测报告基因的表达情况,就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。
如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库,则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白,并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。
二、商品化酵母双杂交系统的组成1.载体质粒:pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库2.酵母菌株:EGY48、EGY48(p8op-LacZ)、YM4271(EGY48的伴侣菌株)3.大肠杆菌菌株:E.coli KC8株4.对照质粒:质粒用途pLexA-53,pB42AD-T阳性对照pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白〕阳性对照pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用)假阳性检测质粒5.引物:pLexA测序引物及pB42AD测序引物。
酵母双杂交系统原理
酵母双杂交系统原理
酵母双杂交系统是一种用于检测蛋白质相互作用的实验方法。
该系统利用酵母细胞中转录因子的功能来分析蛋白质与蛋白质之间的相互作用。
该系统的基本原理如下:
首先,选择一个酵母菌株,该菌株的基因组中包含了人类感兴趣的蛋白质的编码基因。
同时,构建两个酵母菌株的转录因子的变体,这两个转录因子变体分别包含感兴趣的蛋白质的结构域。
其中一个转录因子变体被命名为“BD融合蛋白”,另一个
转录因子变体被命名为“AD融合蛋白”。
然后,将这两个酵母菌株进行双杂交,使其杂交在一起。
如果感兴趣的蛋白质与其他蛋白质发生相互作用,那么这些蛋白质就能够重新组合形成一个完整的功能性转录因子。
这个功能性的转录因子可以结合到酵母细胞中的报告基因的启动子上,从而激活报告基因的表达。
通过检测和测量报告基因的表达水平,就可以确定感兴趣的蛋白质是否与其他蛋白质发生了相互作用。
需要注意的是,酵母双杂交系统虽然是一种有效的检测蛋白质相互作用的方法,但仍然有一些限制。
首先,该系统的结果并不能直接转化为体内或人体中的相互作用情况,因为在酵母细胞中的条件下进行的双杂交实验可能与真实情况存在差异。
其次,该方法可能存在假阳性或假阴性的情况,即可能会出现误判。
综上所述,酵母双杂交系统是一种通过利用酵母中的转录因子功能来检测蛋白质相互作用的实验方法。
通过对报告基因的表达水平进行测量,可以确定感兴趣的蛋白质是否与其他蛋白质发生了相互作用。
然而,该方法存在一些限制,需要谨慎分析和解释结果。
酵母双杂交
The End
Thanks For Your Attention
①高效:酵母转化方法简单,转化效率高达其具有较高的敏感度,可检测蛋白质之
间结合常数低至1 mmol/L 。
③真实:检测在活细胞内进行,作用条件与作用力无需模拟,在一定程度上
代表细胞内的真实情况。
②非普遍适用性:蛋白质必须定位于核内,
才能激活报告基因的表达, 因此,不能被转运到细胞核内的蛋白质不适用这种方法。
③假阴性:某些表达的融合蛋白通常在酵母菌株中产生毒性,从而抑制
报告基因的表达和酵母的生长,或者蛋白间的相互作用较弱,报告基因不表 达或表达程度甚低以至于检测不出来,使得酵母双杂呈现“假阴性”的结果。
④简捷:只需要构建诱饵表达载体,可以省略蛋白质抽提纯化或抗体制备的
繁琐步骤。
⑤广泛:可采用不同组织器官细适用于部分细胞质、细胞核及膜结合阳性,
即通过双杂交观察到的蛋白质的相互作用在真 实情况下不一定发生。 Ⅰ型,AD-Y 单独表达的融合蛋白即可激活转录; Ⅱ型,AD-Y 表达的融合蛋白和空BD 载体即可激活转录; Ⅲ型,AD-Y 表达的融合蛋白与任意的BD 载体表达的融合蛋白即可激活转录。 (双筛选系统等可以基本消除假阳性。)
3
应用实例
广泛地应用于蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA 、蛋白质与RNA 以及蛋白与其他小 分子间相互作用的研究, 如今也开始运用该系统进行高通量筛选相互作用蛋白及 其他相关分子。 其应用进展主要而研究蛋白间相互 作用的传递途径。目前已经利用该系统对HBV 、HCV 以及HIV 等多种病毒蛋白基 因的相互作用蛋白进行了研究。 (2)非常灵敏地检测或验证蛋白—蛋白的相互作用。 (3)可利用酵母双杂交筛选药物的作用位点, 寻找基因治疗中的多肽类药物。 (4)研究蛋白—蛋白间发生相互作用所必需的重要活性位点。在确定两蛋白存在相 互作用后, 要对所研究的蛋白做一系列缺失突变处理, 通过缺失掉不同片段来对 蛋白中起关键作用的功能域进行精确的定位。
酵母双杂交体系
酵母双杂交系统
技术步骤
应用
酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用,具有高度敏感性。
主要是由于:
①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。
②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行,而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤,降低了信号强度。
③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强,后者又与启动子DNA结合,此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。
④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。
同时,酵母表型, X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。
酵母双杂交系统(参考资料)
GENBANK序号 序号
NM_003282
P1 P5 P6 P1
16
800.000 700.000 β-G al Ac tivi ty ( Unit) 600.000 500.000 400.000 300.000 200.000 100.000 0.000 E1 E4 E8 E9 E11 E15 E17 E21 E22
10
11
以粒pGBT9-ERRα1/LBD的准备
DBD
LBD
PCR
ERRα1/LBD
13
14
2. 结果 2.1 酵母双杂交试验结果
A
A:在SD/-Leu/-Trp平板上接种的24个His+阳性克隆
B
15
B:菌落滤膜影印后X-gal/Z 缓冲液显色法共有17个克隆在8h之内变蓝
克隆序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12. 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
克隆编号 E1-3* E2-2 E2-5 * E4-1 * E8-1 * E9-3 * E10-2* E11-3 * E11-4 E12 -1 * E13-1 * E13-2 E14-1 * E15-3* E17-2* E17-3 E18-1* E18-2 E18-3 E20-5 * E21-3 E21-10 * E22-5 * E23-2 *
2
Yeast two-hybrid system:
a genetic assay for detecting protein-protein interactions
Regulation of gene expression in yeast
transcription activator
酵母双杂交系统的原理
酵母双杂交系统的原理酵母双杂交(systems)系统是一种基于酵母(yeast)细胞的生物技术,该技术用于研究蛋白质相互影响及其在蛋白质互作网络中的作用。
该技术采用重组DNA 技术将目标基因插入酵母细胞的基因组内,在酵母细胞内表达融合蛋白,通过检测融合蛋白的相互作用来分析蛋白质间的相互作用关系。
酵母双杂交系统的原理:酵母双杂交系统(principle of yeast two-hybrid system)基于蛋白质间的相互作用原理,其中包括:转录调控、信号传递及代谢途径等方面。
首先需要构建两个载体,一个是酵母转录因子的DNA结合结构域(BD)融合载体,另一个则是酵母活化装置的活化结构域(AD)融合载体。
在BD载体中含有一个目标基因的蛋白质结构域,该载体专门用于识别具有相互作用能力的肽链。
这个肽链是作为目标基因的蛋白质结构域插入到BD载体的后端,从而形成一个融合蛋白(BD-Target)。
在AD载体则含有另一目标基因的蛋白质结构域,该结构域是作为另一个相互作用配体的蛋白质结构域插入到AD载体的后端,并形成一个融合蛋白(AD-Target)。
当两个融合蛋白(BD-Target和AD-Target)进入同一个酵母细胞时,它们会自行相互结合。
这种相互结合会使BD域融合物释放出其与DNA结合的传输活性。
该生物技术利用此原理,通过分离酵母细胞中的mRNA,并对其进行筛查确定其结合后的特异性。
同时,酵母细胞也会检测信息的转移,并以此促进由两个融合蛋白之间的相互作用而激活的报告基因的表达。
这些报告基因可以编码酵母细胞中可见性较高的荧光蛋白,从而方便检测生物体中的酵母如何解释信号。
酵母双杂交系统的优势:酵母双杂交系统是一种非常有用的方法,可以在操作简单的情况下,高效地分析蛋白质间的相互作用及其生物学意义。
酵母双杂交系统的优点如下:1.可高效筛选蛋白质相互作用:酵母双杂交系统在高通量筛选系统中表现出良好的性能表现;这表明可以将其用于大规模筛选目标蛋白质相互作用蛋白。
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酵母双杂交系统1.原理酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。
研究发现,许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。
例如,酵母的转录激活因子GAL4,在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD),C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。
GAL4分子的DNA 结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence,UAS)结合,而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。
但是,单独的DNA结合域不能激活基因转录,单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因,它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。
2.试验流程酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点,通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质,其大致步骤为: 2.1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait),将其与DNA结合域融合,构建成诱饵质粒。
2.2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合,构建成文库质粒。
2.3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。
2.4、酵母细胞中,已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用,但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用,则可激活报告基因的转录;反之,则不能。
利用4种报告基因的表达,便可捕捉到新的蛋白质。
3.特点优点蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。
酵母双杂交系统的建立为研究这一问题提供了有利的手段和方法。
缺点尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法,但它也有自身的缺点和问题。
1、它并非对所有蛋白质都适用,这是由其原理所决定的。
双杂交系统要求两种杂交体蛋白都是融合蛋白,都必须能进入细胞核内。
因为融合蛋白相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的。
2、假阳性的发生较为频繁。
所谓假阳性,即指未能与诱饵蛋白发生作用而被误认为是阳性反应的蛋白。
而且部分假阳性原因不清,可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。
3、在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用,从而影响菌株生长和报告基因的表达。
使用酵母双杂交技术应注意的问题真正明了酵母双杂交技术的主要原理及筛选方法是进行酵母双杂交实验的前提,构建成功的诱饵质粒及大量的材料准备是进行酵母双杂交实验的保证。
只有明了双杂交的原理,才有可能设计实验进程、才能有目的的进行材料准备,并能对实验结果作出预测与分析,尤其要对具体实验中各种选择性压力培养基的使用目的要十分清楚。
大量的材料准备、较长的实验流程是酵母双杂交有别于其他实验的特点,而其操作技术本身并不十分困难。
特别应提出的是,一个阳性克隆的编号往往要被反复记录多次,因此,要时时注意编号的正确性。
另外,若从公司购得待筛选的酵母cDNA文库,应注意不同的公司有不同的产品,且各公司的产品不断更新换代,要认真阅读实验指导手册,以防出现失误。
4.应用研究已知蛋白间的相互作用、寻找在蛋白—蛋白相互作用中起关键作用的结构域、寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白。
相信随着分子生物学技术的发展与推广,酵母双杂交技术在今后的蛋白质组学研究中将发挥更大的作用。
酵母双杂交系统操作方法LexA酵母双杂交系统简介一、LexA酵母双杂交系统的设计原理报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除,因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下,报告基因LacZ的转录活性为零,该基因的筛选标志为URA3,可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中,也可以被整合到EGY48基因组DNA上。
质粒pLexA的筛选标志为HIS3,在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵,Bait)的融合蛋白,该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控,选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。
质粒pB42AD的筛选标志为TRP1,在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游,含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于E.coli的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列,共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。
在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu,它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA,但两者启动子不同。
根据双杂交系统的原理,如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性,即可激活报告基因的转录和表达。
分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中,然后共同转入含有报告基因的酵母菌株,如果蛋白X与Y能相互作用,则启动报告基因的转录和表达,通过检测报告基因的表达情况,就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。
如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库,则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白,并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。
二、商品化酵母双杂交系统的组成1. 载体质粒:pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库2. 酵母菌株:EGY48、EGY48(p8op-LacZ)、YM4271(EGY48的伴侣菌株)3. 大肠杆菌菌株:E.coli KC8株4. 对照质粒:质粒用途pLexA-53,pB42AD-T 阳性对照pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白〕阳性对照pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用) 假阳性检测质粒5. 引物:pLexA测序引物及pB42AD测序引物。
三、酵母双杂交实验的基本流程1. 将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株,用培养基SD/-Ura筛选。
2. 同时构建或扩增DNA文库,并纯化足够的质粒以转化酵母细胞。
3. 构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-X,作为钓饵(bait)。
4. 将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48(p8op-LacZ)细胞株,用SD/-His/-Ura筛选;并用固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Ura检测此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性,以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性。
转化质粒选择培养基克隆生长情况说明(含有Gal/Raf)pLexA-Pos SD/-His,-Ura 蓝阳性对照pLexA SD/-His,-Ura 白阴性对照PlexA-X SD/-His,-Ura 白没有直接激活活性PlexA-X SD/-His,-Ura 蓝具有直接激活活性PlexA-X SD/-His,-Ura 菌落不能生长酵母细胞毒性4-1. 如果pLexA-X -半乳糖苷酶的信号作用。
能够自动激活报告基因,则设法去除其激活活性部位、或者将LacZ报告基因整合入基因组,减少4-2. 如果pLexA-X虽然不会自动激活报告基因,但对酵母宿主细胞有毒性,则需要与纯化的文库DNA同时转化酵母。
5. 如果pLexA-X既不会自动激活报告基因,也不具有毒性,则可以与纯化的文库DNA同时、或顺序转化酵母细胞,并检测质粒转化效率。
转化质粒SD固体培养基LacZ表型对照1 pLexA-Pos Gal/Raf/-His/-Ura 蓝对照2 pLexA-53 Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu 蓝+pB42AD-T实验pLexA-X Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu 待测+pB42AD-文库5-1. 用SD/-His/-Trp/-Ura培养基选择阳性共转化子,并扩增,使宿主细胞中的质粒在诱导前达到最大拷贝数。
-半乳糖苷酶无表达。
5-2. 上述重组子转至含X-gal的固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu,观察LacZ及Leu报告基因的表达情形,蓝色克隆即为阳性。
白色克隆为假阳性,说明Leu虽有表达,但5-3. 同时用LacZ、Leu两个报告基因的目的,是为了尽可能消除实验的假阳性误差,譬如:AD融合蛋白不与目标蛋白结合,而直接与启动子序列结合域结合等情况。
由于2个报告基因的启动子不同,出现上述假阳性的几率就大大减少了。
5-4. 将蓝色阳性克隆进行1次以上的划种,尽可能分离克隆中的多种文库质粒。
6. 阳性克隆的筛选6-1. 随机选取50个阳性克隆,扩增、抽提酵母质粒,电转化E.coli KC8宿主菌,抽提大肠杆菌中的质粒,酶切鉴定是否具有插入片段及排除相同的文库质粒。
6-2. 如果重复的插入序列较多,可另取50个阳性克隆来分析。
最后得到数种片段大小不同的插入序列,再转化新的宿主细胞,检测是否仍为阳性克隆。
7. 用质粒自然分选法(Natural Segregation)筛除只含有AD-文库杂合子的克隆7-1. 将初步得到的阳性克隆接种SD/-Trp/-Ura液体培养基,培养1-2天,含有HIS3编码序列的BD-靶质粒在含有外源His培养基中,将以10%-20%左右的频率随机丢失。
C孵育2-3天。
7-2. 将上述克隆,转铺固体培养基SD/-Trp/-Ura,307-3. 再挑取生长的单克隆,转入SD/-Trp/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培养基中,筛选His表型缺陷的克隆,即得到只含有AD-文库杂合子的重组子。
7-4. 将His表型缺陷的克隆转化固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura,以验证AD-文库能否直接激活报告基因的表达,弃去阳性克隆,保留阴性克隆。
8. 酵母杂合试验(Yeast Mating)确定真阳性克隆如下表所示,在酵母EGY48及其对应的YM4271宿主细胞中分别转入相应的质粒或文库DNA,通过杂合实验确筛选pLexA-靶DNA与pB42AD-文库确实具有相互作用的真阳性克隆。
质粒1(in YM4271) 质粒2(in EGY48) LacZ表型Leu表型pLexA pB42AD 白不能生长pLexA-靶DNA pB42AD 白不能生长pLexA pB42AD-文库白不能生长pLexA-靶DNA pB42AD-文库蓝真阳性pLexA-Lam pB42AD-文库白不能生长9. 阳性克隆的进一步筛选和确证9-1. 扩增初步确定的阳性克隆,抽提酵母DNA。
该DNA为混合成份,既含有酵母基因组DNA,也含有3种转化的质粒DNA。
9-2. 将上述DNA电转化E.coli KC8宿主菌。
由于在大肠杆菌中,具有不同复制起始调控序列的质粒不相容;同时利用营养缺陷型筛选。
因此,在M9/SD/-Trp培养基上,只有含有AD-文库质粒的转化菌才能生长,将其扩增、并抽提质粒DNA,酶切鉴定。