分子遗传学作业

分子遗传学作业利用分子遗传学方法举例说明一般分子生物实验遗传研究的基本操作流程教师：张老师利用分子遗传学方法举例说明一般分子生物实验遗传研究的基本操作流程一，分子遗传学分子遗传学(molecular genetics)是指在分子水平上研究基因的结构与功能，以及遗传信息传递的学科。

包括DNA的复制、RNA 的复制和转录、翻译以及其调控等。

主要由正向遗传与反向遗传构成。

其中正向遗传是指通过生物个体或细胞的基因组的自发突变或人工诱变，寻找相关的表型或性状改变，然后从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应的突变基因，并揭示其功能。

例如遗传病基因的克隆。

反向遗传学是指人们首先是改变某个特定的基因或蛋白质，然后再去寻找有关的表型变化。

例如基因剔除技术或转基因研究。

简单地说，正向遗传学是从表型变化研究基因变化，反向遗传学则是从基因变化研究表型变化。

二，突变体的筛选简单的说是指通过特定选择性培养基（抗穗发芽培养基）培养植株然后选择出抗穗发芽突变体植株，让其继续生长繁殖，收取种子的过程。

三，遗传分析简单的说是指将上述与筛选得到的抗穗发芽植株进行农艺性状的调查（株高，小穗数调查等）然后进行数据的处理级关联分析。

四，遗传群体的构建简单的说是选取上诉抗穗发芽材料和一个极为相反的材料也就是极端材料杂交得到F1，然后将其自交得到F2群体即分离群体，或者让其自交5-6代得到高代群体即近等基因系群体。

五，遗传图谱的构建简单的说利用一定的杂交方法（如;早期单倍体杂交发，表形分析法，细胞学分析法）和分子生物学分析法（如，RFLP、AFLP、RAPD、STS、SNP、EST、SSR标记方法等）将基因定位在定的特定的染色体区段上的过程。

六，图位克隆图位克隆(Map - based cloning) 又称定位克隆(positional cloning) 1986 年首先由剑桥大学的Alan coulson 提出,用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的,无需预先知道基因的DNA顺序,也无需预先知道其表达产物的有关信息,但应有以下两方面的基本情况:一是有一个根据目的基因的有无建立起来的遗传分离群体,如F、DH、BC、RI 等。

二是开展以下几项工作:1) 首先找到与目标基因紧密连锁的分子标记;2)用遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体的特定位置;3) 构建含有大插入片段的基因组文库(BAC库或YAC);4)以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库;5) 用获得阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群;6) 通过染色体步行、登陆或跳跃获得含有目标基因的大片段克隆;7) 通过亚克隆获得含有目的基因的小片段克隆;8) 通过遗传转化和功能互补验证最终确定目标基因的碱基序列。

其原理是根据功能基因在基因组中都有相对稳定的基因座，再利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，从而构建目的基因区域的物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步移逐步逼近目的基因或通过染色体登陆的方法，最终克隆目的基因并通过遗传转化实验可以研究目的基因的功能。

七，基因功能的分析简单的说是借助于生物信息学的方法（如BLAST,GOFigure等）、生物学实验手段的方法（如：基因失活是功能分析的主要手段，转座子突变库的构建，内含子的归巢突变，基因的超表达用于基因功能的检测。

反义RNA功能和人工合成构建反义RNA等。

）和某些特殊方法（如：噬菌体展示,酵母双杂交，开放阅读框序列标签等）用已知功能的基因找出未知功能基因的分析方法。

八，以上研究流程，其中二到五这几个标题的研究属于正向遗传学研范畴，六属于反向遗传学的研究范畴，而七的些技术属于正向遗传学的研究范畴，有些属于反向遗传学的研究范畴。

以上2-7个标题即是分子遗传学为手段去研究生物学一般实验的基本操作流程。

我以标题的形式列出不易看出它们之间的联系，但实质上这些操作步骤都是分子遗传学研究由浅到深的研究过程。

九，参考文献及举例说明利用比较分子遗传学研究小麦穗发芽利用模式植物和动物遗传系统研究已经增强了人们对基因组如何调节表型规律的了解，在植物分子遗传学研究中，拟南芥已经被证明为一种非常有用的模式植物，有很多已经被表明了的重要的农艺基因都利用了拟南芥作为模式，大量拟南芥中许多与种子发育和发芽有关的突变体的探索与调查标明这种资源是可以利用的，利用比较分子遗传学方法，去鉴定候选位点可能在穗发芽（PHS）的规律和研究中发挥着重要的作用，讨论特殊的例子包括脱落酸敏感因子3（ABI3）和AUS3位点，编码一种包括高度保守的DNA连接蛋白，这种蛋白最初被表明是玉米中的VP-1转录因子，以及可能应用这个基因家族去操纵PHS，或者通过标记辅助育种或者转基因的方法。

利用模式植物和动物系统去研究遗传学和分子生物学已经加速着鉴定、了解和探索基因功能的过程，从DNA结构的阐明到最近出版的完整的少数的模式真核生物DNA序列（包括酵母、蠕虫、果蝇和人的基因组序列）这仅仅用了不到50年的时间，这些序列为后基因组学提供了基础，最终会使生命成长与发育过程中完整基因功能的了解，对于开花植物，在最近的30年里，拟南芥被用来作为一种广泛的在植物分子遗传学一直到最终的近期出版的完整核基因组序列的模式。

拟南芥在分析植物分子遗传学中被证明是有用的，有4个共同作用的原因，它非常适合作为分子遗传研究的模型，都因为它的生长习惯以及它的相对小的基因组大小，后一个特点使人们相对快的获得它完整基因组序列，第三，有大量相互关联的资源，包括利用序列标签进行基因插入收集，此外，有越来越多的数量的研究显著提高了拟南芥通过比较分子遗传学研究中作为基因分析中的作用。

例如，许多位点在拟南芥和金鱼草中被标明调控花的发育，编码非常相似蛋白的同源基因。

这些发现指引着一种广泛的花的发育模型（被称作ABC模型），描述了开花植物中花器官发育的调控。

另外一个例子，小麦Rht矮化位点，在1960年到1970年之间引发了增加小麦产量的“绿色革命”的基因位点，通过比较的方法利用拟南芥中的突变体gai被克隆出来，这种突变体基因和小麦中的Rht1的等位基因有相似的表型，GAI基因在小麦中引导编码一种非常相似的蛋白的基因rht1，类似的玉米中D8基因，此外，转化实验表明带有突变等位基因的水稻显示了矮小的表型。

其他研究也表明了其他的发育过程被高度保守的基因控制，例如，玉米的顶端优势被tb1位点调控，这个位点会导致驯化过程中生长习惯的转换，以及显示出了和金鱼草CYCLOIDEA基因的同源性，在花器官发育中发挥着作用。

最后，最近的研究表明开花植物的叶子发育可能被高度保守的因子调控，即拟南芥基因AS1编码一种的myb DNA结合蛋白，这种结合蛋白与金鱼草基因PHANTASTICA和玉米中的ROUGH SHEATH2基因密切相关。

这些研究显示了重要的调控因子的基因和蛋白结构在开花植物中非常的保守，启发了调节分子的作用和发育途径是保守的，这意味着通过拟南芥（和其它植物遗传学模式系统）获得的分子遗传学信息增益去理解其他物种中调节重要途径的基因功能是可能的！尤其是通过这种方法或者通过转基因方法和标记辅助育种程序，依据这种分子遗传学信息增益操纵重要的农艺学过程。

然而比较分子遗传学和基因组学方法在拟南芥中是快速发展的，但是对于其他作物而言却并不是这样的，这是因为许多种植物种是多倍体，包含非常大的基因组，对分子遗传学的技术手段是非常有抵抗力的（包括遗传转化），玉米在古典上作为遗传模型受到很多的关注，所以玉米存在大量的分子遗传学资源，相似的，水稻快速的被拿来作为草的遗传学的模型(包括近期完成的基因组序列模拟图)，尽管作为世界上最大产量的谷类作物，小麦分子遗传学和基因组学的发展现在仅仅处于起步期，主要是他复杂的基因组和它三个亚基因组拷贝所导致（其基因组大小大约为拟南芥的100倍，是水稻的40倍），尽管很复杂，小麦基因的研究通过同线型已经得到很大的促进（物种之间存在染色体的位置以及染色体上基因的定位是保守的），这允许我们依据玉米和水稻来分析小麦的基因功能和比较位点图谱。

小麦基因组的资源在不断的增多，包括可用的从缺失系获得的物理图谱，大量插入的文库和大量的EST位点序列数据，最近提出了几个国家的计划将在不久的将来使小麦中的资源大大的增多，这些资源，可以与其他物种的可利用的资源相结合，以及技术发展（包括遗传转化、发觉更多的多倍体祖先物种更简单的遗传学以及转座子标签系统的发展）将很快提供给研究人员重要的工具去研究小麦功能基因组。

拟南芥的发芽分子遗传学先前的研究已经表明可以利用比较分子遗传学去鉴定重要的农艺基因，因此可以问利用植物模型中已存在分子遗传学信息去研究小麦穗发芽是否可行，特别是去鉴定一些转换过程如从胚胎成熟、籽粒成熟到发芽和幼苗形成中的重要的调节因子作为潜在的候选基因，这些过程中的发生在拟南芥中已经被研究的非常透彻，在拟南芥中有许多已经得到表明的突变位点影响着从种子发育到发芽的过程，这些已经被表述为“特有的种子”的位点依据其行为分为两类，一些在种子发育过程中高度的多向性，另一些有更多的受限制的行为，例如，ABI3、LEC1、LEC2和FUS3位点突变会导致种子中胚胎表型像籽苗，然而其他位点的突变（包括COMATOSE）会抑制发芽，通过突变发鉴定的其他位点调节着生物合成途径和激素的行为，这些激素包括脱落算、赤霉素、乙烯和油菜素内酯，还包括代谢分子（如葡萄糖），母体效应的位点同样会影响种子发芽的表型，通过这些表型突变体的逐一的和连续的分析，可以去假设这些转化是被相反的调节因子所控制，或者抑制或者增强发芽潜能，许多位点（包括ABI3, LEC1,LEC2 and FUS3）有着双重职能，既能抑制发芽又能促进胚胎成熟过程，因此在种子脱落之前这些功能会防止未成熟的芽发育形成胚！有大量的位点（包括ABI3, LEC1, LEC2和FUS3）已经被克隆出来了，编码转录因子，像蛋白质一样的转录因子，表明许多与调节发芽有联系的过程是在转录水平上调控的，激活和抑制基因转录是这些转变过程中的重要控制程序，有趣的是已经表明ABI3, FUS3和LEC2位点是编码包含保守域的蛋白与最初被鉴定是起源于玉米的VP-1转录因子的区域（B3结构域域）非常相似，这个转录因子已经被用来编码一个序列特异性非常高的DNA连接行为。

Vp-1和ABI3蛋白在其他一些结构域（称为B1和B2）有着非常高的序列相似性，这两种突变体的表型是非常相似的（包括未成熟的芽、对ABA的不敏感、调控特异基因表达），这表明他们是同源的。

它们蛋白质结构、同源基因突变体的表型的相似性表明这个位点是植物种子到幼苗转变过程中的主要调控调节因子，其他发现的一些与B3结构域具有同源性的蛋白也表明这些蛋白在调控种子成熟和发芽的过程中发挥着重要的作用，可能是在这些过程中发挥作用的作为顺式作用元件的DNA连接蛋白，而这些顺式作用元件位于下游基因启动子，近期的工作表明“Ry图形”（由CATGCATG的变异组成）在许多具体的种子中基因正确转录中是必须的，这些行为是由ABI3 and FUS3共同调节的，而实际上在拟南芥的基因组中显示这些元件是位于许多基因的上游，大量的研究表明在突变体背景下许多基因的表达发生了改变，与应用基因芯片方法获得的其他结果相联系可以去可以去界定有哪些基因被这些因子所调节，还可以去鉴定这些目标基因在配萌发过程中抑制发芽的机制。