酶工程 细胞工程产酶
现代生物技术
现代生物技术摘要：现代生物技术，主要包括五项技术：基因工程，细胞工程，酶工程，蛋白质工程，发酵工程。
五项技术的应用十分广泛，在人们的生产生活中占有重要地位。
关键词：基因工程细胞工程酶工程蛋白质工程发酵工程应用随着时代的发展，现代生物技术在人们的生活中也越来越重要了。
现代生物技术对解决人类面临的重大问题如：粮食、健康、环境和能源等将开辟广阔的前景，因此越来越为各国政府和企业界所关注，现代生物技术已经与信息、新材料和新能源技术并列成为影响国计民生的四大科学技术支柱，是21世纪高新技术产业的先导。
生物技术(biotechnology),也称生物工程(bioengineering)，指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品的技术。
生物技术是由多个学科综合而成的一门新学科。
主要包括以下5项技术：1.基因工程（gene engineering）2.细胞工程（cell engineering）3.酶工程（enzyme engineering）4.发酵工程（fermentation engineering）5.蛋白质工程（protein engineering ）。
一、基因工程基因工程原称遗传工程。
从狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。
广义的基因工程定义为DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术指的是外源基因重组、克隆和表达的设计与构建；而下游技术则涉及到含有重组外源基因的生物细胞的大规模培养以及外源基因表达产物的分离纯化过程。
基因工程之所以能够实现，主要有六个原因：1.不同基因具有相同的物质基础；2. 基因是可切割的；3. 基因是可以转移的；4. 多肽和基因之间存在对应关系；5. 遗传密码是通用的；6. 基因可以通过复制把遗传信息传给下一代。
第四章 酶工程
丙酮酸+CO2+ATP+H2O 草酰乙酸+ADP+Pi
正反应、逆反应都用同一名称
DH2+NAD+D+NADH+H+
DH2NAD+氧化还原酶
各大类酶的 特殊命名规则
转移酶为供体 受体被转移 基团转移酶
氧化还原酶往往可 命名为供体受体 氧化还原酶，
值得注意的是来自不同物种或同 一物种的不同组织或不同细胞器 的同一种酶，虽然他们催化同一 个生化反应，但它们本身的一级 结构可能并不相同，命名也有所 区别
酶的一级结构
酶的二级结构
多肽链主 链原子的 局部空间 排列
酶的 二级 结构
螺旋结构 β-折叠
没有考虑到它的侧链的构象 或与其它部分的相互关系
酶蛋白的-螺旋结构
酶蛋白的折叠结构
由-螺旋、折叠和随机结构 构成的溶菌酶的空间结构
酶的三级结构
指单一的多肽链 或共价连接的多 肽链中，所有原 子在空间上的排 列
酶活性中心示意图
酶的活性中心构成
酶分子中的 氨基酸残基
酶 的 活 性 中 心
辅酶或辅助因子 或它们的部分 结构
酶的结构
四级结构
二级结构
酶的结构
三级结构
一级结构
酶的一级、二级、三级和四级结构示意图
酶的空间结构
三级结构
二级 结构
酶工程 复习资料
第一章绪论1.何谓酶工程，试述其主要内容和任务。
酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。
酶工程的主要内容包括：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水相催化，酶定向进化，酶反应器和酶的应用等。
酶工程的主要任务是经过预先设计，通过人工操作获得人们所需的酶，并通过各种方法使酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。
2.酶有哪些显著的催化特性？酶是生物催化剂，与非酶催化剂相比，具有专一性强、催化效率高和作用条件温和等显著特点。
3.简述影响酶催化作用的主要因素。
酶的催化作用受到底物浓度、酶浓度、温度、pH、激活剂浓度、抑制剂浓度等诸多因素的影响。
5.简述酶活力单位的概念和酶活力的测定方法。
酶活力单位：在特定条件下（温度可采用25℃，pH等条件均采用最适条件），每1min催化1μmol的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位，这个单位称为国际单位（IU）。
在特定条件下，每秒催化1mol底物转化为产物的酶量定义为1卡特（kat）酶活力的测定方法：振荡测定法，酶柱测定法，连续测定法，固定化酶的比活力测定，酶结合效率与酶活力回收率的测定，相对酶活力的测定。
或者测定方法：化学测定法、光学测定法、气体测定法其它.酶的发展历史：4000多年前的夏禹时代——酿酒技术。
3000多年前的周朝——制造饴糖、食酱等食品。
1833年——佩恩和帕索兹从麦芽的水抽提物中得到淀粉酶。
19世纪中叶——巴斯德对酵母的乙醇发酵进行研究。
1913年——米彻利斯和曼吞根据中间产物学说，推导出米氏方程。
1926年——萨姆纳得到脲酶结晶，并证明它具有蛋白质的性质。
1960年——雅各和莫诺德提出操纵子学说。
1982年——切克发现核酸类酶。
1983年——阿尔特曼发现核糖核酸酶P的RNA 部分M1RNA具有核糖核酸酶P的催化活性。
酶的专一性分为绝对专一性和相对专一性。
相对专一性又可分为键专一性和基团专一性米氏方程：酶的可逆性抑制作用可以分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制。
酶工程
细胞呼吸强度Qo2：是指单位细胞量在单位时间内的耗氧量。
细胞浓度Cc:指的是单位体积培养液中细胞的量。 Ko2=Qo2?Cc
溶氧速率Kd：是指单位体积的发酵液在单位时间内溶解氧的量。调节溶解氧的方法：1、调节通气量 2、调节氧的分压 3、调节气液接触时间 4、调节气液接触面积 5、改变培养基的性质
12、简述影响酶提取的主要因素？答：影响酶提取的主要因素：酶在所使用的溶剂中的溶解度以及酶向溶剂相中扩散的速度。①温度：对酶的提取效果有明显影响。适当提高温度，可提高酶的溶解度，也可增大酶分子的扩散速度，但温度过高，易引起变性失活。0-10℃。②pH：溶液的pH值对酶的溶解度和稳定性有显著影响，为提高酶的溶解度,提取时pH值应避开酶的等电点。③体积：增加提取液用量可提高酶的提取率。提取液的总量一般为原料体积的3-5倍。在酶的提取过程中，含酶原料的颗粒体积越小，则扩散面积越大，有利于提高扩散速度。适当的搅拌，可以使提取液中的酶分子迅速离开原料颗粒表面，从而增大两相界面浓度差，有利于提高扩散速率。适当延长提取时间，可以使更多的酶溶解出来，直至达到平衡。在提取过程中，为了提高酶的稳定性，免致在引起酶的变性失活，可适当加入某些保护剂。
名词解释
酶：具有生物催化功能的生物大分子。
酶工程：酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。
酶活力：指在一定条件下，酶所催化的反应初速度。
酶比活：指在特定条件下，单位质量蛋白质或RNA所拥有的没活力单位数。常用来表示酶的纯度。
酶的生产：是指通过各种方法获得人们所需的酶的技术过程，主要包括微生物发酵产酶、动植物培养产酶和酶的提取与分离纯化等。酶的生产方法：提取分离法、生物合成法、化学合成法。
酶工程2-2 常用的产酶微生物
3. 红曲霉(Monascus)
• 红曲霉: 菌落初期白色, 老熟后变为淡粉色、紫 红色或灰黑色,通常形成红色色素。菌丝具有隔膜, 多核, 分支甚繁。分生孢子着生在菌丝及其分支 的顶端, 单生或成链, 闭囊壳球形, 有柄, 其内 散生10 多个子囊, 子囊球形, 内含8 个子囊孢子, 成熟后子囊壁解体, 孢子则留在闭囊壳内。
细 菌
1. 大肠杆菌( Escherichia coli)
• 形态：呈杆状, 有的近似球状, 大小为0. 5μm ×1～3 μm , 一般无荚膜, 无芽孢, 运动或不运动, 运动者周生鞭毛。菌 落从白色到黄白色, 光滑闪光, 扩展。
• 革兰氏染色阴性。 • 产生的酶一般都属于胞内酶, 需要经过细胞破碎才能分离 得到。 • 采用大肠杆菌生产的限制性核酸内切酶、D N A 聚合酶、 D N A 连接酶、核酸外切酶等, 在基因工程等方面广泛应 用。
• 枯草杆菌是应用最广泛的产酶微生物, 可以用于生产α-淀 粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、5′-核苷酸酶和碱性磷酸酶 等。 例如,枯草杆菌BF7658 是国内用于生产α-淀粉酶的 主要菌株;枯草杆菌AS1.398用于生产中性蛋白酶和碱性磷酸 酶。 • 枯草杆菌生产的α-淀粉酶和蛋白酶等都是胞外酶, 而其产 生的碱性磷酸酶存在于细胞间质之中。
霉 菌
1. 黑曲霉( Aspergillus niger)
• 是曲霉属黑曲霉群霉菌。
• 菌丝体由具有横隔的分支菌丝构成, 菌丛黑褐色, 顶囊大球形, 小梗双层, 分生孢子球形, 平滑或 粗糙。 • 黑曲酶可用于生产多种酶, 有胞外酶也有胞内酶。 例如, 糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、 葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核糖核酸酶、脂肪 酶、纤维素酶、橙皮苷酶和柚苷酶等。
酶工程第二章微生物发酵产酶
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参与白酒生产中的微生物
1.霉菌
白酒生产常见的霉菌菌种：曲霉、根霉、念珠霉、青
霉、链孢霉等。
2.酵母菌
常见的酵母菌菌种：酒精酵母、产酯酵母、假丝酵母
采用固态配醅发酵，发酵物料的含水量较低，常 控制在55%～65%；
在较低温度下边糖化边发酵，保证酶和酵母的活 性，有利于香味物质的形成和累积；
多种微生物混合发酵，保证有益微生物正常生长 繁殖和发酵代谢；
固态甑桶蒸馏提取成品酒。大曲酒酿造分为清渣 法和续渣法两种。
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大曲分类（按微生物来源）
传统大曲，菌种来源于大自然。 强化大曲，人工接入某些特殊菌种，使大曲在
糖化力、发酵力或产香方面更加突出。 纯种大曲，采用多菌纯种培养大曲，该大曲出
酒率高，是今后发展方向。
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大曲分类（按制曲温度分）
高温大曲，培养制曲的最高温度在60℃以上，酱 香型和部分浓香型大曲酒，采用此大曲。
用的碳源等）经过分解代谢产生的物质阻遏某 些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。 例如：葡萄糖阻遏 – 半乳糖苷酶的生物合成。
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转录水平的调节——操纵子学说
转录水平的调节机制 2、酶生物合成的诱导作用 加入某些物质使酶的生物合成开始或加速进行
的现象，成为酶生物合成的诱导作用，简称为 诱导作用。 如：乳糖诱导分解乳糖相关酶的产生。
第二章 微生物发酵产酶
南京林业大学酶工程-3 动、植物细胞发酵产酶讲解
一般为无机氮源。 一般以蔗糖为碳源。
植物细胞培养的工艺条件及其控制（续）
（三）温度的控制 室温（25℃）、 （四）pH值的控制 微酸性（pH5～6） （五）溶解氧的调节控制 代谢慢，耗氧少，对剪切力敏感，搅拌不宜强烈。 （六）光照的控制 （七）前体的添加 提高次级代谢物的产量。 （八）刺激剂(electior)的应用 强化次级代谢产物的生物合成。常用微生物细胞 壁碎片和胞外酶。
动、植物细胞培养与微生物培养区别
动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固 体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨 基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血 清。动物细胞对环境敏感，包括pH、溶氧、温度、剪 切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测 和控制。 植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但由于植物细 胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养 产物，以及植物细胞生长较微生物要缓慢，长时间的 培养对无菌要求及反应器的设计也提出特殊的要求。
紫草宁及其结构
植物细胞培养的特点（续）
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（2）缩短周期 发酵周期10～30天，种植周期几个月～几年。 （3）易于管理 减低劳动强度；不受地理环境和气候条件等影响。 （4）提高产品质量 主要产物浓度高，易于分离纯化，减少环境中各种有 害物质污染和侵蚀。 （5）其它 生物反应器的设计工艺条件注意的问题。
主要产物
醇类，有机酸， 色素，香精， 激素，疫苗， 氨基酸，抗生素， 药物，酶 单克隆抗体， 酶，核苷酸 酶
二、植物细胞培养的特点
（1）提高产率
例如,紫草宁(shikonin) 生产，发酵细胞中的紫 草宁比 紫菜根 (Lithospermum erythrorhizon)中高10 倍，比产率达到种植紫 草的830倍。
生物技术基础名词解释
第一章1、现代生物技术:也称生物工程;在分子生物学基础上建立的创建新的生物类型或新生物机能的实用技术,是现代生物科学和工程技术相结合的产物;2、基因重组：gene recombination 造成基因型变化的核酸的交换过程;3、酶工程：enzyme engineering 酶制剂在工业上的大规模应用,主要由酶的生产、酶的分离纯化、酶的固定化和生物反应器四个部分组成;4、蛋白质工程：protein engineering 按人们意志改变蛋白质的结构和功能或创造新的蛋白质的过程;5、快速无性繁殖：7、生物工程：bioengineering应用生命科学及工程学的原理,借助生物体作为反应器或用生物的成分作工具以提供产品来为社会服务的生物技术;包括基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程等;8、细胞工程：cell engineering应用细胞生物学和分子生物学的方法,通过类似于工程学的步骤在细胞整体水平或细胞器水平上,遵循细胞的遗传和生理活动规律,有目的地制造细胞产品的一门生物技术;9、发酵工程：是指采用现代工程技术手段,利用微生物的某些特定功能,为人类生产有用的产品,或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术;10、转基因工程：转基因工程又叫重组DNA技术,重组是指在体外将分离到的或合成的目的基因object gene,通过与质粒、病毒等载体vector重组连接,然后将其导入不含该基因的受体细胞host cell,使受体细胞产生新的基因产物或获得新的遗传特性;11、生物固氮：是指固氮微生物将大气中的氮气还原成氨的过程;12、人类基因组计划：human genome project于20世纪80年代提出,由美、英、日、中、德、法等国参加并于2001年完成的针对人体23对染色体全部DNA的碱基对3×109序列进行排序,对大约25 000基因进行染色体定位,构建人类基因组遗传图谱和物理图谱的国际合作研究计划;13、愈伤组织：callus;calli复原指植物体的局部受到创伤刺激后,在伤口表面新生的组织;它由活的薄壁细胞组成,可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞;现多指切取植物体的一部分,置于含有生长素和细胞分裂素的培养液中培养,诱导产生的无定形的组织团块;第二章一、名词解释1 、DNA变性：在某些理化因素作用下,DNA双链解开成两条单链的过程叫DNA的变性;DNA的变性是DNA二级结构破坏、双螺旋解体的过程;DNA的变性中以DNA的热变性最常见; 1.增色效应：DNA变性时其溶液0D260增高的现象; ：热变性的DNA 是在一个相当窄的温度范围内完成;在这一范围内;医学教`育网搜集整理紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度,又称融解温度meltingtemperature,Tm;其大小与G+C含量成正比;2、复制子：replicon是DNA复制是从一个DNA复制起点开始,最终由这个起点起始的复制叉完成的片段;DNA 中发生复制的独立单位称为复制子;每个复制子使用一次,并且在每个细胞周期中只有一次;3、启动子：promoter DNA分子上能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的区域,在许多情况下,还包括促进这一过程的调节蛋白的结合位点;4、内含子：introns是真核生物细胞DNA中的间插序列;这些序列被转录在前体RNA中,经过剪接被去除,最终不存在于成熟RNA分子中;内含子和外显子的交替排列构成了割裂基因,在前体RNA中的内含子常被称作“间插序列”;5、限制性内切酶：生物体内可以识别并切割特意的双链DNA序列的一种内切核酸酶,简称限制酶;它们能将外来的DNA切断,即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力,但对自己的DNA却无损害作用,这样可以保护细胞原有的遗传信息;6、酶切位点：DNA上一段碱基的特定序列,限制性内切酶能够识别出这个序列并在此将DNA序列切成两段;7、PCR：聚合酶链式反应,其英文Polymerase Chain Reaction是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火复性及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点;它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．8、基因克隆载体：在基因工程重组DNA技术中将DNA片段目的基因转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子;三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒;9、质粒：细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子,能稳定地独立存在于染色体外,并传递到子代,一般不整合到宿主染色体上;现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的,常含抗生素抗性基因,是重组DNA技术中重要的工具;10、Ti质粒：Ti-plasmid根瘤农杆菌染色体外的环状双链DNA质粒,能诱导植物产生异常氨基酸和冠瘿碱或二者之一,并诱生冠瘿瘤;11、噬菌体载体：12、基因芯片：gene chip固定有寡核苷酸、基因组DNA或互补DNA等的生物芯片;利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交,可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析;13、cDNA文库：cDNA library：是以特定的组织或细胞mRNA为模板,逆转录形成的互补DNAcDNA与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群,这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库;cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中,在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因,因此cDNA文库具有组织或细胞特异性;14、转化：transformation是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表型发生相应变化的现象;15、转导：transduction由噬菌体将一个细胞的基因传递给另一细胞的过程;它是细菌之间传递遗传物质的方式之一;其具体含义是指一个细胞的DNA或RNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中;16、克隆子：摄取外源DNA并令其稳定维持的受体细胞;17、报告基因：reporter gene是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因,也就是说,是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因;把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因,或与其它目的基因相融合,在调控序列控制下进行表达,从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控,筛选得到转化体;18、DNA杂交：DNA hybridization一种用互补碱基配对的程度,来分析不同生物品种来源的两条或多条DNA链间彼此关系密切程度的实验技术;19、southern印迹杂交：利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段,将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上,经干烤或者紫外线照射固定,再与相对应结构的标记探针进行杂交,用放射自显影或酶反应显色,从而检测特定DNA分子的含量;20、northern印迹杂交：一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法;RNA印迹技术正好与DNA相对应,故被称为Northern印迹杂交,与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot;二、思考题1、基因工程操作流程目的基因或DNA片段的获取、重组DNA分子的构建、重组DNA分子引入受体细胞、目的基因或DNA片段的扩增或表达;2、原核生物与真核生物基因及转录的区别基因的区别：真核生物基因编码区有内含子与外显子的区别,内含子不能编码蛋白质；原核生物没有内含子;转录的区别：1真核生物有由核膜包裹的细胞核,因此,基因的转录和翻译有时间和地点的差别；而原核生物没有细胞核,转录和翻译可以同时同地点进行;2真核生物基因有内含子,转录所得的前提mRNA需要经过修饰,除去由内含子转录得到的mRNA序列而得到成熟mRNA；原核生物基因因没有内含子,转录得到的mRNA不需要经过修饰;3、EcoR1的识别序列,酶切位点EcoR1是从大肠杆菌R菌株中分离出来的第一个限制酶,EcoR表示是从大肠杆菌的R型菌株分离来的,“Ⅰ”表示是从大肠杆菌R菌株中分离出来的第一个限制酶;EcoR1切割序列,切割位点在G与A之间,形成黏性末端;4、PCR基本原理PCR是一种体外DNA 扩增技术,是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下,依赖于DNA聚合酶的酶促合反应,将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环,使DNA片段在数量上呈指数增加,从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段;5、MCS连杆衔接头6、PBR322、λ噬菌体载体、cosmid载体、YAC载体的结构、特点、主要用途PBR322质粒：大小为4362bp,含有两个抗药性基因,一个复制起始点和多个用于克隆的限制酶切点;有7种限制酶的识别位点位于四环素抗性基因内部,,两种限制酶识别位点位于该基因启动区内,3种限制酶识别位点位于氨苄青霉素抗性基因内;λ噬菌体载体：λ噬菌体的基因组长达50 Kb,共61个基因,其中38个较为重要;可分为裂解周期和溶原周期;细菌处于溶原化状态时,细胞质中有一些λ CI基因的产物CI蛋白,这是一种阻遏蛋白,可以阻止λ左、右两个早期起动子的转录,使之不能产生一些复制及细胞裂解的蛋白;λ的DNA随着宿主的染色体复制而复制;但在UV诱导下Rec蛋白可降解CI蛋白诱导90％的细胞裂解;有时λ也可自发地从宿主的染色体上游离出来,进行复制,最终导致宿主细胞的裂解,此称为治愈curing;游离在细胞质中的λ可以进行滚环复制,产生多个拷贝,并合成头部和尾部蛋白,包装成完整的λ噬菌体,使细胞裂解,释放出λ噬菌体再感染新的细胞;因为λ噬菌体的DNA也有整合在染色体上和游离于细胞质中两种状态,所以也称做附加体;但和F因子不同,λ噬菌体有细胞外形式,而F因子无细胞外形式;cosmid载体：cosmid 是英文 cos site-carrying plasmid 的缩写, 也称粘粒、柯斯载体;本意是带有粘性末端位点的质粒, 因此, 柯斯质粒是人工建造的的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体;这是一类用于克隆大片段DNA的载体,它是由λ噬菌体的coscohesive末端及质粒plasmid重组而成的载体;cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及λ噬菌体用于包装的cos末端等,因此该载体在体外重组后,可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装,利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞;但它不会产生子代噬菌体,而是以质粒DNA的形式存在于细胞内; 柯斯质粒的构建一般都是利用质粒的复制子、选择标记, 加上λ的cos位点序列及与包装有关的序列,构建的科斯质粒可以很好地用于基因克隆;YAC载体：YAC含有酵母染色体端粒telesome、着丝点centromere及复制起点等功能序列,可插入长度达200-500kb 的外源DNA,导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆,成为人基因组研究计划的重要7、获取目的基因的途径基因组文库与cDNA基因文库中基因的区别获取目的基因的途径：从生物基因组中直接分离目的基因、人工合成目的DNA片段、PCR反应合成目的DNA、mRNA差异显示法获得目的基因;将某种生物的DNA全部提取出来,选用适当的限制酶,将DNA切成一定范围大小的DNA片段,然后,将这些DNA片段分别与载体连接起来,导入受体菌的群体中储存,每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段;也就是说,这个群体包含了这种生物的所有基因,叫做生物的基因组文库;cDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板,逆转录形成的互补DNAcDNA与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群,这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库;8、常用选择标记报告基因及其用途最常用的报告基因大多是编码抗生素抗性蛋白的基因,通过检查产物是否具有抗生素的抗性来确定基因的表达情况;1、氯霉素乙酰基转移酶CAT：可催化乙酰CoA的乙酰基转移到氯霉素3羟基,而使氯霉素解毒;CAT在哺乳细胞无内源性表达,性质稳定,半衰期较短,适于瞬时表达研究;可用同位素、荧光素和酶联免疫吸附测定enzyme—linkedimmunosorbantassay,ELISA检测其活性,也可进行蛋白质印迹Westernblotting和免疫组织化学分析;CAT与其他报告基因相比,线性范围较窄,灵敏性较低;2、β半乳糖苷酶：可催化半乳糖苷水解;最大优势是易于用免疫组织化学法观测其原位表达,是最常用的监测转染率的报道基因之一;3荧光素酶：将荧光素酶报告基因载体转染到细胞中,可用荧光素酶检测系统灵敏方便地测定荧光素酶基因的表达;4、分泌型碱性磷酸酶SEAP：SEAP可催化D—荧光素—O—磷酸盐水解生成D—荧光素,后者又可作为荧光素酶的底物,此即两步生物发光法检测酶活性的原理;此方法灵敏度高,接近于荧光素酶报告基因的检测;还可用一步化学发光法检测酶活性;作为报告基因,在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：1已被克隆和全序列已测定； 2表达产物在受体细胞中本不存在,即无背景,在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物； 3其表达产物能进行定量测定;9、鉴定重组子的方法第三章1、细胞工程：应用细胞生物学和分子生物学的方法,通过类似于工程学的步骤在细胞整体水平或细胞器水平上,遵循细胞的遗传和生理活动规律,有目的地制造细胞产品的一门生物技术;2、细胞融合：细胞融合是在自发或人工诱导下,两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞;3、组织培养：应用无菌操作方法培养生物的离体器官、组织或细胞,使其在人工条件下生长和发育的技术;4、次生代谢产物：次生代谢产物Secondary metabolites是由次生代谢Secondary metablism产生的一类细胞生命活动或植物生长发育正常运行的非必需的小分子有机化合物,其产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性;5、原生质体：protoplast脱去细胞壁的植物、真菌或细菌细胞;是一生物工程学的概念;动物细胞也可算做原生质体;6、不对称融合：7、抗性互补筛选：8、体细胞无性系变异：9、人工种子：通过组织培养技术,把植物组织的细胞培养成在形态及生理上与天然种子胚相似的胚状体,也叫作体细胞胚;这种体细胞胚有于叶、根、茎分生组织的结构;科学家把体细胞胚包埋在胶囊内形成球状结构,使其具备种子机能;10、单克隆抗体技术：将产生抗体的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞杂交,获得既能产生抗体,又能无限增殖的杂种细胞,并生产抗体的技术;11、原生质体培养：将细胞去除细胞壁后形成裸露的原生质体,把原生质体放在无菌的人工条件下使其生长发育的技术;原生质体培养的其特点是：①比较容易摄取外来的遗传物质,如DNA；②便于进行细胞融合,形成杂交细胞；③与完整细胞一样具有全能性,仍可产生细胞壁,经诱导分化成完整植株:12、分批发酵：指发酵过程中一次投料,一次接种,一次收获的间歇培养;在分批发酵中细胞、基质、产物浓度均随时间而不断变化;:13、抗生素：抗生素的概念：抗生素antibiotics是由微生物包括细菌、真菌、放线菌属或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物,能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质;抗生素的作用机理：抗生素等抗菌剂的抑菌或杀菌作用,主要是针对“细菌有而人或其它高等动植物没有”的机制进行杀伤,有4大类作用机理：1、阻碍细菌细胞壁的合成,导致细菌在低渗透压环境下膨胀破裂死亡,以这种方式作用的抗生素主要是β-内酰胺类抗生素;哺乳动物的细胞没有细胞壁,不受这类药物的影响;2、与细菌细胞膜相互作用,增强细菌细胞膜的通透性、打开膜上的离子通道,让细菌内部的有用物质漏出菌体或电解质平衡失调而死;以这种方式作用的抗生素有多粘菌素和短杆菌肽等;3、与细菌核糖体或其反应底物如tRNA、mRNA相互所用,抑制蛋白质的合成——这意味着细胞存活所必需的结构蛋白和酶不能被合成;以这种方式作用的抗生素包括四环素类抗生素、大环内酯类抗生素、氨基糖苷类抗生素、氯霉素等;4、阻碍细菌DNA的复制和转录,阻碍DNA复制将导致细菌细胞分裂繁殖受阻,阻碍DNA转录成mRNA 则导致后续的mRNA翻译合成蛋白的过程受阻;以这种方式作用的主要是人工合成的抗菌剂喹诺酮类如氧氟沙星;。
酶工程思考题有答案
一、什么是生物工程？简述现代生物工程的体系组成。
生物工程（B i oe n g i n e e ri ng ）又称生物技术或生物工艺学，是20 世纪70 年代发展起来的一门新的综合性应用科学,是基于分子生物学和细胞生物学的新兴技术领域。
通常把生物技术分为发酵工程、酶工程、基因工程、细胞工程四个分科，它们相互依存，相互促进。
其中，酶工程是生物工程的重要组成成分。
二、什么是酶工程？研究酶与酶工程的意义？酶工程是随着酶学研究迅速发展，特别是酶的应用推广使酶学与工程学相互渗透结合，发展而成的新的技术科学，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的边缘科学技术。
它是从应用的目的出发研究酶，是在一定生物反应装置中利用酶的催化性质，将相应原料转化为有用物质的技术。
酶工程包括下列主要内容（酶的产生酶的制备酶和细胞固定化酶分子改造有机介质中的酶反应酶反应器抗体酶酶传感器酶技术应用）酶与酶工程研究的重要意义:1研究酶的理化性质及其作用机理，尤其是从酶分子水平去探讨酶与生命活动、代谢调节、疾病、生长发育的关系，具有重大科学意义。
2酶是分子生物学研究的重要工具，限制性内切酶H in d Ⅱ的发现使核酸序列测定有了突破，促进了DN A 重组技术的诞生，推动了基因工程的发展3酶的高效率、专一性及不需要高温高压或强酸强碱的反应条件，对普通的化学催化反应产生了决定性的飞跃。
它丰富充实了现代化学中的催化理论4酶在工、农、医各方面都应用已久。
现在，从与人们生活休戚相关的衣食住行到各行各业的高技术革命，几乎都与酶有关。
三、酶作为生物催化剂的显著特点是什么？影响酶活性的因素有哪些？催化效率高；高专一性；易失活；调节性。
（1．酶浓度的调节 2. 激素调节 3. 共价修饰调节 4. 限制性蛋白水解作用与酶活力调控 5. 抑制剂的调节 6. 反馈调节 7. 金属离子和其他小分子化合物的调节）？除[E]、[S]外，外界因素：温度、pH、激活剂、抑制剂？四、解释典型的（米氏）酶动力学曲线，K m、K s、V max和k cat的定义是什么？说明这些常数之间的关系？K m：反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。
酶工程小知识点
一小知识点1、生物技术（生物工程）的四大支柱：基因工程，细胞工程，酶工程，发酵工程2、最早的酶学试验：1783年，意大利科学家Spallanzani（斯帕兰札尼）鸟的胃液能将肉类分解消化3、酶的最早发现者：1810年，药物学家Planche在植物的根中发现能使创木脂氧化变蓝的物质4、确立了酶的化学本质：1930年，美国的生物化学家Northro p（诺斯罗普）分离得到了胃蛋白酶（pepsin）、胰蛋白酶（trypsin）、胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）结晶，~。
5、酶分两大类：蛋白类酶（P酶），核酸类酶（R酶）6、两种途径获得抗体酶：①采用过渡态的底物类似物诱导；②在现有的抗体基础上，通过化学修饰或通过蛋白质工程向其配体结合部位导入催化基团。
7、化学酶工程（初级酶工程）：酶化学与化学工程技术相结合的产物，主要研究内容：酶的制备、酶的分离纯化、酶与细胞的固定化技术、酶分子修饰、酶反应器和酶的应用。
8、生物酶工程（高级酶工程）：在化学酶工程基础上发展起来的、酶学与现代分子生物学技术相结合的产物。
1）用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）2）用蛋白质工程技术定点改变酶结构基因（突变酶）3）设计新的酶结构基因，生产自然界从未有过的性能稳定、活性更高的新酶。
9、根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类：氧化还原酶Oxidoreductase转移酶Transferase水解酶hydrolase裂合酶Lyase异构酶Isomerase合成酶Ligase or Synthetase10、核酸类酶（R酶）的分类：剪切型核酶（自体催化，异体催化剪切型）剪接型核酶（I类内含子（IVS）的自我剪接需要鸟苷酸或鸟苷以及镁离子参与，Ⅱ类内含子的自我剪接催化的剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参加，但仍需要镁离子(Mg2+)。
）11、酶两种构成：a简单蛋白质，b结合蛋白质（全酶）= 酶蛋白+ 辅因子12、辅因子：辅酶，辅基，金属激活剂三类13、酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分。
酶工程 1~10章题目及答案
第一章绪论试题精选一、名词解释1、酶2、酶工程3、核酸类酶4、蛋白类酶5、酶的生产6、酶的改性7、酶的应用8、酶的专一性9、酶的转换数二、填空题1、根据分子中起催化作用的主要组分的不同，酶可以分为_蛋白类酶_和核酸类酶_两大类。
2、核酸类酶分子中起催化作用的主要组分是_核糖核酸，蛋白类酶分子中起催化作用的主要组分是_蛋白质_。
3、进行分子内催化作用的核酸类酶可以分为_自我剪切酶_，_自我剪接酶_。
4、酶活力是_酶量_的量度指标，酶的比活力是_酶纯度_的量度指标，酶的转换数的主要组分是_酶催化效率_的度量指标。
5、非竞争性抑制的特点是最大反应速度Vm_减小_，米氏常数Km__不变_。
三、选择题1、酶工程是（C）的技术过程。
A、利用酶的催化作用将底物转化为产物B、通过发酵生产和分离纯化获得所需酶C、酶的生产与应用D、酶在工业上大规模应用2、核酸类酶是（D）。
A、催化RNA进行水解反应的一类酶B、催化RNA进行剪接反应的一类酶C、由RNA组成的一类酶D、分子中起催化作用的主要组分为RNA的一类酶3、RNA剪切酶是（B）。
A、催化其他RNA分子进行反应的酶B、催化其他RNA分子进行剪切反应的R酶C、催化本身RNA分子进行剪切反应的R酶D、催化本身RNA分子进行剪接反应的R酶4、酶的改性是指通过各种方法（A）的技术过程。
A、改进酶的催化特性B、改变酶的催化特性C、提高酶的催化效率D、提高酶的稳定性5、酶的转换数是指（C）。
A、酶催化底物转化成产物的数量B、每个酶分子催化底物转化为产物的分子数C、每个酶分子每分钟催化底物转化为产物的分子数D、每摩尔酶催化底物转化为产物的摩尔数四、判断题（V）1、相同的酶在不同的pH条件下进行测定时，酶活力不同。
（V）2、竞争性抑制的特点是最大反应速度Vm不变，米氏常数Km 增大。
（X）3、催化两个化合物缩成一个化合物的酶称为合成酶。
（X ）4、RNA剪切酶是催化RNA分子进行剪切反应的核酸类酶。
酶工程
概念1.化学酶工程：（初级酶工程）通过对酶的化学修饰或固定化处理，改善酶的性质以提高酶的效率和减低成本，甚至通过化学合成方法制造人工酶。
2.凝胶过滤：又称分子筛层析排阻层析。
是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量不同而进行的分离的技术。
3.流化床反应器：将适量的粉状或颗粒状固定化酶悬浮于反应器中，不搅拌，而由同上的底物液流的冲击作用，使固定化酶颗粒在活动状态下进行反应。
4.定向进化：在实验室中模仿自然进化的关键步骤如突变、重组和筛选，在较短时间内完成漫长的自然进化过程，有效地改造蛋白质，使之适于人类的需要。
5.蛋白质工程：是通过对蛋白质已知结构和功能的了解，借助计算机辅助设计，利用基因定点诱变等技术，特异性地对蛋白质结构基因进行改造，产生具有新的特性的蛋白质的技术。
简答1. 微生物发酵产酶过程中，提高酶产量的措施有哪些？答：1）添加诱导物2）控制阻遏物浓度3）添加表面活性剂4）添加产酶促进剂2. 与化学反应器相比,酶反应器有以下几个特点？答：1）对材质的要求一般不高2）专一性强3）要尽量保护生物催化剂的催化活性4）反应条件调控设施较为复杂5）必须考虑便于清洗和消毒灭菌3. 咪唑基的化学修饰的来源，修饰反应和修饰剂（每种修饰反应至少写出一种对应的修饰剂）？答：来源：（His）组氨酸修饰反应：酰基化与烷基化酰基化修饰剂：常用焦碳酸二乙酯、碘乙酸烷基化修饰剂：乙酸酐4.常用的酶的固定化方法有哪些？答：1）吸附法2）结合法3）交联法4）包埋法5. 蛋白质分子设计的原则？答：1）活性设计2）对专一性的设计3）scaffold（框架）设计4）疏水基团与亲水基团需合理分布5）最优的氨基酸侧链几何排列6. NMR法测定蛋白质溶液结构有哪些特点？答：1）可以测定接近于生理状态的溶液中的蛋白质构象2）可以测定小分子和蛋白质作用的动力学过程3）可以测定蛋白质可变形的尾巴部分的构象4）是一种非损伤性测定法。
《酶工程》课件-微生物发酵产酶
05
微生物发酵产酶存在问题与挑战
产量问题
微生物发酵产酶产量低
由于微生物发酵过程中受到多种因素 的影响，如营养物质的供应、发酵条 件、微生物菌种等，导致酶的产量较 低。
发酵周期长
微生物发酵产酶通常需要较长的发酵 周期，这增加了生产成本和时间成本。
稳定性问题
酶稳定性差
许多酶在发酵过程中容易受到温度、pH值、金属离子等因素的影响，导致酶的稳定性降低。
04
微生物发酵产酶应用实例
工业应用
洗涤剂制造
微生物发酵产生的酶可用于制造 洗涤剂，如蛋白酶用于去除蛋白 质污渍，淀粉酶用于去除淀粉污
渍。
纺织工业
利用微生物发酵产生的酶处理纺织 品，可以改善其质地、手感和外观， 如纤维素酶用于棉织物的生物抛光。
造纸工业
通过微生物发酵产酶技术，可以改 进造纸工艺，提高纸张质量和降低 环境污染，如木聚糖酶用于纸浆漂 白。
过程优化与控制
通过人工智能技术，对微生物发酵产酶过程进行建模和优化，提高 目标酶的产量和质量。
个性化定制酶
结合人工智能和基因工程技术，实现个性化定制酶的合成，满足不 同领域的需求。
THANKS
感谢观看
《酶工程》课件-微生物发酵 产酶
• 微生物发酵产酶概述 • 微生物发酵产酶原理与过程 • 微生物发酵产酶技术与方法
• 微生物发酵产酶应用实例 • 微生物发酵产酶存在问题与挑战 • 未来发展趋势与展望
01
微生物发酵产酶概述
酶工程简介
酶工程定义
酶工程是生物工程的重要组成部分，是利用酶或者微生物细胞、动植物细胞、 细胞器等具有的生物催化功能，借助工程手段来生产有用物质、设计改造酶或 者生产细胞、器官乃至整个生物体的一门科学技术。
酶工程：动植物细胞培养产酶
四、植物细胞培养产酶的工艺过程
以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例
SOD是生物体内清除超氧化物阴 离子自由基(O 2—)的重要金属酶 类。它和过氧化氢酶、过氧化物 酶一起构成了生物体内重要的酶 促反应防御体系，从而维护生物 体内细胞正常的生理代谢和生化 反应。衰老自由基学说认为衰老 源于机体正常代谢过程中产生过 量的自由基对机体损害的结果。 超氧化物歧化酶(SOD)作为能催化 超氧阴离子发生歧化反应的自由 基清除剂，具有延缓衰老的作用。
(2)大蒜悬浮细胞培养
将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈 伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D 和 1.2mg/L 6-BA （苄基腺嘌呤） 的液体MS 培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25℃， 600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d，使 愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。 然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞 团或单细胞转入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中，25℃,600lux， 12h/d光照条件下震荡培养18d。
二、动物细胞培养的特点
（1）主要用于生产各种功能蛋白质； （2）生长缓慢； （3）需加抗生素防污染； （4）细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感； （5）具锚地依赖性，宜贴壁培养；部分用悬浮培养； （6）培养基成分复杂，反应过程成本高，产品价格贵 ；
二、植物细胞培养的特点
（1）提高产率
例如：紫草宁的生产， 发酵细胞中的紫草宁比 紫草根中高10倍。
紫草宁的结构
（2）缩短周期 发酵周期10～30天，种植周期几个月～几年。 （3）易于管理 减低劳动强度；不受地理环境和气候条件等影 响。 （4）提高产品质量 主要产物浓度高，易于分离纯化，减少环境中 各种有害物质污染和侵蚀。 （5）其它 设计植物细胞生物反应器和控制工艺条件时应 注意一些问题。
酶工程及酶的特性
●首先对酶进行了命名1878年库尼首先把这种物质称为酶。
1896年巴克纳兄弟发现酵母的无细胞抽提液也能将糖发酵成酒精。
1982年 Cech 、1983年Altman等分别发现核酶。
●什么是酶工程？酶的生产与应用的技术过程成为酶工程。
酶工程的主要内容包括：微生物细胞发酵产酶、动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞和原生质体固定化、酶的非水相催化、酶反应器和酶的应用。
酶工程的主要任务是经过预先设计，通过人工操作，获得人们所需的美，并通过各种方法使酶充分发挥其催化功能。
●酶的化学本质已知大多数酶的化学本质是蛋白质核酶是核糖酶酶的专一性（特异性）是指在一定的条件下，一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物进行某种类型反应的特性。
1.绝对专一性一种酶只能催化一种底物进行一种反应，这种高度的专一性称为绝对专一性。
例如，乳酸脱氢酶催化丙酮酸进行加氢反应生成L-乳酸；而D-乳酸脱氢酶却只能催化丙酮酸加氢生成D-乳酸。
2.相对专一性一种酶能够催化一类结构相似的底物进行某种相同类型的反应，这种专一性称为相对专一性。
例如，酯酶可催化所有含酯键的酯类物质水解生成醇和酸。
●测定酶活力，应测定酶促反应的初速率。
（即底物消耗量<5％时测得的反应速度）测酶活的步骤（1）根据酶的专一性，选择适宜的底物（2）确定反应条件（3）在一定的条件下，将一定量的酶液与底物混合均匀，记下开始反应的时间。
（4）反应到一定的时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量，计算酶的活力。
●终止酶反应的方法●酶的活力单位酶活力单位：是指在特定条件下，在1min内能转化1微摩尔底物的酶量，或转化底物中1微摩尔有关基团的酶量。
●酶的比活力——是指在特定的条件下。
每毫克酶蛋白所具有的酶活力单位数。
●酶的分类（1）从化学组成上看，分为两类：•单纯酶（单成分酶）和结合酶（双成分酶）•结合酶：全酶=酶蛋白+辅因子•辅因子：辅基、辅酶。
基因工程细胞工程酶工程发酵工程
基因工程细胞工程酶工程发酵工程
基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程是现代生物技术领域中的重要分支。
在这些领域中，科学家们利用生物学、化学、物理学等多学科知识，通过对生物体的基因、细胞、酶和发酵过程进行改造和优化，来生产出更多、更好、更适合人类需求的生物制品。
基因工程是一种通过改变生物体的遗传信息，从而使其具有新的性状或改善原有性状的技术。
科学家们通常会使用DNA重组技术，将不同来源的基因组合起来，来创造出新的生物体或改善现有的生物体性状。
基因工程的应用涉及生物医学、农业、食品工业等多个领域，例如，利用基因工程技术可以生产更多的粮食、更安全的食品、更有效的药物等。
细胞工程是指通过对细胞进行调控、改造和优化，来使其具有更强的生产能力或更好的性状。
科学家们通常会利用细胞培养技术，来大规模地培养细胞，并通过对细胞的生长环境、代谢途径进行调控，进而实现对细胞生产过程的控制。
细胞工程在制药、化妆品等领域得到广泛应用。
酶工程是一种利用酶催化技术，来生产各种化学物质的技术。
科学家们通常会通过改变酶的结构和功能，来使其适应各种反应条件，并提高催化效率。
酶工程广泛应用于制药、食品、化工等领域。
发酵工程是一种利用微生物进行生物转化的技术。
科学家们通常会对微生物进行筛选、培养，并通过调控微生物的代谢途径和环境条件，来提高微生物的生产能力。
发酵工程广泛应用于制药、食品、化
工等领域。
总之，基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程是生物技术领域中的重要分支，它们为制备更多、更好、更适合人类需求的生物制品提供了强有力的支持。
酶工程第三章 动植物细胞培养产酶
制备微载体的材料主要有：
葡聚糖（DEAE—Sephadex A50及A25 ） 塑料 明胶 玻璃 纤维素
四、动物细胞培养的工艺条件及其控制
种质细胞：体细胞、杂交瘤细胞； 工艺过程：
胰蛋白酶
种质 细胞
悬浮 细胞
悬浮培 养或贴 壁培养
收集培 养液、 分离纯 化
（一）动物细胞培养基组成成分
生产组织纤溶酶原活化剂的工艺过程
１、人黑色素瘤细胞培养基；
２、人黑色素瘤细胞培养；
３、组织纤溶酶原激活剂的分离纯化。
动、植物细胞培养与微生物培养区别
动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固 体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨 基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血 清。动物细胞对环境敏感，包括pH、溶氧、温度、剪 切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测 和控制。 植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但由于植物细 胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养 产物，以及植物细胞生长较微生物要缓慢，长时间的 培养对无菌要求及反应器的设计也提出特殊的要求。
1、氨基酸：各种必需氨基酸，谷氨酰胺等， 作为碳源和能源利用； 2、维生素：血清中，B族和维C； 3、无机盐：调节渗透压； 4、葡萄糖：作为碳源和能源； 5、激素：胰岛素、生长激素、氢化可的松； 6、生长因子：如表皮生长因子、神经生长 因子、成纤维细胞生长因子。
（二）动物细胞培养基的配制
首先配制各类母液，使用前混合过滤除菌， 使用时稀释至所需浓度； 各种动物培养基已商品化。
（六）溶解氧的控制
溶解氧的供给对动物细胞培养至关重要； 采用调节混合气体的量与比例的方法。
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催化初级代谢产物合成的酶专一性强，
而催化次级代谢产物合成的某些酶专一性 不强。
初级代谢和次级代谢类型既有区别，又 是紧密联系着的。
第一节 植物细胞培养产酶
一、植物细胞的特性 二、植物细胞培养的特点 三、植物细胞培养的工艺条件及其控制 四、植物细胞培养产酶的工艺过程
细胞培养的定义 及生产目的
第三章 动、植物细胞培养产酶、 有用次生代谢产物
第一节 植物细胞培养产酶
第二节 动物细胞培养产酶
初级代谢和次级代谢
次级代谢是相对于初级代谢而言的，所 谓初级代谢是一类普遍存在于生物中的代 谢类型，是与生物生存有关的，涉及能量 产生和能量消耗的代谢类型。
初级代谢产物如单糖、核苷酸、脂肪 酸等单体，以及由它们组成的各种大分子 聚合物如蛋白质、核酸、多糖、脂类等， 都是有机体生存必不可少的物质。
在这一理论的指导下，经过一个世纪的 发展，植物细胞培养已经建立起专门技术， 形成新的学科。
一、植物细胞的特性
（1）植物细胞比微生物细胞大得多，体 积比微生物细胞大103-106倍；植物细胞 的体积也比动物细胞大。
（2）植物细胞的生长速率和代谢速率比 微生物低，生长倍增时间较微生物长；生 产周期也比微生物长。
（3）植物细胞和微生物细胞的营养要求 较为简单。
（4）植物细胞与动物细胞、微生物细胞 的主要不同点之一，是大多数植物细胞的 生长以及次级代谢物的生产要求一定的光 照强度和光照时间。
（5）植物细胞与动物细胞一样，对剪切 力敏感。
（6）植物细胞和微生物、动物细胞用于 生产的主要目的产物各不相同。
外植体(explant)：在组织培养中，由 植物体上取下来进行离体培养的那部分组 织或器官。
植物细胞培养生产各种天然产物，与从 植物中提取分离这些物质相比，具有如下 显著特点：
1.提高产率
使用优良的植物细胞进行培养生产天然 产物，可以明显提高天然产物的产率。
2.缩短周期
植物细胞生长的倍增时间一般为12-16h， 一般生产周期为15-30天，这比起微生物来 是相当长的时间，但是与完整植物的生长周 期比较，却是大大地缩短了生产周期。
有学者认为这是某些生物在一定条件 下通过突变获得的一种适应生存方式，或 是一种解毒方式，对产生菌的生存仍可能 有一定的价值。
次级代谢产物的种类很多，如氨基糖 衍生物、苯醌、香豆素、环氧化合物、麦 角生物碱、戊二酰胺、吲哚衍生物、内酰、 萘、核苷、肽、喹啉、吡咯、吩嗪、多烯、 聚乙炔、萜烯、四环类抗生素等。
有的次级代谢产物含有特殊的化学键， 例如，β-内酰胺环、有修饰过的氨基酸组 成的环肽、聚乙烯和多烯的不饱和键、大 环内脂类大环等。
初级代谢与次级代谢除了以上不同外， 还有许多区别:
与微生物生长的相互关系上有明显不同，
初级代谢过程自始至终都存在于一切生活 细胞之中，并与机体的生长过程呈平行关系；
3.易于管理，减轻劳动强度
植物细胞培养在人工控制条件的生物反 应器中进行生产，不受地理环境和气候条 件等的影响，易于操作管理，大大减轻劳 动强度，改善了劳动条件。
4.提高产品质量
植物细胞培养的主要产物的产率较高， 杂质较少，在严格控制条件的生物反应器 中生产，可以减少环境中有害物质的污染 和微生物、昆虫等的侵蚀，产物易于分离 纯化，从而提高产品质量。
这一论述的依据就是植物细胞全能性学 说(cell totipotency)。
所谓细胞的全能性(totipotency)是指个 体某个器官或组织已经分化的细胞在适宜 的条件下再生成完整个体的遗传潜力。
1965年，由Vasil和Hildebrandt用单 个分离的细胞培养成一个完整植株，细胞 全能性得到实现。
在这些物质的合成中的任何环节发生 障碍，有可能引起生长停止，甚至导致机 体发生突变或死亡。
次级代谢是某些微生物为了避免代谢 过程中，某种代谢产物的积累造成的不利 作用，而产生的一类有利于生存的代谢类 型，通常是在生长后期合成。
通过次级代谢合成的产物称为次级代 谢产物。
这些代谢产物并不是微生物生长所必 需的，即使在这些代谢的某个环节上发生 障碍，也不会导致机体生长停止或死亡， 仅仅是影响了机体合成次级代谢产物的能 力。通常它们以多组分的形式存在。
而次级代谢则仅在机体生长的某一个时期 产生，或在微生物的对数生长期后期或在稳 定期，与微生物的生长不呈平行关系。
初级代谢产物在不同的微生物中基本相 同，
而次级代谢产物的种类在不同微生物中 是非常不同的。
初级代谢对环境变化的敏感性比较小， 即遗传稳定性强，
而次级代谢对环境条件的变化很敏感， 其产物的合成往往会因环境条件的变化而 停止。
一是天然植物的产量低，不能满足需要； 二是许多野生植物正趋于濒危； 三是引种驯化困难； 四是受自然环境和耕地的影响，栽培中产 量和质量难以控制。 此外，用化学合成的方法，因为工艺复杂、 成本高、污染大，也受到了限制。
为此，发展植物细胞培养技术，生产各种来源于植物 的有重要应用价值的产物。
1902年德国植物生理学家哈勃兰德 （Haberlandt）首次提出分离植物单细胞 并将其培养成植株的设想，并首次提出细 胞培养的概念。
植物细胞主要用于生产色素、药物、 香精和酶等次级代谢物；
微生物主要用于生产醇类、有机酸、 氨基酸、核苷酸、抗生素和酶等；
动物细胞主要用于生产疫苗、激素、 单克隆抗体、多肽因子和酶等细胞培养技术首先从植物外植体中 选育出植物细胞，再经过筛选、诱变、原 生质体融合或DNA重组等技术而获得优良 的植物细胞。然后，在人工控制条件的植 物细胞反应器中进行植物细胞培养，从而 获得各种所需的产物。
动植物细胞培养是通过特定技术获得优 良的动、植物细胞，然后在人工控制条件 的反应器中进行细胞培养，以获得所需产 物的过程。
植物细胞培养的主要目的是生产色素、 药物、香精、酶等次级代谢物。
动物细胞培养的主要目的是获得疫苗、 激素、多肽药物、单克隆抗体、酶、皮肤 等人体组织、器官等功能性蛋白质。
人类从天然植物中提取各种有重要应用价 第一值节的产植物物受细到胞了培限养制产: 酶和有用次生代谢产物