焦磷酸测序实验步骤

焦磷酸测序实验步骤

Control oligo稀释配置，需要二次稀释到0.04um：

第一次稀释：体积浓度

Control oligo 5ul 20um

1×Dilution buffer 45ul

第一次所得溶液50ul 2um

第二次稀释：

第一次所得溶液3ul 2um

1×Dilution buffer 147ul

第二次所得溶液 150ul 0.04um

1.微珠固定PCR产物

将生物素标记的PCR 产物固定到链霉亲和素包被的琼脂糖微珠（Streptavidin Sepharose High Performance，GE Healthcare）上。

1.1 轻摇包被链霉亲和素的琼脂糖微珠，直至获得均质溶液。

1.2 在一个试管中混合链霉亲和素包被的琼脂糖微珠总量（2 μl / 样品）（新的琼脂糖微珠浓度比原来的提高了一倍，只需加1ul）与结合缓冲液（40 μl / 样品）。添加高纯度水至80 μl / 孔的总体积—包括第1.4 步中添加的PCR产物，纯水量取决于所用PCR 产物的量。例如：如果使用15 μl PCR 产物、2 μl 微珠和40 μl 结合缓冲液，则必须添加23 μl 高纯度水。

1.3 将第1.2 步中制备的溶液添加至24 孔PCR 孔板或联排管中。

1.4 根据孔板设置，添加5–20 μl 优化好的生物素标记的PCR 产物至PCR 孔板（或联排管）的每个孔槽。（注意：每个孔槽的总体积应当是80 μl。）

1.5 使用孔板条盖密封PCR 孔板（或联排管）。确保孔槽之间没有泄漏。

1.6 使用振荡混合器（1400 rpm）不断振荡PCR 孔板（或联排管）至少5–10 分钟。（注意：微珠沉淀快速，因此停止震荡后必须在一分钟内立即使用，即立刻捕获琼脂糖微珠。）

2. 真空工作站准备工作

2.1 准备以下试剂：（1）大约50ml乙醇（70%）；（2）大约40ml变性溶液；（3）大约50ml 1×洗涤缓冲液；（4）大约50ml超纯水；（5）大约70ml超纯水。

1×洗涤缓冲液稀释配置;

体积

wash buffer 5ml

高纯水 45ml

1×洗涤缓冲液 50ml

2.2 打开真空泵。打开真空开关，进行测试试验，以确定过滤探针是否正常工作。

2.3 每次使用真空泵前要用超纯水检测过滤探针的通透性。将事先准备好的装好超纯水的离心管插在PCR plant（PCR孔槽）上，将过滤探针降入超纯水中，超纯水如在20秒内被抽空则表明过滤探针正常，可以使用。反之则需更换过滤探针。

2.4 取下1.6中振荡好的PCR孔板（注意：微珠极易沉淀。如果离心管振荡后放置超过1分钟，则在捕获微珠之前再次振荡1分钟），将样品放入PCR plant，小心降下过滤探针至PCR孔板中，停留15秒；确保溶液全部被吸走，以捕获含有固定模板的微珠。（确保所有离心管中的液体被吸出并且所有微珠都已被捕获到过滤探针的顶端。）

2.5 将真空装置移至含有70%乙醇的试剂槽1，冲洗过滤探针5秒。

2.6 将真空装置移至含有变性溶液的试剂槽2，冲洗过滤探针5秒。

2.7 将真空装置移至含有洗脱缓冲液的试剂槽3，冲洗过滤探针10秒。

2.8 抬高真空装置超过90°垂线5秒，从过滤探针中排液。

2.9 握持真空装置到Q24 孔板上，关闭装置上的真空开关并悬空停留5秒，让负压散去。

2.10 通过左右轻摇真空装置，释放珠子至含测序引物的孔板中。

2.11 在真空装置关闭的情况下将真空装置转移至含有超纯水的试剂槽4，振荡10秒。

2.12 降下探针至含超纯水的第二个试剂槽5中并施加真空，清洗探针。用70ml 超纯水冲洗过滤探针。

2.13 抬高真空装置超过90°垂线5秒，从过滤探针中排液。

2.14 关闭真空装置上的开关，并将其置于静止（P）位。

3. 分离DNA单链并将样本释放到PyroMark Q24孔板中

3.1将PyroMark Q24孔板放置在预热的孔板底座上80℃精确加热2分钟。

3.2 从孔板底座上取下孔板，使样本在室温（15-25℃）下至少冷却5分钟。

4. PyroMark Q24试剂的准备

4.1 打开PyroMark Q24试剂盒并取出含有酶和底物冻干粉的小瓶，以及含有核苷酸的试管。

4.2 按照试剂盒说明书用超纯水溶解并分装酶和底物（溶解后的酶和底物需在-20℃保存，最多可反复冻融3次，核苷酸只能在4℃保存。），所有试剂需恢复室

温后再使用。

4.3 依照电脑程序计算出的体积，向试剂仓内加入酶、底物和核苷酸A、T、G、C （试剂仓最多使用30次，试剂仓在使用前必须是干燥的）

4.4

5. 在PyroMark Q24仪器上的运行

5.1 打开PyroMark Q24软件，点击new assay→new AQ assay→在sequence to

analyze中输入突变点序列，点击generat pupensation or ，点击保存；

5.2 点击new run→Instrument method→007，然后点击要测序的格子，点击保

存至U盘。

5.3 将含有运行文件的U盘插入仪器前面的USB端口中。

5.4 把加热好的孔板放到仪器上。

5.5 将试剂仓（酶、底物和核苷酸）的标签面面向自己放入仪器，打开孔板支座架放入孔板，关闭孔板支座架和仪器盖。

5.6 选择Run，并按OK。

5.7 在进入Run后，按select选择要运行的文件。

5.8 仪器运行结束并确认运行文件已保存至U盘后，按close。取出U盘。

5.9 打开仪器，取出试剂仓，并对其进行反复清洗（清洗时一定要用高纯水洗涤，在满水的情况下用指腹按压各孔，检查加样孔是否通畅），废弃孔板。

5.10 当仪器不运行时，从主菜单郑徐泽shutdown（关机）并按OK

5.11 当It is now safe to turn off the instrument出现时，既可以关闭仪器，电源开关位于仪器后面。

6清洁试剂仓并确保其可用于分析

6.1 清除试剂仓中摄于的任何融合（试验完后，必须清洗试剂仓，不能过夜，以免堵塞）

6.2 采用高纯水冲洗试剂仓的隔室4次

6.3 使用高纯水喷洒针头外部

6.4 试剂仓用高纯水填满隔室淋洗针头，握持试剂仓在试剂槽或烧杯上方，同事用一根手指紧紧地按压在每一个隔室的顶部（必须佩带五分手套）

6.5 检查针头是否洁净，水束将直接凑够每个针头的顶端射出

6.6 检查水束是否直接从这头方向射出。如果水束成角度流出，用高纯水填充隔