《中国药典》2020版— 等电聚焦电泳法
等电聚焦电泳
在电场下利用不同pH值缓冲溶液相互扩散，在混合区间 形成pH梯度，称人工pH梯度。但这种pH梯度易受缓冲溶 液离子的迁移和扩散而变动，重复性差，已不被采用。 利用温度梯度建立pH梯度。因为温度可以影响缓冲液的 解离度，从而使pH值改变。由于每差别一个pH单位温度 约50℃，故这种方法只能建立范围很窄的pH梯度，而且 不易稳定。
如果在电泳系统中建立一个由阳极至阴极，pH由 低到高（即环境由酸到碱）的连续而稳定的pH梯度， 则处于一个系统的各种蛋白质分子，将根据各自的pI 值与所处位点的PH值的差别带上正电或负电。
IEF的分类
载体两性电解质pH梯度(carrier ampholyte pH gradient) 等电聚焦，即在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度。 固相pH梯度(immobilized pH gradients,IPG)等电聚焦，是 利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物滴定时， 在滴定终点附近形成pH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合， 形成固定的、不随环境电场条件变化的pH梯度，分辨率 可达0.001pH。 载体两性电解质/固相pH梯度混合技术，即在固相pH梯度 凝胶中加入载体两性电解质作为添加剂，被称为“杂交等 电聚焦”。 固相pH梯度等电聚焦与载体两性电解质等电聚焦的 区别在于前者不是两性分子，在凝胶聚合时便形成pH梯 度.后者是两性分子，在电场中两性分子迁移到自己的等 电点而形成pH梯度。
加入附加物质建立pH梯度。通过把一些有机溶剂如乙醇、 甘油等加到缓冲液中，利用附加物的介电常数的变化，改 变了缓冲液一些组分的解离常数，可以形成1.5pH单位的 pH梯度。如在硼酸盐溶液中加0~5%甘油和0~3%蔗糖， 可以形成pH为7~8.6范围的梯度，可分离血红蛋白。 在电极间放入含多种不同等电点电解质的溶液，通电后在 电极间便会形成pH梯度。这些两性电解质大多是一些多 胺基多羧酸化合物。为了防止对流对pH梯度的干扰，可 以采用加入不同浓度的中性或惰性物质形成密度梯度的方 法，也可以采用在电极间加入凝胶的方法。
等电聚焦电泳方法的建立和牛凝血酶等电点的初步测定
等电聚焦电泳方法的建立和牛凝血酶等电点的初步测定1常灏，黄耀江，沈光涛中央民族大学生命与环境科学学院，北京（100081）E-mail：haobio@摘要：作为一种新型的速效局部止血药和工具酶，凝血酶在临床和生物学研究中的应用十分广泛，牛血浆是其重要的来源之一。
等电点沉淀是提取牛凝血酶首要和关键的步骤，测定其等电点后，再用此法时将得到更纯的凝血酶粗制品。
本实验的目的是通过测定胰蛋白酶的等电点建立载体两性电解质等电聚焦电泳的方法，并以该方法结合SDS-PAGE测定牛凝血酶的等电点。
经双向电泳后，SDS聚丙烯酰胺凝胶中出现了4个清晰的斑点，分别测定它们的分子量和等电点，其中一个斑点与牛凝血酶B链的分子量一致为32kDa，其等电点为5.19。
关键词：牛凝血酶，等电点，等电聚焦，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1. 引言凝血酶（Thrombin，EC3.4.21.5）是一种丝氨酸蛋白水解酶，在血液凝固系统中起重要作用。
它能催化溶胶态的纤维蛋白原转变为凝胶态的纤维蛋白，同时促使血小板聚集，加速血液凝固，达到迅速止血的目的。
[1][2]凝血酶在参与凝血作用的同时，对底物还具有高度的特异性，可以专一性地切割X-Arg-Gly或Gly-Arg-X序列中由精氨酸羧基参与形成的肽键。
[3]由于凝血酶具有以上的特性，近年来使其成为一种新型的速效局部止血药，在临床上被广泛应用于消化道出血和外科手术止血。
[1]此外，利用其作用的特异性，还可作为工具酶用来加工目的产物，在医学和生物学研究上的用途也很广泛。
现在，制备凝血酶的原料多为牛、猪和人的血浆。
我国猪血的来源相当广泛，随着开发利用猪血的意识逐渐提高，有关猪凝血酶提取方法的文献报道也越来越多。
目前，凝血酶的制备方法主要有柠檬酸钡吸附法、氢氧化镁吸附法和等电点沉淀法3种。
[1]其中等电点沉淀法是最简单易行的分离方法，也是后续纯化工作的基础。
凝血酶的等电点在5.0～5.5之间[1]，但物种之间是有差异的。
等电聚焦电泳
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等电聚焦电泳的应用
IEF是一种简便、快速、高效的分离分析方法，
特别适用于氨基酸、多肽、蛋白质、酶类和抗体等 的分离分析，能够满足组分定量、杂质检出、质量 控制、临床诊断等方面的要求。目前等电聚焦电泳
主要用于两性电解质样品等电点的测定,两性电解质 样品的分析、分离和制备，在同功酶的鉴定及蛋 白质的微量分析(10~50μg)上应用尤为广泛。随着 生命科学的发展，特别是人类基因组计划(HGP)全 面完成之后所谓“后基因组”时代的来临，对复 杂生命体系的准确表征和分析就显得日益紧迫， 其中蛋白质组研究是一个极其重要的部分。
白质上专一结合（以共价键等强作用力结合，一定程度上依
赖于蛋白质的构象)的金属在电场作用下的丢失，这部分 金属大多构成蛋白质的活性中心或结构中心，比非专 一结合金属具有更重要的生物学意义。 ➢ 在样品分离方面，载体两性电解质pH梯度的重现性仍然是 难以解决的问题。选用固态pH梯度可以提高分辨率， 加大上样量，受到样品中盐的干扰小，无边缘效应， 并有很好的重现性，这对建立微量元素种态分布数据 库这样的工作是必需的．
渐消失则称为阳极漂移。
为了阐明IEF中pH值梯度不稳定的机制，出现了各种假说： 载体两性电解质向阴、阳极的等速电泳（ITP）迁移； 在阴极因CO2的吸附而引起阴极液组分和浓度的变化； 在pH梯度的中性区域生成一段纯水，水的IEF导致水在电泳管中的
聚集并向两端反流； 不同等电点载体两性电解质的选择性缺陷而引起的不稳定； 两性电解质带电配体的进行性地结合或分离引起的不稳定； 载体两性电解质相互反应的存在而引起的不稳定性；
➢ 分辨率高。等电聚焦电泳属于非变性蛋白质分离分析技术，
《中国药典》2020版—SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
0541电泳法第五法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法是一种变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白质的原理是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子大小分离。
本法适用于蛋白质的定性鉴别、纯度和杂质控制以及定量测定。
1.仪器装置恒压或恒流电源、垂直板电泳槽和制胶模具。
2.试剂(1)水 (去离子水，电阻率不低于18.2MΩ•cm)。
(2)分离胶缓冲液（4×，A液）：1.5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷18.15g，加适量水溶解，用盐酸调pH值至8.8, 加水稀释至100ml。
(3)30%丙烯酰胺溶液（B液）：称取丙烯酰胺58.0g、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺2.0g，加温水溶解并稀释至200ml，滤纸过滤(避光保存)。
(4)10%SDS溶液（C液）：称取十二烷基硫酸钠10g，加水溶解并稀释至100ml。
(5)四甲基乙二胺溶液（TEMED，D液）：商品化试剂，通常浓度为10%的N,N,N’,N’-四甲基乙二胺。
(6)10%过硫酸铵溶液（E液）：称取过硫酸铵10g，加水溶解并稀释至100ml。
建议临用前配制，或分装于-20℃可贮存2周。
(7)浓缩胶缓冲液（4×，F液）：0.5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷6.05g，加适量水使溶解，用盐酸调pH值至6.8，加水稀释至100ml。
(8)电极缓冲液（10×）：称取三羟甲基氨基甲烷30g、甘氨酸144g、十二烷基硫酸钠10g ，加水溶解并稀释至约800ml，用盐酸调pH值至8.1-8.8之间，加水稀释至1000ml。
(9)非还原型供试品缓冲液（4×）：称取三羟甲基氨基甲烷3.03g、溴酚蓝20mg、十二烷基硫酸钠8.0g，量取甘油40ml，加水溶解并稀释至约80ml，用盐酸调节至pH6.8，加水稀释至100ml。
等电聚焦电泳方法
等电聚焦电泳方法
等电聚焦电泳方法（Isoelectric focusing，IEF）是一种高效的分离蛋白质的方法，它基于蛋白质在特定pH 值下的等电点电荷状态差异进行分离。
该方法可用于分离电荷异构体、突变体、异构蛋白质和翻译后修饰的蛋白质。
IEF 方法需要一个pH 梯度凝胶，通常使用聚丙烯酰胺凝胶。
样品被加到凝胶的一侧，然后用电场沿pH 梯度进行电泳。
当蛋白质移动到与其等效的pH 值处时，电荷变为中性，停止运动。
这种分离方法可以在同一凝胶中完成多个样品的分离，并且它可以与其他分离方法例如SDS-PAGE 结合使用，从而实现更高的分辨率。
IEF 方法已被广泛应用于生命科学中的蛋白质研究和分析，例如生物医学、生物化学和分子生物学等领域。
《中国药典》(2020版)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE法）SDS-PAGE法是一种变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。
本法分离蛋白质的原理是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子大小分离。
本法用于蛋白质的定性鉴别、纯度和杂质控制以及定量测定。
1.仪器装置恒压或恒流电源、垂直板电泳槽和制胶模具。
2.试剂（1）水。
（2）分离胶缓冲液（4×，A液） 1.5moL/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷18.15g，加适量水溶解，用盐酸调节pH值至8.8，加水稀释至100mL。
（3）30%丙烯酰胺溶液（B液）称取丙烯酰胺58.0g、N,N-亚甲基双丙烯酰胺2.0g，加温水溶解并稀释至200mL，滤纸过滤（避光保存）。
（4）10%SDS溶液（C液）称取十二烷基硫酸钠10g,加水溶解并稀释至100mL。
（5）四甲基乙二胺溶液（TEMED，D液）商品化试剂。
（6）10%过硫酸铵溶液（E液）称取过硫酸铵10g，加水溶解并稀释至100mL。
建议临用前配制，或分装于-20℃可贮存2周。
（7）浓缩胶缓冲液（4×，F液）0.5moL/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷6.05g，加适量水使溶解，用盐酸调pH值至6.8，加水稀释至100mL。
（8）电极缓冲液（10×）称取三羟甲基氨基甲烷30g、甘氨酸144g、十二烷基硫酸钠10g，加水溶解并稀释至约800mL，用盐酸调节pH值至8.1~8.8之间，加水稀释至1000mL。
（9）非还原型供试品缓冲液（4×）称取三羟甲基氨基甲烷3.03g、溴酚蓝20mg、十二烷基硫酸钠8.0g，量取甘油40m1，加水溶解并稀释至约80mL，用盐酸调节pH值至6.8，加水稀释至100mL。
等电聚焦电泳【共54张PPT】
蛋白质分子的电聚焦过程
+
+
pH=pI
-
—
a
b
pI1 pI2 pI3
pIn
c
a. 蛋白质分子在负极端 b. 蛋白质分子在正极端
c. 蛋白质样品中各组分聚焦成区带
在这个从正极到负极pH逐渐增加的 直流电场中，当蛋白质进入这个环境， 不同的蛋白质带上不同性质和数量的电 荷，向着一定方向移动，迁移到与其相 同的等电点位置上停留下来，即被聚焦 于一个狭的区带中 ，得以分离。
进行IEFE必须具备3个条件：
①有一个在电泳条件下基本稳定、重复 性良好的pH梯度
②有一个抗对流的电泳材料，使已经分 离的样品不再重新混合
③电泳后有适当的方法来鉴定分离的区 带
（一）pH梯度的建立
用多种两性电解质混合物建立稳定 良好的pH梯度
1.理想的载体两性电解质（Carrier ampholytes）应具备的特征：
等电点聚焦的分离容量受下列几个因素影响：
1、聚焦后每一区带的蛋白量取决于密度梯 度所能支持的蛋白质，提高密度可以提 高分离容量；
2、容量与区带高度的平方成正比，降低电 压可使区带变宽，提高容量，但分辨率
降低，聚焦时间长，用窄的pH梯度范围 可以使区带变宽，提高分辨率。 3、分离的容量与柱的横载面成正比，用440 毫克柱时，可加粗蛋白质5克，每一区带 可达一克。
-
a
由于载体两性电解质是一系列不同
分子的两性电解质的混合物所组成的， 设 其 中 某 一 成 分 为 A， 它 的 pI=pH’， 当 环境中的pH>pH’时，它带负电荷，朝正 极移动。(图b)
pH
ApH=pH’
+
-
b
等电聚焦电泳 介绍
等电聚焦电泳介绍点击次数：315 作者：佚名发表于：2008-08-07 00:00 转载请注明来自丁香园来源：互联网主要仪器试剂仪器：微型电泳系统、电源、注射器、固定和染色用容器试剂：丙稀酰胺、双－丙稀酰胺、载体两性电解质、尿素、过硫酸胺、TEMED、TritonX－100、2－巯基乙醇、溴酚蓝、磷酸、氢氧化钠、氯化钾、三氯乙酸、考马斯亮蓝、甲醇、乙酸。
储存液：1）30%（w/v）丙稀酰胺，1%（w/v）双－丙稀酰胺；2）20%Triton X100；3）10%三氯乙酸；4）1%三氯乙酸；5）1%溴酚蓝；6）考马斯亮蓝染色液；7）考马斯亮蓝脱色液；灌胶以灌制8cm×7cm×0.75mm pH4-6变性等电聚焦凝胶的配方。
其他pH范围等电聚焦可以参考表格来配置。
水：5.4ml；储存液1）：2.0 ml；载体两性电解质溶液pH3.5-10 48μl；载体两性电解质溶液pH4-6 240μl；超纯尿素 6.0 g ；10%过硫酸胺25μl； TEMED：20μl灌胶步骤：1.组装灌胶器；2.将尿素、水、溶液和载体两性电解质溶液混匀，避免剧烈摇动，轻微加热尿素溶解更快（带手套，丙稀酰胺有毒）；3.加入过硫酸胺和TEMED，轻轻混匀（开始聚合，操作要迅速）；4.将上述混匀溶液倒如灌胶器（尽量避免气泡产生）；5.插入梳子，将梳子侵入胶内（不要产生气泡）；6.聚合约1小时；7.聚合完成，小心拔去梳子；8.将凝胶同冷却装置连接后插入电泳池，蛋白样品上样前最好用阳极电极液注入上槽中确定是否有渗漏。
注意：1.上样前冲去上样空底部未聚合的丙稀酰胺，否则电泳过程中会发生聚合；2.现在有商品化的等电聚焦凝胶，但只限于水平平板电泳系统（如Pharmmacia－LKB,Hoefer）.样品制备和上样一般不同厚度的凝胶，不同的梳孔数目会有不同的上样量，例如：0.75mm厚、15孔的凝胶每孔最大上样量大约15μl。
等电聚焦电泳的两种方法
等电聚焦电泳（IEF）分离蛋白及测定蛋白质等电点等电点聚焦（IEF ）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦是在稳定的pH 梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH 梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH 梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷为0 的区带，这时的pH 则是该分子的pI ，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH 环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI 迁移。
因此，这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中，在pI 处得以“聚焦”.二、仪器与试剂1．材料：蛋白样品2．试剂：聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP-40、teiton-100电极液：1M 磷酸（阳极液）、1M 氢氧化钠（阴极液）固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml，定容为1000ml染色液：0.35g考马斯亮蓝R—150溶于300ml脱色液中，加热到60 - 70C,加入0.3g硫酸铜。
脱色液：25％乙醇、8％冰乙酸溶于水样品缓冲液:1％Ampholine 、2％Triton X-100 、9M 尿素三、操作步骤：1, 样品制备：用IEF 样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF 样品缓冲液。
充分溶解后，离心去除不溶杂质。
2, 制模具：洗干净两块IEF 专用玻璃板，进行硅化和反硅化处理，两块玻璃板的硅化和反硅化面相对，放上夹条，夹子夹好。
3, 配胶：胶液组成：6ml 胶母液（10％，19/1）6—8 ％尿素1ml Ampholine （pH3.5-10）60-80ul 10%AP5 ul TEMED4, 灌胶：配好的胶迅速灌入模具5, 电泳：等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。
等电聚焦电泳原理
等电聚焦电泳原理
等电聚焦电泳是一种常用的电泳技术，适用于分离与测量带有相近分子大小的生物分子。
其原理是利用电流和电场使带电生物分子在凝胶中移动，从而实现这些分子的分离。
等电聚焦电泳的基本原理是根据带电生物分子在凝胶中的异电点而进行分离。
异电点是指生物分子在特定pH值下，净电荷
为零的点。
在等电聚焦电泳中，一个pH 梯度被建立在凝胶中。
电泳开始时，电场中的带电分子会在其异电点处停止移动，因为此时分子的净电荷为零。
随着pH梯度的建立，凝胶中电场
的强度也会增加，这将使带电生物分子在偏离异电点的方向上移动。
通过调整电场的强度和时间，可以实现对特定分子数量、大小进行有效的分离。
等电聚焦电泳的优势在于，它能够对分子进行高分辨率的分离和定量。
通过调整pH梯度和电场强度，可以精确控制分子在
凝胶中的移动速度，从而实现对分子的准确分离。
此外，等电聚焦电泳还可以与其他电泳技术结合使用，如凝胶电泳和双向电泳，以进一步提高分离效果。
总的来说，等电聚焦电泳利用了分子在异电点附近的特性，通过建立pH梯度和调整电场强度，实现了对带电生物分子的有
效分离。
它是一种强大的生物分析工具，广泛应用于分离和测量复杂的生物分子混合物。
等电聚焦电泳
等电聚焦电泳等电聚焦电泳（dielectrophoreticfocusing）是一种用于细胞、分子、纳米颗粒和其他微流体的微流控技术，通过利用非线性电势场的电力作用力而形成。
等电聚焦电泳被广泛应用于医学、生物、农业等领域，用于扩大细胞、分子的空间分布，增强特定类型的细胞和分子的活性，以及改善生物和化学分离等。
等电聚焦电泳技术是借助电力作用力而产生的，它可以控制和操纵介观尺寸细胞及其他形态、性质及体积的微流体，并将它们集中在一定的位置上，使得它们可以形成一个固定的浓度差，从而有效地改变细胞组织或分子组织。
此外，等电聚焦电泳可以将细胞和分子单独分离，用于研究其功能、形态和特性，对细胞组织的分离比传统的手工分离有更高的灵活性和精确度。
等电聚焦电泳技术主要包括三个关键步骤：电场的制备，细胞或分子组织的悬浮和集中以及离心纯化等步骤。
首先，电场的制备涉及制造一个稳定的电场，也就是控制静电场的强度，以及形成旋转电场的大小及方向，以使细胞或分子组织能够在最佳的条件下在电场中运动。
其次，通过几种方法将细胞或分子组织悬浮在溶液中，并且在电场中形成一定的浓度差。
最后，采用离心力来调节浓度差，以集中细胞或分子组织。
等电聚焦电泳技术有许多优势可以利用，其中最大的优势是可以在低成本、高效率和高精确度的情况下分离细胞、分子和纳米颗粒。
等电聚焦电泳技术也具有较强的灵活性，可以根据实验需求设计合适的电场，以实现一些特殊的功能要求，例如分离染色体、调整细胞的形态和性质、对微流体进行排序，并且可以在体外环境实现实验工作，不会受到体内环境的限制。
等电聚焦电泳技术是一种重要的技术，它可以确保细胞、分子和纳米颗粒的有效分离，有助于研究各种特定类型的细胞及其功能，也可以用于分离细胞组织或分子组织，增强特定类型的细胞和分子的活性，以及改善生物和化学分离。
随着技术的进步和发展，等电聚焦电泳技术的应用也会越来越广泛，在不久的将来会得到更多的应用，有助于推动科学和技术的发展。
《中国药典》2020版—单抗电荷变异体测定法(iCIEF 法)
单抗电荷变异体测定法（iCIEF 法）
本法系采用全柱成像毛细管等电聚焦电泳（iCIEF)，依据不同电荷变异体的等电点（pI）特征，按毛细管电泳法（通则0542)将其分离，测定单抗产品各电荷变异体的等电点并计算相对百分含量。
全柱成像毛细管等电聚焦电泳系统
(1)检测器紫外检测器，波长：280 nm。
(2)毛细管涂层石英毛细管。
试剂
(1)甲基纤维素溶液称取甲基纤维素10 g，加水溶解并稀释至1000 ml，配制成1%甲基纤维素溶液，0.22μm滤膜过滤，2～8 ℃保存。
取该溶液与超纯水以1:9稀释，配制成0.1 %甲基纤维素溶液，2～8 ℃ 保存。
(2)两性电解质（pH 3-10）。
(3)80mmol/L磷酸的0.1%甲基纤维素溶液
(4)100mmol/L氢氧化钠的0.1%甲基纤维素溶液
(5)等电点标志物（pI Marker）所选用的等电点标志物的等电点范围一般应涵盖供试品的等电点。
系统适用性对照品溶液的制备
采用适宜浓度的单克隆抗体作为系统适用性对照品。
系统适用性对照品应经国家药品检定机构审查、认可。
等电点常用的检测方法
等电点常用的检测方法等电点是指在溶液或介质中，正负离子的浓度相等时的pH值。
在生物学研究中，等电点被广泛应用于蛋白质、细胞膜和DNA等生物大分子的研究中。
为了准确测定分子的等电点，科学家们开发了许多检测方法。
以下是一些常用的等电点检测方法。
1. 等电聚焦电泳法等电聚焦电泳法是一种基于电荷的分离技术，它使用特定的缓冲液体系和电场梯度，将混合的蛋白质在等电点处停留并分离。
这种方法通常用于检测蛋白质的等电点，其优点是操作简单、分离效果好、分离时间短。
2. 等电点电位仪法等电点电位仪法是一种基于电位的检测方法，它利用电位计测量溶液中蛋白质的等电点。
这种方法适用于检测高分子的等电点，如DNA和RNA等，它的优点是精度高、可靠性好。
3. 等电点扫描仪法等电点扫描仪法是一种基于光学的检测方法，它使用可见光和紫外线光谱技术，测量溶液中分子的吸收率和发射率，以确定分子的等电点。
这种方法适用于检测各种高分子的等电点，如蛋白质、DNA 和RNA等，其优点是准确度高、分析速度快。
4. 等电点显色法等电点显色法是一种基于化学反应的检测方法，它利用荧光染料和酸碱指示剂的颜色变化来测定分子的等电点。
这种方法适用于检测各种高分子的等电点，如蛋白质、DNA和RNA等，其优点是灵敏度高、测定精度高。
5. 等电点测定仪法等电点测定仪法是一种基于电泳和电学检测的方法，它利用电场和电荷的作用，将混合的分子在等电点处分离并检测。
这种方法适用于检测各种高分子的等电点，如蛋白质、DNA和RNA等，其优点是测定精度高、分离效果好。
以上这些方法都是常用的等电点检测方法，在生物学研究中都有广泛的应用。
不同的方法各有优缺点，选择适合自己研究的方法进行等电点检测，对于研究结果的准确性和科学价值都有着重要的意义。
等电聚焦电泳
NADPH ：是一种辅酶，叫还原型辅酶Ⅱ，学名烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,曾经被称为三磷酸吡啶核苷酸，写作[H]，叫做还原氢。
在很多生物体内的化学反应中起递氢体的作用，具有重要的意义。
NADPH作为还原剂，NADPH是NADP+的还原形式。
核酶：是具有催化功能的RNA分子，是生物催化剂。
核酶又称核酸类酶、酶RNA、核酶类酶RNA。
RNA剪接：从DNA模板链转录出的最初转录产物中除去内含子，并将外显子连接起来形成一个连续的RNA 分子的过程。
多顺反子：在原核细胞中，通常是几种不同的mRNA连在一起，相互之间由一段短的不编码蛋白质的间隔序列所隔开，这种mRNA叫做多顺反子mRNA。
这样的一条mRNA链含有指导合成几种蛋白质的信息。
一个mRNA 分子编码多个多肽链。
一个顺反子就是一个基因，多顺反子就是多个基因。
分子伴侣：存在于原核生物和真核生物细胞质以及细胞器中可协助新生肽链正确折叠的一类蛋白质。
分子伴侣是细胞中一大类蛋白质, 是由不相关的蛋白质组成的一个家系，它们介导其它蛋白质的正确装配，但自己不成为最后功能结构中的组分。
分子伴侣是一种引导蛋白质正确折叠的蛋白质。
当蛋白质折叠时，它们能保护蛋白质分子免受其它蛋白质的干扰。
第二信使：配体与受体结合后并不进入细胞内，但间接激活细胞内其他可扩散，并能调节调节信号转导蛋白活性的小分子或离子。
受细胞外信号的作用，在胞质溶胶内形成或向胞质溶胶释放的细胞内小分子。
通过作用于靶酶或胞内受体，将信号传递到级联反应下游。
细胞表面受体接受细胞外信号后转换而来的细胞内信号称为第二信使β氧化:脂肪酸氧化生成乙酰辅酶A的途径。
脂肪酸活化成脂酰辅酶A后，逐步氧化脱下乙酰辅酶A。
每次氧化从β碳原子开始。
定义：脂肪酸在一系列酶的作用下，在α碳原子和β碳原子之间断裂，β碳原子被氧化成羧基，生成含有两个碳原子的乙酰辅酶A，和较原来少两个碳原子的脂肪酸信号肽：常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移（定位）的N-末端的氨基酸序列（有时不一定在N端）。
等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点
实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点一、实验目的了解等电聚焦的原理。
通过蛋白质等电点的测定，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦电泳技术。
二、实验原理等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。
近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。
目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。
由于其分辨力高,重复性好,样品容量大，操作简便迅速,在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用.蛋白质分子是典型的两性电解质分子.它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子,向电场的负极泳动。
这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中,即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。
如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下,不管这些蛋白质分子的原始分布如何,各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。
这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦"。
等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦,从而达到分离、测定和鉴定的目的。
两性电解质载体,实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。
常用的进口两性电解质为瑞典Pharmacia-LKB 公司生产的Ampholine 和Pharmalyte,价格昂贵。
国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。
两性电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。
《中国药典》2020版—等电聚焦电泳法国家药品标准公示稿
0541电泳法第六法等电聚焦电泳法等电聚焦电泳法是两性电解质在电泳场中形成一个 pH 梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的 pH 值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点(此处的 pH 值使相应的蛋白质不再带电荷)时，电流达到最小，不再移动，从而达到检测蛋白质和多肽类供试品等电点的电泳方法。
本法适用于蛋白质的定性鉴别、等电点测定、限度检查以及定量测定。
方法 1：垂直板电泳法除各论中另有规定外，按以下方法测定。
1.仪器装置恒压或恒流电源、带有冷却装置的垂直板电泳槽和制胶模具。
2.试剂(1)水(电阻率不低于18.2MΩ•cm)。
(2)A 液称取丙烯酰胺29.1g、亚甲基双丙烯酰胺0.9g，加适量水溶解，并稀释至 100ml，双层滤纸滤过，避光保存。
(3)B 液10%过硫酸铵溶液，临用前配制。
(4)供试品缓冲液(4 倍浓度) 取甘油8ml、40%两性电解质(pH3〜10)溶液 4ml，加水至 20ml。
加 0.1%甲基红溶液20μl。
(5)pI 标准商品化试剂，所选用的pI 标准的等电点范围一般应涵盖供试品的等电点。
(6)固定液称取三氯乙酸34.5g、磺基水杨酸10.4g, 加水溶解并稀释至300ml。
(7)脱色液(平衡液) 取 95%乙醇 500ml、冰醋酸 160ml，加水稀释至2000ml。
(8)染色液称取考马斯亮蓝G250(或R250)0.35g，加脱色液300ml，在60〜70℃水浴中加热，使溶解。
(9)保存液取甘油30ml，加脱色液300ml，混匀。
(10)正极液(0.01mol/L 磷酸溶液) 取磷酸1ml，加水至1800ml。
(11)负极液(0.01mol/L 氢氧化钠溶液) 称取氢氧化钠0.4g，加水溶解并稀释至1000ml。
3.测定法(1)制胶装好垂直平板电泳槽，压水，于玻璃板和玻璃纸之间加入 60% 甘油 1ml。
取水 12ml、甘油 2ml、A 液 4.0ml、两性电解质(pH3〜10)溶液( 或其他两性电解质 )1.0ml, 混匀，脱气，再加 B 液 72 μl，N,N,N’,N’-四甲基乙二胺3μl，混匀后注入槽内聚合，插入样品梳，注意避免气泡出现。
简述等电聚焦电泳法的原理、特点
简述等电聚焦电泳法的原理、特点原理:不同的蛋白质等电点不同，如果分子处于pH和等电点一致的溶液中，则泳动就停止进行。
如果溶液内的pH是位置的函数，或者说有一个pH的位置梯度，那么在一个稳定连续的线性pH梯度的溶液中进行分离，每一种被分离的两性物质都移向与它的等电点相一致的pH位置，在那里不再移动。
由于在这点净电荷为零，因而又称等电聚焦。
特点：1、使用两性载体电解质，在电极之间形成稳定的、连续的、线性的pH梯度。
2、由于“聚焦效应”，即使很小的样品也能获得清晰的、鲜明的区带界面。
3、电泳速度快。
4、分辨率高。
5、加入样品的位置可任意选择。
6、可用于测定蛋白质类物质的等电点。
7、适用于中、大分子量生物组分的分离分析。
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0541电泳法
第六法等电聚焦电泳法
等电聚焦（ISOELECTRIC FOCUSING，IEF）电泳法是两性电解质在电泳场中形成一个 pH 梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的 pH 值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点(此处的 pH 值使相应的蛋白质不再带电荷)时，电流达到最小，不再移动，从而达到检测蛋白质和多肽类供试品等电点的电泳方法。
本法用于蛋白质的定性鉴别、等电点测定、限度检查以及定量测定。
方法 1：垂直板电泳法
除各论中另有规定外，按以下方法测定。
1.仪器装置
恒压或恒流电源、带有冷却装置的垂直板电泳槽和制胶模具。
2.试剂
(1)水(电阻率不低于 18.2MΩ•cm)。
(2)A 液称取丙烯酰胺29.1g、亚甲基双丙烯酰胺0.9g，加适量水溶解，并稀释至 100ml，双层滤纸滤过，避光保存。
(3)B 液10%过硫酸铵溶液，临用前配制。
(4)供试品缓冲液(4 倍浓度) 取甘油8ml、40%两性电解质(pH3〜10)溶
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