水稻遗传多样性研究方法

水稻遗传多样性研究方法
摘要：对物种进行遗传多样性分析，除了能够阐明物种资源之间的遗传背景以及相互关系、新基因的发现、构建核心种质方法、为选育新种奠定扎实的理论依据外，同时，还对从分子水平上对诸如重塑物种的进化历程、生物遗传多样性的保护等方面均有着十分重大的理论及现实意义。

关键词：水稻；遗传多样性；细胞学标记；分子标记
1 遗传多样性的概念
遗传多样性（genetic diversity）是生物多样性的重要篇章。

从广义上看，生物的遗传多样性定义为地球上所有生物所携带的全部遗传信息的集合[1]。

这些遗传信息通常由生物个体的基因组所携带。

故生物的遗传多样性有时候在一定程度上可以等同于生物的遗传基因多样性。

从狭义的角度，生物的遗传多样性一般是指物种自身基因发生的改变。

通常这种改变包含同物种中不同种群或者同物种中同种群的遗传变异。

生物的遗传多样性还可以在诸如分子水平、细胞水平以及个体水平等不同的水平层次中表现出来[2]。

遗传多样性的空间分布，即族群的遗传结构，是在遗传漂变（genetic drift）、基因交流（gene flow）以及自然选择（selection）等因素的作用下，经过生物长期的进化积累而产生的。

2 遗传多样性的研究方法
随着生物学试验技术的不断改进，特别是分子生物学以及遗传学等试验技术手段的发展，研究生物遗传多样性的方法也变得丰富多彩。

生物遗传多样性研究的方法也已经从最初的形态学水平，在经历了细胞水平（也称为染色体水平）、生理生化水平后，逐步发展到当今的分子水平[3]。

利用分子标记技术研究遗传多样性，不仅可以探讨物种之间的亲缘关系，检测种内的遗传分化情况，还可以为属、种分类提供有力的证据。

在了解水稻的遗传结构、基因丰富程度以及种质资源遗传多样性的过程中，分子标记技术是一种十分可靠的遗传标志。

该技术的诞生，对于研究水稻种内、种间的遗传多样性、亲缘关系以及系统进化等，提供了强有力的保证[4]。

另一方面，从分子水平的角度探索遗传突变以及多样性的机致，为细胞学和形态学的分类也提供了有说服力的证据[5]。

2.1 形态学标记
形态学标记是一种根据特定的肉眼可见的外部特征，即以植物的外部特征来对物种进行标记的研究方法。

通常，形态学标记包括了株高、花色、粒色、荚数、生育期、百粒重等。

但是，从广义的角度来说，形态学标记还应该包括诸
如色素、生理和生殖特性、抗病害性以及抗虫害性等相关标记。

形态学标记因其具有方便观察、操作简易的优点，长期以来一直是作为作物核心种质材料的评价、育种后代的筛选以及进行遗传多样性研究的最常用的标记方式。

但是，形态学标记的缺陷也是显而易见的。

首先，可用于形态学标记的标记种类和数量有限，无法满足大规模种质材料差异的鉴定；其次，形态学标记并不十分稳定，受环境因素的影响较大，即使是由单基因所控制的性状标记也经常会因为外界环境条件的变化而发生不同程度的突变。

而由多基因所控制的数量性状虽然有时也能够作为遗传标记被使用，但是却必须通过数量遗传学的统计方法来降低外界环境所造成的影响。

而外界环境因素对数量性状的影响更为强烈，这也就增大了检测种质之间遗传差异的难度。

故形态学标记正被分子遗传标记逐步取代。

2.2 细胞学标记
细胞学标记（cytological markers）也称为染色体标记，主要是指染色体核型或者带型的缺失、重复、易位、倒位等。

其中核型包含了染色体的数目、大小、随体以及着丝点位置等，通常带型是以C带、G带、N带等来表示[6]。

染色体作为生物遗传物质的载体以及基因的携带者，当其发生突变后势必将会造成生物个体产生遗传突变，这是生物的遗传变异和进化的重要组成部分。

染色体分带技术是一种简便、迅速并且成本低廉的外源遗传物质的检测方法。

但由于绝大部分染色体中遗传标记数目的限制，并且该技术对实验操作的要求较高，结果容易受到实验过程中条件变化的干扰，这将直接造成一些不具备特异性带型的染色体或是遗传片段的细胞学标记鉴定结果可信度不高。

2.3 生化标记
生化标记（biochemical marker B）即通常所说的同工酶电泳技术。

该技术是一种鉴别外源DNA并且对物种起源进化进行探索的强有力的实验技术。

与形态标记相比，生化标记所反映出的信息量更大。

同工酶电泳技术是以不同的蛋白质分子所携带电荷性质的不同为基本原理，借助于蛋白质双向电泳技术或者色谱技术，经过相应的染色技术后将不同形式的同工酶展现出来，从而区分出不同的基因型。

这项技术帮助研究人员打开了一扇以全新的方法研究天然群体变异的大门。

生化标记具有实验程序简单，易操作，成本较低等优点，但是生化标记数目在一定程度上仍然有限，且不具有共显性。

因而限制了它的应用。

2.4 分子生物学标记方法
随着分子标记技术的进步，在植物系统与进化的研究过程中，DNA分子水平上检测遗传多样性的方法应用得越来越广泛。

利用DNA分子标记得到的分析结果，不仅可以探讨物种之间的亲缘关系、检测种内的遗传分化，还可以为属、种的分类提供有力证据。

在对水稻的遗传结构、基因丰富程度以及种质资源遗传多样性的研究过程中，DNA分子标记可作为稳定的遗传标志，对水稻种间和种内的遗传多样性、系统进化以及亲缘关系等进行研究[21]。

常用的研究方法
有：限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）、随机扩增片段长度多态DNA （RAPD）、微卫星（SSR）等。

2.4.1 RFLP和RAPD分子标记
限制性内切酶片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP）是第一个DNA分子水平上的遗传标记，它不受环境和发育阶段的影响，可直接反映DNA水平的变异，具有揭示基因组各部分多种类型变异的能力。

其原理是利用一组限制性核酸内切酶消化样品DNA，再经过电泳、印迹和探针杂交，最后通过放射自显影获得反映个体特异性的RFLP图谱[7]。

RFLP作为遗传标记已被成功地应用于检测植物基因组的DNA多态性[8]，目前己经在燕麦[9]、小麦[10]、水稻等多种作物中建立了遗传图谱。

RFLP由于遍布整个基因组，而且非常稳定，故已被广泛应用于群体水平的遗传多样性分析。

但同时它也存在着诸如操作繁琐、技术复杂、成本高昂、劳动强度大、检测周期长、放射性物质污染等问题，不适于大规模的分子育种。

因此，RFLP的应用和推广受到了一定的限制。

2.4.2 SSR分子标记
微卫星序列（Microsatellitic MS），又称简单重复序列（simple sequence repeats, SSRs），该技术是以1bp-6bp重复为单位的DNA序列，在不同的物种中重复的次数也不尽相同。

Metzgar等的研究表明，以2bp-6bp为重复单位的SSRs 在六种植物的非编码区中均大量存在；同时该研究还发现，在蛋白质编码区中，以3bp和6bp为重复的单位出现的频率次数最高。

上述现象说明，SSRs可能与蛋白质编码区突变机制中的负向选择效应有关[11]。

传统的SSR分子标记首先要制备基因组DNA片段，再从中筛选出较小的DNA片段，然后连接到载体上并转化进入大肠杆菌中构建基因组文库。

传统的SSR分子标记开发方法简单、易掌握，但必须对每个克隆进行筛选鉴定，工作量大，需花费大量的人力、物力和财力，而且效率也不高。

2.4.3 第三代分子标记——单核苷酸多态性
单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs）作为一种新型的分子标记技术，在生物的遗传多样性以及分子进化的研究中发挥了重要的作用。

SNPs是指生物基因组脱氧核苷酸序列中因为单碱基发生替换而导致点突变的发生，一般情况下其在群体中的分布频率大于1%。

若以SNPs在生物基因组中分布的位置，可以将SNPs细分为以下几种类型：基因编码区SNPs（cSNPs）、基因周边SNPs（pSNPs）和基因间SNPs（iSNPs）[12]。

大部分的SNPs都分布于基因组的非编码区中，尽管这些SNPs对生物个体的表型并不会造成直接的影响，但若从一个群体的角度出发，这些SNPs作为分子标记在该群体的遗传多样性和分子进化研究中却具有十分重大的研究价值。

由于水稻基因组序列全图的绘制完成，使得水稻SNPs的研究更为方便。

将样本DNA目标区段测序，然后在已发布的籼、粳亚种基因组全序列中进行Blast，比较目标DNA的同源序列，即可获得该区段的SNPs位点。

Feltus等采用该方法对比粳稻和籼稻93-11的基因组序列，发现了水稻基因组中大量的SNPs[13]。