酶与酶工程--碳酸酐酶及其研究进展 2

碳酸酐酶及其研究进展碳酸酐酶( carbonic anhydrase, CA)是一种锌酶。

在哺乳动物中, 几乎所有的组织都可检测到CA。

CA至少有14种同工酶[1] , 其结构、动力学性质、对抑制剂的敏感性、组织内的分布以及亚细胞的定位都有不同,它能参与机体气体运输、酸碱调节和组织的分泌等功能, 在维持内环境的稳定方面发挥着重要作用。

1933年，人们已从血液中提取出了碳酸酐酶，直到1940年才在动物红细胞研究中确定碳酸酐酶含有锌。

它是红细胞中仅次于血红蛋白的蛋白质组分。

人和动物血液中的碳酸酐酶相对分子量约30KDa，由单一肽链组成，每个分子含一个Zn(II)离子，酶蛋白约含260个氨基酸残基，其中脯氨酸含量最高，没有二硫键。

碳酸酐酶有多种同工酶，它们不仅选择性识别HCO2-和CO2作为催化底物和产物，也不规律地识别磷酸酯|羧酸酯|醛类等分子[2]。

.1、CA的分布根据碳酸酐酶氨基酸序列的不同, 人们主要将其分为α、β、γ、δ、ε五种不同类型的酶。

其中α-CAs存在于脊椎动物、细菌、藻类及绿色植物的胞浆中；β-CAs 存在于高等植物及藻类叶绿体中, 对植物光合作用过程中CO2 的获取及CO2 浓度的维持有着必不可少的作用; γ-CAs则主要存在于太古细菌及一些细菌中；δ-CAs主要存在于海洋硅藻中；ε-CAs是近年来才确定的类型, 主要存在于蓝细菌及一些化能自养型细菌中。

多年来人们对碳酸酐酶的研究主要集中在与人类关系密切的α-CAs和β-CAs上。

α-CAs 在氨基酸序列上存在20~60% 的同源性, 哺乳动物的几乎所有组织中都含有参与机体多种生命活动的α-CAs。

目前的研究表明，α-CAs 至少存在14 种不同的同工酶：CAI III，CA VII 及CA XIII为胞浆酶；CA IV，CA IX，CA XII和CA XIV为膜连接酶；CA V为线粒体酶；CA VI则存在于唾液中；另外还有3 种已知的非催化形式的碳酸酐酶相关蛋白( CA Related Protein，CARP)—CARP VIII，CARPX及CARPXI [3]。

在人体中，CA I, CAII和CAIII为细胞质酶。

CAI存在于红细胞、胃黏膜上皮细胞中, 慢收缩骨骼肌细胞中存在CAIII。

CAII存在于胃肠道、肾、附睾、快收缩骨骼肌细胞、破骨细胞、脑脉络丛及眼部细胞内。

CAIV, CAIX , CAX ,CAXII 锚合于细胞膜, 但酶发挥作用的部位是细胞外。

CAIV存在于胃肠道、肾、附睾、输精管、骨骼肌、皮下平滑肌、脑毛细血管上皮细胞、心肌及眼部毛细血管、肝、泪腺等处。

在人类组织中CAXII表达于肾[4]、结肠、前列腺、胰腺、卵巢、睾丸、肺、脑中。

此外，在哺乳动物肝的线粒体中存在高活性的CA V [5]，1987 年从唾液中纯化分泌型酶CA VI，在唾液腺和小脑浦肯野氏细胞可见CA VII。

近年来发现肿瘤组织内存在CA 的同工酶[6]，不同的肿瘤组织有不同的CA同工酶表达，如CAIX和CAXII在胃癌中表达, 乳腺癌中，CAIX表达与其预后有关[7]。

CAII是人类研究最为广泛，也最为深刻的CA同工酶。

2、CA的结构在CA活性中心存在一个Zn原子, 对于CA的催化活性来说是必需的。

在CA I 和, CAII中Zn原子以单体形式存在, 在CAIII中以二硫键相连的二聚体形式存在。

以碳酸酐酶II为例，其含有260 个氨基酸残基、分子量为29246Da，活性中心含有催化所必需的Zn2+的金属酶。

Liljas 等于1972 年首次得到了人类碳酸酐酶II( hCA II) 的X晶体结构衍射图, Eriksson 及Hakansson等又分别于1988 年、1992 年对其结构进行修正, 得到了更高分辨率的hCA II的X 晶体结构图。

晶体结构研究显示人碳酸酐酶2（hCAII)的活性中心：由三个组氨酸残基（His-94，His-96和His-119），和一个水分子与一个锌原子配位所形成的一个畸变四面体结构所组成[2]。

附近有一个由Val-142，Val-121，Trp-209和Leu-198所构成的疏水口袋和由Thr-199和His-64所组成的一个质子转移通道，如图1所示。

图1. 人碳酸酐酶2（hCAII)活性中心示意图在CAII的空间结构中, 只有位于酶分子N末端，约由24 个氨基酸残基组成的区域与酶呈松散连接, 除此之外, 整个CA II分子近似于球形, 体积大小约5 nm×4 nm × 4 nm。

其主要二级结构为位于酶分子中的10 条β-链, 由于它们的存在, 使得该酶被分为两个部分, 酶分子中与其活性相关的许多关键氨基酸残基位点都位于该结构中。

除β-链结构外, 酶分子表面还分布有一些相对较短的α-螺旋结构。

如图2：图2. 碳酸酐酶II的一级结构及高级结构图3、CA的催化作用CAII的主要功能是可逆性催化CO2和HCO3-的相互转化( CO2+ H2O↔HCO3- + H+ )，其催化作用主要是通过酶活性区域内的一系列重要氨基酸残基及与这些残基配位连接的Zn2+来实现的。

CAII对CO2的催化过程主要可以分为两个步骤：( 1) 生理条件下，与Zn2+相连的H2O去质子化形成EZnOH-，由于氢键系统等结构的存在，使得与Zn2+相连的OH- ( EZnOH- ) 中的氧具有很强的亲核性, 它能亲核进攻结合于疏水袋中的底物CO2，首先形成EZnHCO3-，EZnHCO3-中的HCO3-被溶剂水分子取代，形成EZnH2O 和HCO3-；( 2) EZnH2O 通过酶分子中的质子转运体将质子(H+) 转运至溶剂中，并还原产生有催化活性的EZnOH-。

在催化过程中H+ 向溶剂中的转运主要是通过位于酶分子活性区域的His-64 来实现的，并且分子内质子向溶剂中转移的步骤也是CAII催化反应中的限速步骤。

4、CA的功能在肺部，红细胞内的HCO3-与H+生成H2CO3，CAI、CAII加速H2CO3分解成CO2和H2O，CO2扩散入血浆，而血浆中的HCO3-进入红细胞以补充消耗的HCO3-。

因为肺泡气的PCO2比静脉血的低，血浆中的CO2可扩散入肺泡。

这样，以HCO3-形式运输的CO2在肺部被释放出来[9]。

某些研究证实CA抑制剂(如乙酰唑胺) 可引起轻度代谢性酸中毒，既而兴奋呼吸中枢，使呼吸加深、加快，动脉CO2分压( P CO2 ) 下降，动脉O2 分压( P O2 ) 增高[10]。

在一般膳食情况下, 肌体内的酸性代谢产物多于碱性代谢产物, 肾通过重吸收HCO3-和分泌H+，参与机体酸碱平衡的调节。

正常情况下，碳酸酐酶广泛分布于各段肾小管,近曲小管重吸收H CO3-的机制是[11]：在CA II的作用下，近端小管上皮细胞中CO2和H2O在CA II的催化下形成H2CO3，然后迅速解离为H +和HCO3-。

H+在细胞膜顶端经N a+/H+泵转运进入近曲小管腔中，HCO3- 经Na+—HCO3-联合转运器被转运至血液中，小部分通过Cl-—HCO3- 逆向转运方式进入细胞外液[12]。

分泌至小管腔中的H+和HCO3-结合形成H2 CO3，在CA II作用下H CO3迅速解离为CO2和H 2O, CO2和H2O弥散回小管细胞中，再次进行CA催化的2水化反应，形成H +和HCO3-。

由此可见，近端小管重吸收HCO3-是以CO2的形式进行的，CA在HCO3- 重吸收过程中起重要作用。

胃的壁细胞含有丰富的CA，可参与盐酸的合成与分泌[9]。

具体过程如下：细胞代谢产生的和从血液进入细胞的CO2，在CA的催化下，与H2O结合形成H2 CO3，并迅速解离为H +和HCO3-；H +逆浓度梯度被H+泵泵入分泌小管,再进入腺泡腔；HCO3- 经Cl-—HCO3-逆向转运体与C l-交换，被转运出细胞，最终进入血液；Cl-进入细胞后，通过氯通道进入小管腔和滤泡腔，与H+形成HCl。

近年用CA 抑制剂对乳头肌收缩功能的研究表明：酶的抑制可导致乳头肌收缩机械力的下降, 甚至引起细胞内酸中毒, 对此的解释是CAIV与心肌中CO2的易化扩散有关, CA IV受抑, 则依赖于酶活性的Na+、HCO3-转运伴随的泌H+过程也受抑, 进而引起细胞内酸中毒, H+/Ca2+交换减少, 严重影响乳头肌收缩。

与骨骼肌相比, 心肌中CA的含量很低。

因此CA可用于急性心肌梗死( AM I) 的鉴别诊断, 达到快速确诊的目的[13]。

在红细胞内, 可分离出3种CA( CAI、CAII 和CAIII )。

CAI在红细胞内是一种重要的非血红蛋白的蛋白质，其生理活性较CAII低，CO2的水化转化率为2 ×105 / s[14]。

CAII与红细胞的羧基端相连，对于CO2的水化转化率很高, 在25e，pH 9.0的环境大约为106 /s[ 14]。

CAIII在红细胞的浓度比CAI 和CAII低, 是一种低活性的酶, 最大CO2水化转化率为8 ×103 /s[14]。

它的功能是清除氧原子团，具有抗氧化作用。

红细胞中CA的作用：从组织中扩散进入毛细血管血液中的CO2可溶解于血浆，其中绝大部分扩散进入红细胞，与H2O 反应生成H 2CO3, H2CO3解离成HCO3- 和H +。

如果没有CA的催化，CO2转变为HCO3-大约需要1 m in方可完成。

与血液流经毛细血管的速度(1s) 相比，这一时间太长了。

红细胞内含有高浓度的CA，在CA催化下，上述反应可加快5 000倍，不到1 s即达平衡。

在此反应中生成的H+, 大部分与血红蛋白结合而被缓冲，生成的HCO3-与红细胞内的K+结合。

随着碳酸氢盐浓度的不断增加，HCO3-顺着浓度梯度通过红细胞膜扩散进入血浆，与血浆中的N a+结合，生成碳酸氢盐。

由此可见，红细胞CA参与了机体内CO2从组织向血浆的转运。

5、CA与疾病虽然碳酸酐酶II催化的只是一个简单的生理反应, 但是其催化的底物CO2 及产物HCO3-、H+却与人体多种生理及病理活动关系密切, 如呼吸过程中代谢组织与肺之间CO2PHCO3-的转运, pH 与CO2浓度之间的平衡, 组织器官中电解质的分泌, 青光眼、骨质疏松症、癫痫等疾病的形成。

眼内压增高是眼内房水流入与流出之间平衡失调的表现, 也是青光眼的主要特征。

降低眼内压是阻止疾病恶化致盲的唯一有效方法, 这也是目前青光眼治疗的主要手段，其中降低眼内压的一条主要策略就是减少房水的流入。

抑制眼内睫状体上皮细胞内的CAII的活性, 即能有效达到这一目的。

CA II催化CO2水合产生的HCO3-经细胞分泌、血管渗出于房水中, 为了保持房水中液体的电中性, Na+向房水中分泌增加, 同时带动Cl-也向房水中转移, 从而使房水中形成高渗透压,于是促进H2O 向房水流动, 维持房水平衡和正常的pH 值。