云芝多糖的提取

云芝多糖的提取分离第一章文献综述云芝是担子菌纲云芝属的一种杂色菌，腐木生，是珍贵的药用真菌，其子实体具有清热消炎之功效，临床上用于治疗慢性气管炎，慢性肝炎等疾病[1]。

这只要是和云芝多糖密切相关，云芝多糖（PSK）是从担子菌纲云芝（Coriolus versicolor in basidiomycete）中提取的一种蛋白质多糖，它具有免疫调节功能，已用于肿瘤和炎症的辅助性治疗[2]。

它能激活免疫细胞，提高机体免疫功能而对正常细胞没有毒副作用[3]。

根据张翼伸等的报道[4]，用水醇提取法从天然云芝子实体中分离提取，获得了糖和蛋白含量较恒定的蛋白结合多糖，通过对其生物学效应的研究，发现小鼠腹腔注射PSK有提高其腹腔巨噬细胞硒谷胱甘肽过氧化物酶（SeGSHPx）的活性和基因表达水平，保护巨噬细胞免受tbOOH和氧化修饰LDL（Ox-LDL）引起的脂质过氧化物损伤[5-9]。

现在除了用水醇提取法以外，还有的人采用盐提法，酸提法甚至超声波法等等。

1.1水提法不同因素的比较1.1.1真菌多糖提取条件影响真菌多糖提取率的因素很多，有培养方法，提取原材料的状态，温度、介质、介质浓度、提取时间、浸提次数、原料的预处理等等，做真菌多糖的提取时要充分考虑到这些因素，因为一个因素的不同就会对提取量造成很大的影响。

1.1.2原材料对多糖提取的影响真菌原材料的不同对多糖的提取会产生一定的影响，有研究指出姬松茸菌丝体的多糖提取率高于子实体[10]。

而香菇现在则多从子实体中提取多糖，当存在着周期长，成本高等问题。

而且就算同是从云芝中提取多糖，还有野生和栽培之分，根据田光辉等人的研究，发现栽培的云芝用水提法提取出的多糖含量要高于野生菌株。

1.1.3提取方法的比较水提法中还包括了不同的提取方法，有干提法，湿提法等等。

参考国内外已有的研究资料，基本可以归类为三类：A.将湿菌丝体不做任何处理，直接加水提取；B.将菌丝体烘干，粉碎，加水提取；C.将菌丝体用组织捣碎机捣碎后，加水提取。

在香菇多糖的提取中组织捣碎法得到的多糖量最高[11]。

1.1.4不同加水比例对多糖提取的影响首先，先看水体积对提取的影响，用水来提真菌多糖的方法与加入其中的水的体积有着密切的关系，不同的真菌对水的比例会有不同的要求。

要是水的体积没有达到一定的程度就会严重的影响提取的效果，提出的多糖量会变得很少，大部分的真菌多糖最佳提取水比例为1：30，如灵芝、平菇等。

根据臧晋、黄开勋的研究，灵芝多糖的提取水体积一般为1：30。

要是在这个比例之下它的提取效果会非常得不好，要是水的体积再增加它的提取量增加的也就不显著了。

而在提取银耳多糖时水的最佳比例是1：50[12]。

相比较而言，水对白灵菇多糖的提取影响很大，在1：30～1：40时效果最好。

若加水过少，多糖浓度过高不利于多糖的浸出，若加水过多则浸提液过多不利于以后的分离[13]。

也有低于1：30这个比例的，像五味子多糖得提取，它的水比例在1：25之后影响就不明显了[14]。

而从茶薪菇发酵菌丝体中提取多糖只需要加入10倍的蒸馏水[15]。

1.1.5不同提取温度对多糖产率的影响温度是多糖提取的关键因素之一。

对于平菇来说在90℃的条件下提取可以达到较高的多糖得率。

温度过低则溶剂的渗透能力和溶剂能力降低，使多糖不能有效溶出，温度过高则导致多糖得破坏，使多糖得率降低[15]。

而白灵菇的提取温度一般在80～90℃之间，温度对它的影响和平菇是类似的[13]。

温度对五味子多糖的提取率有显著的影响，温度的上升伴随着多糖提取率的显著上升，在100℃条件下多糖得提取率几乎是85℃时提取率的两倍[14]。

银耳相对于以上几种真菌要显得特殊一些，它的多糖在提取时要经过一个灭酶的过程，因为它在水提时要加入1%的果胶酶。

它先在45℃得水浴中浸提，在98℃经过灭酶后再保温浸提[12]。

1.1.6不同提取时间对多糖产率的影响一般而言，随着浸提时间的增加，多糖得提取率也有所增加，但是，这种增加会有一种减慢的趋势，找出提取的最佳时间能够大大的提高提取的效率。

当然，不同的真菌会有不同的最佳时间点。

以平菇为例，平菇的提取时间是属于比较长的，要达到7～8个小时，8个小时以后它的提取量增加程度会明显的下降[16]。

需要较短时间的有茶薪菇菌丝体，它的提取时间一般设为4个小时[15]。

在同等条件下，白灵菇提取3～4个小时较为合适[13]。

根据专家对姬松茸的研究，在94℃条件下，提取两次，以1：25的比例加水则发现，在时间低于3小时时，得率随提取时间的延长增加很快，超过3小时后则增加缓慢。

这表明，产物溶解于水有个过程，时间过短，产物溶解不充分，但时间过长又易引起产物结构的破坏和生物活性的丧失，并使生产效率降低，所以，姬松茸的提取时间以3～4为好[17]。

1.1.7不同乙醇浓度对提取量的影响用水提法提出多糖后用乙醇沉淀，乙醇的浓度也是需要考虑的重要因素。

用乙醇沉淀多糖，有时不同浓度的乙醇可沉淀出不同组分的多糖。

一般情况下，多糖的分子量越大，被沉淀下来所需要的乙醇浓度越小；乙醇浓度越大，沉淀下来的多糖分子量越小，多糖得率越高[18]。

从白灵菇子实体中提取到的多糖用70%～80％浓度的乙醇为宜，以80%最佳，乙醇浓度大于80%，多糖得率增长缓慢。

而对灵芝多糖只需要加入75%的乙醇就可以达到最佳效果。

1.1.8不同提取次数对提取量的影响提取次数直接影响胞内多糖的得率，在进行姬松茸多糖的提取时，到第四次提取，粗多糖得率已处于较低水平，而过度增加提取次数，反而会使生产效率降低，因此姬松茸多糖的提取以3次为宜[18]。

而灵芝的提取相对来将需要的提取次数就要少的多,根据研究得出,灵芝提取两次就能达到提取率90%以上了.1.2研究的目的及意义近几年，真菌多糖受到了人们越来越多的关注，更多的真菌多糖被作为保健因子添加到了食品中，这种食品受到了人们的欢迎。

其中云芝多糖因为具有抗细菌、霉菌及病毒的功能，刺激巨噬细胞转化，增加血液里的白细胞介素α、γ干扰素及肿瘤坏死因子的作用，能抑制癌细胞的生成[1][19].近期对云芝多糖提取分离的研究也日趋热门。

本实验主要是根据前人研究的基础上参考真菌多糖的提取工艺，分析及改进云芝多糖的提取工艺，选取出提取云芝多糖的最佳工艺。

第二章、实验部分2.1．实验材料2.1.1菌种来源云芝菌种，本实验室保藏的菌种2.1.2实验设备2.1.3实验试剂2.1.4培养基种子培养基：黄豆饼粉，1.2%；葡萄糖，1%；酵母膏，0.4%；KH2PO4，0.1%；无水MgSO4，0.05%；pH调至5.5发酵培养基：淀粉，2%；葡萄糖，1%；蛋白胨，0.4%；无水MgSO4，0.1%；（NH4）2SO4，0.1%；KH2PO4，0.1%；V B1；高温淀粉酶适量。

2.2实验方法本实验是采用水提醇沉法从云芝的菌丝体中提取分离多糖成分。

水提法是目前在实验室中比较常用的提取多糖的方法，他有着许多的优点，比如说：他实验方法简单易操作，提取率比较高等等。

本实验主要是考虑到水提法会受到多种因素的影响，研究这些因素对其到底有何影响，影响会有多大，最终采用正交实验得出最佳提取方案。

2.2.1菌丝体的制备一级种子制备：二级种子制备：以10％的接种量降一级种子接种至200ml发酵培养基（以500ml三角瓶盛装），160rpm，28℃培养5d.三级种子的制备：发酵培养：菌丝体的收集与保存:干菌丝体的制备：接种云芝菌所需要用的培养基成分：以每瓶200ml计算，其中包含黄豆饼粉2.4g，葡萄糖2g，酵母膏0.8g，KH2PO4 0.2g，无水MgSO4 0.1g，经过灭菌即可。

接种菌时要注意必须在无菌操作台上工作，接种完以后放在摇床上培养5天。

要随时注意观察菌的生长情况，等长成浓密的类似小球的菌以后就可以进入下一道步骤了。

从摇床上取下的云芝菌还要在发酵罐中进行扩大培养，扩大培养的培养基成分为：淀粉2%，葡萄糖1%，蛋白胨0.4%，无水MgSO4 0.1%，(NH4)2SO4 0.1%，KH2PO40.1%，VB1,高温淀粉酶少许。

首先要在7L的小罐中进行，给予菌适当的罐压，温度等条件,一般设定温度为28℃，罐压设定为0.03～0.05mpa,要维持一定的压力。

经过大约两三天的培养以后，如果种子生长情况良好的话就可以进入大发酵罐了。

70L的大发酵罐中所加入的培养基与7L小发酵罐是一样的，按照40L左右的量来配料，接入菌以后，同样的，温度设定为28℃，压力维持在0.03～0.05MPA之间。

观察菌的生长情况，在三天之后大概可以下罐。

下罐后的菌还要经过一定的处理。

因为下罐后的菌用碘酒检验时发现仍然有淀粉的存在。

所以，下罐后的菌要先用两层纱布过滤，去掉多余的淀粉液。

然后再混入一些清水，用80目筛子在流水下冲洗。

再次清洗过滤，因为发酵时淀粉并没有完全消化完，必须要将淀粉洗掉，否则淀粉作为多糖的一种会对以后多糖测定时造成干扰。

将处理好的菌压干，放入冰箱存放。

2.2.2多糖的提取工艺流程：菌丝体水提取滤液加入酒精沉淀离心取沉淀蒸馏水溶解测定多糖含量2.2.4干菌丝体和湿菌丝体提取的比较用云芝菌丝体提取多糖时首先需要考虑的就是它本身的原因。

干菌和湿菌的提取率的差别是本实验首先要解决的问题。

准确称取干燥后的云芝2.0001g，按照菌丝体与水1：40的比例加入蒸馏水80ml，放入三角瓶中，混合均匀。

使用水浴锅于95℃左右抽提1h。

过滤得到滤液，加入95％的酒精至终浓度70％，混匀，于4℃沉淀过夜。

4000～6000rpm 离心10min，再将沉淀用合适的蒸馏水溶解，以苯酚硫酸法测定多糖的含量，并计算菌丝体中的多糖含量。

菌丝体多糖含量（g/g干菌丝体）＝取冷冻的湿菌丝体，解冻后用组织捣碎机，根据湿菌丝体的含水量加入适量蒸馏水，使最终干菌丝体与水的比例为1：40。

同干菌丝体进行提取，并测定多糖的含量。

多糖含量计算公式为：2.2.5不同提取时间的比较在这个实验中，时间因素是一个非常重要的因素，提取时间的不同将直接影响到提取量。

我们在做这个实验时选取了六个时间段，因为考虑到时间的重要性，需要多做几组来得出最佳效果。

分别选取1.0h，1.5h，2.0h，3.0h，4.0h，5.0h。

其余条件均与湿法提取的相同，即按照1：40的比例来加入水，在95℃的水浴锅中进行抽提。

抽提后的糖液用乙醇来沉淀，在用苯酚硫酸法测出它的分光光度值，进而计算出糖的提取量。

由前人的经验来看，一般提取时间越长，提取量就越多，但是随着提取时间的增加，提取量的增率逐渐减小，会呈现出一定的趋势。

称取云芝菌丝体30.0g，按照1：40的比例加入蒸馏水，然后在95℃的水浴锅中抽提，具体抽提时间分别为1.0h，1.5h，2.0h，3.0h，4.0h，5.0h。