2020年测定蛋白酶活力实验(课件)
蛋白酶活性测定
1.5.2.2 蛋白酶活性测定采用福林酚−试剂法[3]测定肠道及肝胰脏中蛋白酶活性，其原理是：蛋白酶从变性的酪蛋白中分解出可溶于三氯醋酸（TCA ）氨基酸，如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等，这些氨基酸可与福林酚试剂反应呈蓝色，用756分光光度计在波长680nm 测定。
蛋白酶活性的定义：1克食糜或组织在30℃，pH7.0[4]的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg 酪氨酸的酶量为1个蛋白酶活力单位。
测定步骤如下：将2%的酪蛋白溶液放入30℃恒温水浴锅中预热3-5min ，每个样品取两个重复（每个酶液样品设一个空白对照），各取1mL 酶液注入试管中，在30℃恒温水浴锅中预热1-2min ，加入2%的酪蛋白1mL ，准确反应10min ，加0.4M 三氯醋酸2mL 终止反应，在水浴锅中静置10min 后过滤，取滤液0.5mL 加0.4M 碳酸钠溶液2.5mL ，并加入显色剂福林试剂0.5mL 摇匀，在30℃恒温水浴中显色20min ，取出放在756分光光度计，680nm 的波长下测定吸光度（OD ）。
蛋白酶活性计算公式：4—反应总体积(mL) 10—反应时间(min) K —标准曲线获取 N —酶液稀释倍数 M —样品质量(g)A. Setting up the Protease Assay1. Pre-heat 0.5% Casein solution In a water-bath at 30 o C for 5min2. Follow the following table蛋白酶酶活性(U/g) =4×K×OD×N 10×M3.4.Follow the following table to determine sample blank。
（食品化学）实验四、蛋白酶酶活力的测定
实验四、蛋白酶酶活力的测定一、原理以酪蛋白为反应底物，令蛋白酶在其最适宜条件下反应一定时间，用三氯乙酸终止反应后过滤或离心得上清液，用Folin比色法测上清液中蛋白酶解物的浓度，计算蛋白酶活力。
蛋白酶活力定义：在一定的条件下，每分钟水解酪蛋白生成与1μg酪氨酸相当的三氯醋酸可溶物所需的木瓜蛋白酶的量，为1个酶活力单位（u）。
二、材料、仪器与试剂（一）材料：木瓜蛋白酶（二）仪器：可见-紫外分光光度计、水浴锅、天平、具塞刻度试管（10、15ml）、漏斗、滤纸、试管架，容量瓶、移液管（1、10ml）、烧杯（25ml）、玻璃棒。
（三）试剂：1福林试剂(Folin试剂)市场购买的Folin试剂。
此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释，即成已稀释3倍的福林试剂。
2、中性稀释液－pH7.2磷酸盐缓冲液称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.2g,定容至1000mL,即成0.2mol/L溶液(A液)。
称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.63g,定容至1000mL,即成0.2mol/L 溶液(B液)。
取A 液28mL 和B 液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1mol pH7.2的磷酸盐缓冲液。
3、酪蛋白溶液2g恒重的酪蛋白，用0.5mol/LNaOH溶液润湿后加入80ml pH7.2磷酸盐缓冲液，沸水浴溶解，冷却后，用1 mol/L盐酸调至pH 7.0，再用磷酸盐缓冲液定容至100ml，得浓度为2%的酪蛋白溶液。
临用现配。
4、三氯醋酸溶液称取三氯乙酸(CCL3COOH)65.4g,定容至1000mL，得0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液5、酪氨酸标准溶液精确称取精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g，逐步加入6mL 1N盐酸使溶解,用0.2N盐酸定容至100mL,其浓度为1000μg/mL,再用水稀释5倍，得到200μg/mL的酪氨酸标准溶液。
取200μg/mL的标准酪氨酸溶液，配成不同浓度的溶液（0、20、40、60、80、100μg/mL）6、样品溶液称取木瓜蛋白酶0.100g, 置于研钵中,加入相应的缓冲液定容至50mL,得到稀释500倍的酶液（当天配制、稀释）。
实验四蛋白酶活力的测定
实验四、蛋白酶活力的测定1.实验目的掌握用Folin-酚法测定蛋白酶活力的方法，与Azocasein（偶氮酪蛋白）法作为比较。
2.实验原理蛋白酶在一定的温度和pH下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），在碱性条件下，将福林试剂还原，生成钼蓝和钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比，通过在660nm测定其吸光度，可得到酶解产生的酚基氨基酸的量，计算出蛋白酶活力，以此代表蛋白酶的总酶活力。
酶活单位定义：在37℃、相应的pH条件下，在1min内水解酪蛋白底物，产生相当于1µg酚类化合物（由酪氨酸等同物表示）的酶量，为1个酶活单位。
3.主要仪器和试剂试剂：0.1mg/mL L-酪氨酸标准贮备溶液、0.55mol/LNa2CO3、福林试剂、Casein溶液、TCA 溶液仪器设备：恒温水浴锅、分光光度计、pH计，分析天平、秒表。
4.实验步骤（1）标准曲线绘制取三支试管（一支空白，两支样品管），分别向三支试管中准确加入5mLcasein基质液，将三支管放入37℃水浴中预热10min分别向两支样品管中加入1mL稀释酶液，准确计时，反应30min，取出迅速加入5mLTCA；空白管先加TCA预热30min再加稀释酶液，摇匀。
将三支试管继续置于37℃水浴中放置30min，取出，迅速冷却至室温。
三支试管中反应液用滤纸过滤。
另取三支试管（一支空白。
两支样品管），分别吸取上述相应的滤除液2mL，加入碳酸钠溶液5mL，稀Folin试剂1mL，摇匀，在37℃水浴中放置30min，取出，迅速冷却至室温。
以空白管为对照调仪器零点，在分光光度计波长660nm下，用比色皿分别测二支样品管中酶液的吸光度，取平均值，通过标准曲线求出生成的酪氨酸的含量。
5.数据处理。
蛋白酶活性的测定方法
结果分析
酶活性计算
根据实验数据，计算蛋白酶的活性，包括比活力和米氏常数等参 数。
显著性检验
通过t检验、方差分析等方法，对实验组和对照组之间的差异进行 显著性检验，确定实验结果是否具有统计学意义。
可重复性评估
评估实验结果的重复性，判断实验方法的可靠性和稳定性。
误差分析
误差来源
分析实验过程中可能存在的误差来源，如试剂不纯、 操作误差、仪器误差等。
电化学法
总结词
电化学法是一种快速、简便的蛋白酶活性测定方法，通过电化学信号的变化来检 测酶的活性。
详细描述
电化学法利用电化学探针或电极检测酶反应过程中产生的电化学信号，如电流、 电位等，通过分析这些信号的变化可以计算酶的活性。该方法具有快速、简便和 实时监测等优点。
核磁共振法
总结词
核磁共振法是一种高分辨率、高灵敏度的蛋白酶活性测定方法，通过检测核自旋磁矩的变化来计算酶的活性。
酶液的保存
选择适当的保存条件，如温度、pH值和添加稳定 剂等，以确保酶液的活性。
反应条件优化
温度对酶活性的影响
通过在不同温度下测定酶活性，找到最适温度范围，确保酶活性 的最大化。
pH对酶活性的影响
在不同pH条件下测定酶活性，找到最适pH值，确保酶活性的最大 化。
底物浓度对酶活性的影响
通过改变底物浓度，观察酶活性的变化，找到最佳底物浓度。
在测定过程中，可能存 在异常值、缺失值或重 复数据，需要进行数据 清洗，确保数据准确性 和可靠性。
图表绘制
通过绘制图表，如柱状 图、折线图或散点图， 可以直观地展示蛋白酶 活性随时间、温度、pH 等参数的变化趋势。
数据转换
根据需要，对数据进行 适当的数学转换，如对 数转换或归一化处理， 以便更好地分析数据。
胰蛋白酶的活力的测定完美版PPT
1、专一性研究 通过研究酶的专一性底物的结构特点，来判断 和确定活性中心的结构特点。
2、酶侧链基团的化学修饰法 酶分子中可以被化学修饰的基团 很多，如巯基、羟基、咪唑基、氨基及羧基 等。
四、酶的命名与分类
习惯命名法
按催化反应类型分类 脱氢酶、脱羧酶、连接酶、聚合酶等。 按组织来源及性质分类 胃蛋白酶/胰蛋白酶，酸性/碱性磷酸 酶等。
酶活力与酶反应速度 初速度 研究酶反应的动力学以酶促反应的初速度为准
产物量
18
16
14
12
10 8
系列1
6
4
2
时间
0
0
5
10 15 20
时间
以N-苯甲酰-L—精氨酸乙酯为底物，用紫外吸收法进 行测定的原理是：N－苯甲酰－L—精氨酸乙酯英文缩 写为BAEE）在波长253nm下的紫外吸收远远弱于苯甲 酰L—精氨酸（英文缩写为BA）。在胰蛋白酶的催化 下，随着酯键的水解，苯甲酰L—精氨酸逐渐增多，反 应体系的紫外吸收宜随之相应增加。
五、酶的活力测定
酶活力（enzyme activity），是指酶催化一定化学反 应的能力。
酶活力单位（国际单位） 标准状态下，每分钟使一微克 分子作用物发生转变的酶量。人们普遍 采用是习惯用法，如 a-淀粉酶，可用每小时催化1克可溶性淀粉所需要的酶量来表 示。
胰蛋白酶活力单位的定义规定为：以BAEE为底物反应液pH8.0， 25℃，反应体积3.0ml，光径1厘米的条件下，测定A253，每分 钟使A253增加0.001，反应液中所加入的酶量为一BAEE单位。
的紫外吸收远远构弱于区苯域甲酰，L—与精氨催酸化（英作文缩用写直为B接A）相。 关。
样品胰蛋白酶BAEE活性单位＝
蛋白酶酶活力的测定
五、心得体会
一、在本实验中的对照组是为了证明在酸性条件下，胰蛋白酶无法催化酪蛋白水解；空白对照是要排除蒸馏水能与Folin试剂产生蓝色这种可能的存在。
二、稀释的酶溶液不能长期使用。因为酶的活性并不能长期保持，放置时间过长会导致酶活性丧失而引起较大实验误差，甚至无法完成实验。
六、参考文献
实验报告
课程名称：食品化学与分析实验指导老师：_冯凤琴_____成绩：__________________
实验名称：蛋白酶酶活力的测定实验类型：定量实验
一、实验目的二、实验原理三、材料、仪器与试剂
四、实验步骤五、结果及分析六、讨论七、参考文献
一、实验目的
1、了解蛋白酶的作用机理和作用条件。
2、掌握测定酶活力的方法及其原理。
三、材料、仪器与试剂
（一）材料：木瓜蛋白酶、酪蛋白、酪氨酸
（二）仪器：可见-紫外分光光度计、水浴锅、天平、具塞刻度试管(10、15ml)、试管架，容量瓶(100、500ml、1000mL)、移液管(1、10ml)、烧杯(25ml)、玻璃棒。
（三）试剂：
1、0.5mol/LNaOH溶液：取4gNaOH固体，溶解后，定容在100mL蒸馏水中
四、实验步骤
（一）酪氨酸标准曲线制作
1、取6只干燥、洁净的试管，编号为1~6。
2、按照下表所示配方，分别用移液管向各试管中加入相应物质，震荡混匀。
3、在40℃水浴中显色20分钟，于680nm波长处进行比色，以1号试管为空白组，测各组溶液的吸光值并进行记录。
试管编号
1
2
3
4
5
6
200μg /mL标准酪氨酸溶液(mL)
1、《食品化学》作者冯凤琴，陆柏益等出版社：浙江大学出版社
蛋白酶活力测定
3
在实际应用中，蛋白酶活力测定具有广泛的应用 价值，如食品工业中蛋白质水解、洗涤剂生产中 的酶催化反应等。
研究展望
随着生物技术的不断发展，蛋白酶活力测定技术也在不断改进和完善。未来，可以通过开发 新型的蛋白酶活力测定方法，提高测定灵敏度和特异性，进一步拓展其应用范围。
在研究蛋白酶的底物特异性、抑制剂作用机制等方面，可以结合计算机模拟技术、光谱学技 术等手段，深入探究酶的催化机制和作用机理。
随着蛋白质组学和代谢组学研究的深入，蛋白酶活力测定在生物标志物发现、疾病诊断和治 疗等方面的应用将更加广泛。同时，随着人类对生物大分子结构和功能的认识不断深入，蛋 白酶活力测定在药物设计和发现等领域也将发挥更加重要的作用。
THANKS
感谢观看
数据记录与处理
06 详细记录实验数据，并进行必
要的计算和处理，以得出实验 结论。
实验操作技巧
温度控制
确保酶反应在恒温条件下进行，以减 少温度对酶活力的影响。
02
pH调节
使用适当的缓冲液调节反应液的pH值， 以保证酶活力的稳定。
01
03
避免污染
在整个实验过程中，要严格控制实验 环境，避免样品和试剂受到污染。
对照实验
进行对照实验时，要确保对照组与实 验组条件一致，以消除误差对实验结 果的影响。
05
04
精确测量
在实验过程中，要使用精确的测量工 具和方法，确保实验数据的准确性。
05
结果分析与解读
结果分析
酶活力单位
通过实验数据，计算出蛋白酶的酶活力单位， 以评估酶的催化活性。
酶促反应速率
分析酶促反应速率，了解酶促反应的进程和 快慢。
底物浓度与酶活力的关系
蛋白酶活力的测定
实验:蛋白酶的活力测定一、实验目的1、学习蛋白酶活力的测定方法。
2、深入了解酶的活力和比活力的概念。
二、实验原理1、酶活力的大小，是以该酶在适宜的温度和pH下，酶催化一定时间后，反应底物的减少量或者反应产物的增加量来表示。
2、本实验蛋白酶的活力大小是以分解出的酪氨酸的量来表示，其单位为：每分钟内分解出1微克酪氨酸的酶量称为1单位。
3、本实验采用福林-酚与蛋白质水解出的酪氨酸生成兰色物，从兰色的深浅程度可以求知酪氨酸的多少，从而确定酶活力的大小。
4、在测酶活力前，先用福林-酚与用已知的不同浓度的酪氨酸作用，作出兰色深浅程度（用光密度表示）与酪氨酸浓度关系的标准曲线。
5、将酶与底物反应产生的产物与福林-酚试剂作用后测光密度，从标准曲线上查出相当于多少微克的酪氨酸，就可以计算出酶的单位了。
三、实验材料、仪器和试剂1.实验材料1398中性蛋白酶粗酶粉（上海新型发酵厂）、滤纸2.仪器（1）试管（1.5*15cm*24) (2)移液管（3）电热恒温水浴（4）721型分光光度计3.试剂（1）福林-酚试剂B（2）标准酪氨酸溶液称取50毫克酪氨酸（预先在105摄氏度烘至恒重），加0.2MHCL溶液后定容至100ml，在加水稀释5倍得到100微克/毫升的酪氨酸溶液。
（3）酪蛋白溶液称取酪蛋白2克，置150ml三角烧瓶中，加入0.2M磷酸氢二钠61ml，在水浴上搅拌使溶解，再加入39ml0.2M磷酸二氢钠，得到pH7的酪蛋白液，倾出上清液备用。
（4）0.4M三氯醋酸溶液（TCA）（5）0.4M碳酸钠溶液四、操作步骤1、酪氨酸标准曲线制作：按下列次序加入试剂，混合均匀，保温，然后在分光光度计上进行比色，测出650nm处的光密度值。
以酪氨酸浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，作出标准曲线。
管号 1 2 3 4 5 62、蛋白酶活力测定 （1）浸出酶液称取0.5克酶粉加入40ml 水，在室温下放置1小时并时加搅动。
将酶浸出液过滤，取滤液1ml 用水稀释至20ml ，即为稀释1600倍的酶液。
生物化学实验课件-影响酶活力的因素-温度和pH
注意事项
注意事项
1.反应试管应清洗干净，不同试剂、酶液以及移液管不能交叉使用。 2.使用混合唾液或者通过预试选出合适的唾液稀释度，效果更为显著。 3.使用完毕的生物试剂（如：人唾液）的无公害处理。
生物化学实验
THANKS
实验步骤 3.pH对酶活力影响
取干净试管5只，按下表加入试剂并操作。
试剂/管号
1
2
3
4
5
0.2mol/lNa2HPO4/ml
0.16
0.56
1.47
2.43
2.84
0.2mol/lNaH2PO4/ml
2.84
2.44
1.53
0.57
0.16
pH
5.6
6.2
6.8
7.4
8
1%淀粉溶液/ml
1
1
1
1
1
唾液淀粉酶可将淀粉逐步水解成各种不同大小分子的糊精及麦芽糖。它们 遇碘呈不同的颜色。直链淀粉(即可溶性淀粉)遇碘呈蓝色；糊精按分子从 大到小的顺序，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色，最小的糊精和麦芽 糖遇碘不呈现颜色。因此可由酶反应混合物遇碘所呈现的颜色来判断。
实验步骤
1.酶的专一性
取干净试管4只，按下表加入试剂并操作。
生物化学实验
影响酶活力的因素-温度、pH
目录 / CONTENTS
CHAPTER 01 CHAPTER 02 CHAPTER 03 CHAPTER 04 CHAPTER 05
实验目的 实验原理 实验试剂 实验步骤 注意事项
实验目的
实验目的
1.掌握温度、pH对酶活力的影响。 2.理解温度、pH影响酶活力的机制。 3.了解测定酶的最适温度、最适pH的方法。
《酶活力测定方法》PPT课件_OK
19
20
3批ｒｈＩＬ 11制品的ＲＰ ＨＰＬＣ图谱完 全一致,说明该厂ｒｈＩＬ 11的生产工艺是稳定 的;与ＧＩ公司生产的ｒｈＩＬ 11对照品比较有 20个峰与对照品一致,但第6 峰的峰高和峰面积均 明显较小,且在第9和第10 峰之间多一个峰,说明 该厂ｒｈＩＬ 11蛋白质结构与ＧＩ公司生产的 ｒｈＩＬ 11比较存在细小差别。
加热：使酶失效
不同的时间取样
终止反应
测定
8
连续测定法：在反应过程中对反应系统进 行直接连续检测。
检测方法： 紫外-可见分光光度法 旋光法 荧光分光光度法 电化学测定法 酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。
9
示例：胰蛋白酶效价测定 胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸） 水解速率：酯键﹥酰氨键﹥肽键 供试品溶液：50～60单位/ml 底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯
供试液的a每分钟改变15相当于的单位数为每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为000316重组人白细胞介素11的胰蛋白酶切肽图分析肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其生产工艺稳定性的重要方法目前常用的方法有cnbr裂解sdspage微量肽图法和胰蛋白酶切rphplc肽图171
2．酶活力测定法
1）基本原理： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶
A1 - A2
0.003 : 1 =
:X
T
A1 - A2 0.003T
每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为
A1 - A2
0.003TW
A1—A 2 P=
0.003 T W
15
重组人白细胞介素 11的胰蛋白酶切肽 图分析
肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其 生产工艺稳定性的重要方法,目前常用的方 法有ＣＮＢｒ裂解ＳＤＳ-ＰＡＧＥ微量肽 图法和胰蛋白酶切ＲＰ ＨＰＬＣ肽图法。
生物化学实验指导课件—枯草杆菌蛋白酶活力测定
实验目的 实验原理 实验仪器与试剂 实验操作步骤
一、实验目的
掌握定量测定蛋白酶活力的方法，了解本实验的酶、底物和生成物的相关 性质，以及本反应的环境条件。
进一步理解酶活力和比活力的概念 巩固比色法测定物质含量的基础，掌握721型分光光度计的原理和使用方 法，学习绘制标准曲线的方法。
二、实验原理
酶活力概念：指专一性催化某种底物反应的能力，酶活力通常用一定条件下酶催化某种 反应的反应速度来表示。 枯草杆菌蛋白酶是一种水解酶，它将酪蛋白水解成酪氨酸等物质。酪氨酸能与酚试剂反 应生成蓝色物质。 酚试剂又名Folin试剂，是磷钨酸和磷钼酸的混合物，它在碱性条件下极不稳定，可被酚 类化合物还原产生蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物，680 nm）用分光光度计可以定量的比较颜 色的深浅，从而推导出酪氨酸的量，根据生成物的含量可以计算枯草杆菌蛋白酶的活力。 枯草杆菌蛋白酶活力单位定义：在40 ℃，pH 7.5的条件下，水解酪蛋白每分钟产生1μg酪 氨酸为1U。
10
20
30
40
50
数为横
60
坐标，
A680nm
Na2CO3溶液（mL）
5
5
5
5
5
5
为纵坐
标，作
酚试剂（mL）
1
1
1
1
1
1
出标准
迅速混合，于30℃显色15min
曲线。
A680nm
2、蛋白酶活力的测定
管号
酶液 （mL）
1（样品）1
2（对照）1
酪蛋白 （mL） 2
----
三氯乙
酸（mL） 30℃水
----
三、器材仪器和主要试剂
测定蛋白酶活力实验
测定蛋白酶活力实验一、实验目的1.加深了解酶活力的概念。
2.学习掌握测定蛋白酶活力的方法。
二、实验原理酶活力指酶催化某一特定反应的能力。
其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。
酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。
本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μg 酪氨酸所需的酶量。
实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。
产物酪氨酸在碱性条件下与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物，该蓝色化合物在680nm 处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比。
因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化，可计算出蛋白酶的活力。
三、仪器和试剂仪器:恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。
原料枯草杆菌蛋白酶：称取1g 枯草杆菌蛋白酶粉，用少量0.02mol/L，pH7.5磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，震荡15分钟，使充分溶解，干纱布过滤，取滤液冰箱备用。
使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释。
试剂1. Folin-酚试剂：在2L 磨口回流瓶中加入钨酸钠(Na2WoO4. 2H2O)100g，钼酸钠(Na2WoO4. 2H2O)25g，蒸馏水700mL，85%磷酸50mL 以及浓盐酸100mL，充分混匀后，微火回流加热10小时。
再加入硫酸锂150g，蒸馏水50mL 和液溴数滴，摇匀后开口继续煮沸15min，以驱赶过剩的溴。
冷却后加蒸馏水定容至1000mL，过滤，溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。
使用前用标准NaOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度(约为2mol/L)，然后加水稀释至1mol/L，即可使用。
2. 0.2mol/L 盐酸溶液3. 0.04mol/L 氢氧化钠溶液4. 0.55mol/L 碳酸钠溶液5. 10%三氯乙酸溶液6. 0.02mol/LpH7.5磷酸缓冲液：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4 . 12H2O)7.16g，用水定容至100mL(A 液)；称取磷酸二氢钠(Na2HPO4 .12H2O)3.12g，用水定容至100mL(B 液)。
实验二十一(10) 蛋白酶活力的测定
实验目的
掌握测定蛋白酶活力的原理和方法
学习酶活力的计算方法
蛋白酶概述
内肽酶 外肽酶 二肽酶
氨肽酶 羧肽酶
蛋 白 酶
中性蛋白酶
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）发酵产生
焙烤行业； 啤酒工业； 医药工业； 纺织工业； 皮革工业； 饲料工业；
2. 酶液的制备（已制备）
3. 活力测定 3.1 将2%酪蛋白溶液放入40℃恒温水浴，5 min； 3.2 按照下表操作，进行酶催化反应；
0
待测酶液 0.4 M 三氯乙酸 2% 酪蛋白溶液 0.4 M 三氯乙酸 1 mL 2 mL 1 mL ——
1
1 mL —— —— 1 mL 2 mL
2
1 mL —— —— 1 mL 2 mL
40℃恒温水浴锅保温，20 min 测定680 nm处吸光值 酶活力单位定义： 40℃，最适pH条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的 酶量为1U。 计算公式
4 酶活力= 10 ×K× n×A680
思考题
该方法测定蛋白酶活力的误差来源主要有哪些
5. 1.398中性蛋白酶 (neutral protease) 6. 2% 酪蛋白溶液（casein solution） 7. 标准酪氨酸溶液（100 μg mL-1）
仪器
分光光度计
试管
烧杯 移液管
恒温水浴锅
离心机 漏斗
实验步骤
1. 标准曲线 （已完成） 参考标曲，求出K值,K=94. n=20 000
1.398中性蛋白酶
分子量约43kD
最适pH 7. 2- 7. 4,
05-02-004教学课件-蛋白酶活力测定(精)
质生成胨、月示、多肽、氨基酸的一类酶的总称。
存在：动物内脏、 植物茎叶、果实
微生物细胞
不同种类的生物，分泌蛋白酶的种类和性质不同， 因此，利用外源蛋白质类物质的能力也不同。
人体内外源蛋白质的消化过程 食物中的大分子蛋白质经胃蛋白酶分解成 较小 分子的多肽经十二指肠分泌胰蛋白酶、糜蛋白酶、
羧肽酶和氨肽酶等分解成短链的肽和部分游离氨
基酸。 短链的肽经羧肽酶和氨肽酶分解成游离氨基酸。
外源蛋白质经上述消化器官内各种酶的协同作用， 最后全部转变为游离氨基酸。
蛋白酶分类：按来源分类 （1）动物蛋白酶: 如胰蛋白酶、胃蛋白酶、凝乳酶
（2）植物蛋白酶：
木瓜蛋白酶：最适 pH5-7，作用pH范围3-9；最适温度 65℃，作用温度范围30-70℃，生成产物：氨基酸。 菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶 （3）微生物蛋白酶： 霉菌蛋白酶、细菌蛋白酶
蛋白酶分类：按蛋白酶作用位点分 （1）内肽酶(endopeptidase)：从蛋白质或多肽内部水解
肽键产生各种短肽的酶。
（2）外(端)肽酶(exopeptidase)：从蛋白质或多肽一端水 解肽键，每次水解放出一个氨基酸。又分为氨肽酶、羧
肽酶。
（3）二肽酶：水解二肽中的肽键，生成单个氨基酸的酶。
蛋白酶活力测定方法：紫外分光光度法
子情境：酶制剂发酵产品检验- 蛋白酶活力测定
蛋白质：由20多种天然氨基酸通过肽键（―CO―NH―）
连接成为多肽，再由多肽聚合成生物大分子的物质。
外源蛋白质—胞外蛋白酶 内源蛋白质—溶酶体中的蛋白酶 蛋白酶：催化蛋白质类化合物中肽键水解，分解蛋白 质生成胨、腙、多肽、氨基酸的一类酶的总称。
蛋白酶：催化蛋白质类化合物中肽键水解，分解蛋白
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2020年测定蛋白酶活力实验
（课件）
测定蛋白酶活力实验
一、实验目的ﻫ１.加深了解酶活力的概念.ﻫ2。
学习掌握测定蛋白酶活力的方法。
二、实验原理ﻫ酶活力指酶催化某一特定反应的能力。
其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。
酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。
本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μｇ酪氨酸所需的酶量。
实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。
产物酪氨酸在碱性条件下与Fｏlin-酚试剂反应生成蓝色化合物,该蓝色化合物在680nm 处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比.
因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化，可计算出蛋白酶的活力.
三、仪器和试剂ﻫ仪器：ﻫ恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。
ﻫ原料ﻫ枯草杆菌蛋白酶：称取1g 枯草杆菌蛋白酶粉，用少量0.0２ｍoｌ/L，pH7.5磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，震荡1５分
钟，使充分溶解，干纱布过滤,取滤液冰箱备用。
使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释.ﻫ试剂ﻫ1. Folin－酚试剂：ﻫ在2L 磨口回流瓶中加入钨酸钠（Ｎａ2WoＯ4 . 2H2O）1０0g，钼酸钠（Na２WｏＯ４. 2H2O）25g,蒸馏水７00mL，８5％磷酸５0ｍL 以及浓盐酸100ｍL,充分混匀后,微火回流加热1０小时。
再加入硫酸锂15０g,蒸馏水5０mL 和液溴数滴，摇匀后开口继续煮沸15min，以驱赶过剩的溴。
冷却后加蒸馏水定容至1000mL，过滤,溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。
使用前用标准NａOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度（约为2moｌ/L),然后加水稀释至1mｏｌ／Ｌ，即可使用.ﻫ２.0.2mol/L 盐酸溶液3．0.04moｌ/L 氢氧化钠溶液ﻫ4．0。
5５mol/L 碳
10%三氯乙酸溶液酸钠溶液ﻫ5
.
6. ０．0２mol／LpＨ7。
5磷酸缓冲液：称取磷酸氢二钠(Na2ＨPO4 ． 12H2O)7。
１6g，用水定容至100mL(A 液);称取磷酸二氢钠（Na2HPＯ4 .１2H2Ｏ）3.1２ｇ,用水定容至１0０mL(B 液)。
取 A 液84mL，Ｂ液１6mL 混合后，得到0．2mol/LpH
7.５磷酸缓冲液，可长期
7。
标准酪氨酸溶液存放。
临用时稀释10倍即可。
ﻫ
（50μg/mL）：称取１２．5ｍg 以烘干至恒重的酪氨酸，用0.2ｍoｌ/L 盐酸约３0mＬ溶解后，蒸馏水定容至２50mL。
8。
酪蛋白溶液(0．５％）：称取 1.２5g 酪蛋白,用0.０4moｌ/Ｌ氢氧化钠溶液（20mＬ）溶解,再用0．０2mol/ＬpH7．5磷酸缓冲液定容到2５0mＬ。
ﻫ四、操作步骤（一)酪氨酸标准曲线的制作ﻫ取6支试管(标号0，1～5）,按顺序分别加入０.０0，0。
２0，0.40，0。
60，0。
80和1．0０mL 标准酪氨酸溶液,再用水补足到1．00mL，摇匀后各加入0.55mｏl/Ｌ碳酸钠５。
0mL，摇匀。
依次加入Fo ｌin—酚试剂 1.0０mＬ，摇匀并计时,于30℃水浴锅中保温1５min.然后68０nm 处测定吸光值（以0号管作对照).以酪氨酸含量（μｇ)作横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
ﻫ（二）酶活力测定ﻫ1。
酶反应：取一支试管,加入2.0ｍL0.5%的酪蛋白溶液,于３0℃水浴中预热5分钟,再加入1。
０mL已预热好的枯草杆菌蛋白酶液,立即计时,水浴中准确保温１0min,从水浴中取出后,立即加入２。
０ｍL 的10%三氯醋酸溶液，摇匀静置数分钟,干滤纸过滤，收集滤液（样品液）.另取一试管,先加入1．0ｍL 已预热好的枯草杆菌蛋白酶液和2.0mＬ的１0%三氯醋酸溶液，摇匀，放置数分钟,再加入２.0mL0。
５%的酪蛋白溶液，然后于3０℃水浴保温1０ｍｉn，同样干滤纸过滤,收集滤液（对照液）。
ﻫ以上两过程,应各做一次平行实验.ﻫ２.滤液中酪氨酸含量的测定取3支试管,分别加入１.0mL 水、A 液、B 液,然后各加入
5。
0 mL 0.5５mol／L 碳酸钠溶液和１．0０mLＦolｉn－酚试剂,摇匀按标准曲线制作方法保温并测吸光度值。
根据吸光度值,由标准曲线查出A、B 液中酪氨酸含量差值，即可推算出酶的活力单位。
A 样
五、计算ﻫ品—样品液的吸光度值ﻫＡ对照—对照液的吸光度值ﻫK—标准曲线上A=1时对应的酪氨酸μg数V—酶促反应液的体积（本实验为５mL）ﻫT—酶促反应时间（本实验为10mｉｎ）N—酶溶液稀释倍数
...... 感谢聆听 ......。