2020年测定蛋白酶活力实验(课件)

2020年测定蛋白酶活力实验

（课件）

测定蛋白酶活力实验

一、实验目的ﻫ１.加深了解酶活力的概念.ﻫ2。学习掌握测定蛋白酶活力的方法。

二、实验原理ﻫ酶活力指酶催化某一特定反应的能力。其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。

酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μｇ酪氨酸所需的酶量。实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。产物酪氨酸在碱性条件下与Fｏlin-酚试剂反应生成蓝色化合物,该蓝色化合物在680nm 处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比.

因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化，可计算出蛋白酶的活力.

三、仪器和试剂ﻫ仪器：ﻫ恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。ﻫ原料ﻫ枯草杆菌蛋白酶：称取1g 枯草杆菌蛋白酶粉，用少量0.0２ｍoｌ/L，pH7.5磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，震荡1５分

钟，使充分溶解，干纱布过滤,取滤液冰箱备用。使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释.ﻫ试剂ﻫ1. Folin－酚试剂：ﻫ在2L 磨口回流瓶中加入钨酸钠（Ｎａ2WoＯ4 . 2H2O）1０0g，钼酸钠（Na２WｏＯ４. 2H2O）25g,蒸馏水７00mL，８5％磷酸５0ｍL 以及浓盐酸100ｍL,充分混匀后,微火回流加热1０小时。再加入硫酸锂15０g,蒸馏水5０mL 和液溴数滴，摇匀后开口继续煮沸15min，以驱赶过剩的溴。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，过滤,溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。使用前用标准NａOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度（约为2moｌ/L),然后加水稀释至1mｏｌ／Ｌ，即可使用.ﻫ２.0.2mol/L 盐酸溶液3．0.04moｌ/L 氢氧化钠溶液ﻫ4．0。5５mol/L 碳

10%三氯乙酸溶液酸钠溶液ﻫ5

.

6. ０．0２mol／LpＨ7。5磷酸缓冲液：称取磷酸氢二钠(Na2ＨPO4 ． 12H2O)7。１6g，用水定容至100mL(A 液);称取磷酸二氢钠（Na2HPＯ4 .１2H2Ｏ）3.1２ｇ,用水定容至１0０mL(B 液)。取 A 液84mL，Ｂ液１6mL 混合后，得到0．2mol/LpH

7.５磷酸缓冲液，可长期

7。标准酪氨酸溶液存放。临用时稀释10倍即可。ﻫ

（50μg/mL）：称取１２．5ｍg 以烘干至恒重的酪氨酸，用0.2ｍoｌ/L 盐酸约３0mＬ溶解后，蒸馏水定容至２50mL。

8。酪蛋白溶液(0．５％）：称取 1.２5g 酪蛋白,用0.０4moｌ/Ｌ氢氧化钠溶液（20mＬ）溶解,再用0．０2mol/ＬpH7．5磷酸缓冲液定容到2５0mＬ。ﻫ四、操作步骤（一)酪氨酸标准曲线的制作ﻫ取6支试管(标号0，1～5）,按顺序分别加入０.０0，0。２0，0.40，0。60，0。80和1．0０mL 标准酪氨酸溶液,再用水补足到1．00mL，摇匀后各加入0.55mｏl/Ｌ碳酸钠５。0mL，摇匀。依次加入Fo ｌin—酚试剂 1.0０mＬ，摇匀并计时,于30℃水浴锅中保温1５min.然后68０nm 处测定吸光值（以0号管作对照).以酪氨酸含量（μｇ)作横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。ﻫ（二）酶活力测定ﻫ1。酶反应：取一支试管,加入2.0ｍL0.5%的酪蛋白溶液,于３0℃水浴中预热5分钟,再加入1。０mL已预热好的枯草杆菌蛋白酶液,立即计时,水浴中准确保温１0min,从水浴中取出后,立即加入２。０ｍL 的10%三氯醋酸溶液，摇匀静置数分钟,干滤纸过滤，收集滤液（样品液）.另取一试管,先加入1．0ｍL 已预热好的枯草杆菌蛋白酶液和2.0mＬ的１0%三氯醋酸溶液，摇匀，放置数分钟,再加入２.0mL0。５%的酪蛋白溶液，然后于3０℃水浴保温1０ｍｉn，同样干滤纸过滤,收集滤液（对照液）。ﻫ以上两过程,应各做一次平行实验.ﻫ２.滤液中酪氨酸含量的测定取3支试管,分别加入１.0mL 水、A 液、B 液,然后各加入

5。0 mL 0.5５mol／L 碳酸钠溶液和１．0０mLＦolｉn－酚试剂,摇匀按标准曲线制作方法保温并测吸光度值。根据吸光度值,由标准曲线查出A、B 液中酪氨酸含量差值，即可推算出酶的活力单位。

A 样

五、计算ﻫ品—样品液的吸光度值ﻫＡ对照—对照液的吸光度值ﻫK—标准曲线上A=1时对应的酪氨酸μg数V—酶促反应液的体积（本实验为５mL）ﻫT—酶促反应时间（本实验为10mｉｎ）N—酶溶液稀释倍数

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