微透析液相色谱化学发光联用微透析技术应用于中药药动学研究张群林
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碱(Lophine, 2,4,5-三苯基咪唑)被H2O2等氧化发出绿 光 • 十九世纪末期，德国科学家Wiedemann[3]首次解释了化 学发光的机制
化学发光现象是一种相对简单的有机反应过程
[1] B. T. P. Whitehead, L. J. Kricka, et.al. Clin. Chem. 25 (1979) 1531. [2] B. Radziszewski, Chem. Ber. 10 (1877) 70. [3] E. Wiedemann, Ann. Phys. Chem. 34 (1888) 446.
草豆蔻中豆蔻明含量的测定
线性范围: 1.0 × 10-8 - 8.0 × 10-6 g/mL
OCH3 HO
检测限: 1.2 × 10-9 g/mL
OH O
Cardarmonin
R.S.D.: 1.15% (n = 11) at 8.0 × 10-7 g/mL
首次报道化
学发光法测定 豆蔻明
Phytochemical Analysis, 2005, 16(1-2): 440-445.
• 1945年出现了光电倍增管，1950年出现了商品化的化学发 光检测装置
• 到了八十年代，随着生命科学、环境科学和材料科学的兴 起，化学发光才被真正应用于分析化学并迅速得到了发展
目前，化学发光分析的研究和应用已成为当前 微量和痕量分析领域一个十分重要的研究方法
化学发光(CL)的优点
1.灵敏度极高
化学发光(CL)的发展历史
• 1901年，法国生物学家Dubois[4]引入了荧光素(Luciferin) 和荧光素酶(Luciferase) 的概念
• 1902年，Schmitz合成发光试剂鲁米诺(Luminol),它曾被 广泛用于血迹鉴定；1928年,Albrecht 观察到鲁米诺在碱 性介质中的化学发光行为[5]
❖ 生物样品中痕量黄酮的高通量、高灵敏分析技术是研究药动 学的基本前提
❖ 中药药动学研究所面临的生物样本具有药物含量低（样品中 的中药成分浓度常在ng / mL水平或以下）、药物浓度变化范 围大（需要测定的血药浓度范围为峰浓度 Cmax ―1/20 Cmax ）、干扰组分多且不确定、样品不易重复获得等特点
微透析液相色谱化学 发光联用微透析技术 应用于中药药动学研
究张群林
个人简历
• 1992.9-1996.6 • 1996.7-2000.8 • 2000.9-2005.6
• 2005.7 • 2005.7－现在 • 2006.8 • 2009.7
沈阳药科大学中药系 安徽省药物研究所中药新药研发 中国科学技术大学获分析化学博士学位
中药沙棘制剂中的三种黄酮含量的测定
沙棘(Hippophae rhamnoides L.) 是胡颓子科沙棘属的植物，主要 种植于中国的北方和西南地区。 它是一种传统的中草药，很早以 前就被人们用于止咳、助消化、 促进血液循环和止痛。沙棘油还 可以治疗皮肤病和血栓。
30
Relative CL Intensity (a.u.)
b Blank+KA+IS
a Blank
25
结果
• 线性关系和检测限
线性范围：2.0 × 10-9－2.0 × 10-6g ·ml-1 线性方程：y = 0.8626 x + 5.553 (r = 0.9991, n = 7) 检测限 ：1.0 × 10-9 g ·mL-1。
结果
• 精密度、准确度与提取回收率
检测限:
HO O
OH
HO
HO
HO
O
8.4 × 10-10 g/mL
OH
R.S.D.:
Puerarin
O
1.86% (n = 11) at 5.0 × 10-8 g/mL
首次报道化学发 光法测定葛根素
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2004, 36(3): 587–592
Chemiluminescence, Instruments and Applications. Vol 1. FL: CRC Press, 1985. [6] K. Gleu, Z. Petsch. Angew. Chem. 48 (1935) 57.
化学发光(CL)的发展历史
• 由于大多数化学发光非常微弱，且稍纵即逝，早期的化学 发光研究主要集中在对化学发光反应现象的观察和反应机 理的探讨上，其发展一直比较缓慢。
F* → F + hυ
化学发光(CL)的定量原理
定量原理：
在化学发光分析中，被分析物相 对于发光试剂小得多，对于一级 动力学反应：dc/dt =Kc
定量依据： （1）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性 （2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与
被测物浓度成线性
A0 tIcltdtcl0 td d c tdtclc
Absorbance (a.u.)
1.0
a
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0 0
3000
2500
5
b
2000
1500
1000
500
0
5
QU IS
KA
10
15
20
25
Time (min)
KA
IS QU
10
15
20
25
Time (min)
QU, IS: 4.5 × 10-7 g mL-1 KA: 2.0 × 10-7 g mL-1
化学发光(CL)的常见反应体系
鲁米诺及其衍生物发光体系 吖啶类发光体系 四价铈发光体系 其它发光体系
前期工作基础
液相色谱—化学发光（HPLC-CL）联用技术 分析中药黄酮成分
复杂体系中低含量物质的检测——分析化学挑战之一 高选择性和高灵敏度的分析技术 化学发光是高灵敏分析技术，灵敏度可与质谱媲美 分布广泛、疗效确切的黄酮，易于发生氧化还原反应
方法学考察
1 专属性 2 线性关系和检测限 3 精密度、准确度与提取回收率 4 稳定性
• 专属性
Relative CL Intensity (a.u.)
500
2
450
400
350 1
300
3
250
200
150
100
50
0
0
5
结果
KA IS
10
15
20
Retention Time (min)
c Sample
日内和日间RSD均小于5.0%，回收率大于80.0%
800
400
5
10
15
20
25
30
0
Time (min)
KA
b
IS
QU
5
10
15
20
25
30
Time (min)
图3 心达康胶囊(a)和沙棘颗粒(b)样品中 三种黄酮醇的CL检测色谱图
Journal of Separation Science, 2005, 28(11): 1117-1256.
首次报道能同时响应化合物 种类最多的CL检测器
HPLC-1C100 L条件的 1050
1500
a
1400
b
优化 1000
1300
Relative CL Intensity (a.u.)
Relative CL Intensity (a.u.)
950
1200
900
1100
850
1000
1.色谱分800 离条件 2.发光反应兼容性
750
分离度70、0 峰形、
图4 二十种黄酮和酚类化合物的化学发光检测色谱图
Journal of Chromatography A 2005, 1095, 94-101.
HPLC-CL联用技术应用于黄酮药动学研究
❖ 黄酮具有抗氧化、抗癌、抑制脂肪酶等显著药理作用，受到 国内外医药界的广泛重视，但其药动学研究资料的缺乏，制 约了黄酮类新药的研发与体内作用机制研究
HPLC Column
Computer Interface
Peristaltic Pump
1.5 mL·min-1 Rho 6G
DAD
Mixing Tee
Cerium (IV) 1.5 mL ·min-1
PMT
Cell
Waste
血浆样品的预处理方法
取血浆样品100 μL，精密加入内标溶液（0.2 mg ·mL-1 异鼠李素）5.0 μL，20%的磷酸溶液10 μL酸化，加甲醇200 μL，涡旋混合1.0 min，离心 （10000 r ·min-1）10 min后，取上清液10 μL进样。
化学发光(Chemiluminescence)技术
发光新体系
规律和机理
液相色谱-化学 发光联用技术
（复方）制剂
指纹图谱
Chemiluminescence
Producing light with chemicals
葛根素注射液中葛根素含量的测定
线性范围:
1.3 × 10-9 - 8.0 × 10-7 g/mL
保留时间0
2
流动相不增加背景、 4 不熄6 灭发光8 信号10；
Concentration of R不ho生dam成ine沉6G淀( mol/l)
1540
1520
c
900
3.
流路的优化
800
发光试剂
700
混合次序 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4
4.发光反应条件
发光反应试剂的 0.5 浓0.6 度0、.7 试0.8剂流0.9 速等
二. 反应历程必须有利于形成激发态产物； 三. 这种激发态物质必须具有一定的发光量子效率，或者
能够将其能量转移给共存的某种荧光物质，产生光 辐射。
化学发光(CL)的基本类型
直接化学发光
A + B → C* + D C* → C + hυ
间接化学发光
A + B →C* + D C* + F → C + F*
• 1935年,Gleu和Petsch[6]报道了光泽精(Lucigenin)与H2O2反 应产生化学发光
这些发光试剂的合成，对于化学发光发展为分 析化学的一种重要手段起到了非常重要的作用
[4] R. Dubois, Acad. Sci. 132 (1901) 431. [5] K. van Dyke, F. McCapra, I. Behesti, Bioluminescnece and
5.易于自动化
适合与HPLC和HPCE等其它的分离技术联用，作 为其高灵敏度的检测器
化学发光(CL)的基本原理
化学反应释放出的化学能激发产物分子或体系共存的其它 分子，这些分子由激发态回到基态时产生光辐射的现象。
化学发光(CL)的必须条件
一. 化学反应必须释放出足够的能量可以使某种反应产物 或中间体到达激发态；
Concentration of Cerium(IV) (mmol/l)
1600
1400
d
1200
Relative CL Intensity (a.u.)
Relative CL Intensity (a.u.)
1500
1480
1460
1440
0.3
0ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ4
0.5
0.6
0.7
Concentration of Sulfuric Acid (mol/l)
1000 800 600 400 200 0.5
HPLC-CL条件的 优化
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
Flow Rate (ml/min)
HPLC-CL实验装置示意图
HPLC Pump
0.4 % aqueous phosphoric acid
Injection Valve
Methanol
30 图2 槲皮素、山萘酚和 异鼠李素标准化合物的 DAD(a) 和CL(b)检测色 谱图
30
Relative CL Intensity (a.u.) Relative CL Intensity (a.u.)
2000 1600 1200
800 400
0
QU
a
2400
KA IS
2000 1600
1200
液相色谱–化学发光法测定大鼠血浆中 山奈酚浓度及其药动学研究
研究背景
• 山奈酚的性质
HO 4' 3'
5' 6'
1'
1
2O
2'
HO 3 4
O
• 药理作用广泛，药动资料缺乏
8 7 OH
6 5 OH
仅有两篇报道：
家兔灌胃，HPLC-DAD，前处理复杂 大鼠静注，HPLC-UV，未报道药动学参数
实验方法
荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析，可 测定210-17 mol/L的ATP，即可检测出一个细菌中 的ATP含量
2.线性范围宽 至少二个数量级以上
3.仪器设备简单 不需要光源、单色器和背景校正
4.分析速度快
多数化学发光反应是快速反应，在瞬间或几秒即 可完成, 100 samples h-1
（导师：崔华教授） “安徽医科大学引进人才” 药学院药物分析教研室 任副教授、硕士生导师、中青年学术带头人 任教研室主任
化学发光(Chemiluminescence, CL)
• 化学发光[1]作为一种自然现象很早就为人类所注意 • 1877年，Radziszewski[2] 证实在乙醇－KOH溶液中洛粉
化学发光现象是一种相对简单的有机反应过程
[1] B. T. P. Whitehead, L. J. Kricka, et.al. Clin. Chem. 25 (1979) 1531. [2] B. Radziszewski, Chem. Ber. 10 (1877) 70. [3] E. Wiedemann, Ann. Phys. Chem. 34 (1888) 446.
草豆蔻中豆蔻明含量的测定
线性范围: 1.0 × 10-8 - 8.0 × 10-6 g/mL
OCH3 HO
检测限: 1.2 × 10-9 g/mL
OH O
Cardarmonin
R.S.D.: 1.15% (n = 11) at 8.0 × 10-7 g/mL
首次报道化
学发光法测定 豆蔻明
Phytochemical Analysis, 2005, 16(1-2): 440-445.
• 1945年出现了光电倍增管，1950年出现了商品化的化学发 光检测装置
• 到了八十年代，随着生命科学、环境科学和材料科学的兴 起，化学发光才被真正应用于分析化学并迅速得到了发展
目前，化学发光分析的研究和应用已成为当前 微量和痕量分析领域一个十分重要的研究方法
化学发光(CL)的优点
1.灵敏度极高
化学发光(CL)的发展历史
• 1901年，法国生物学家Dubois[4]引入了荧光素(Luciferin) 和荧光素酶(Luciferase) 的概念
• 1902年，Schmitz合成发光试剂鲁米诺(Luminol),它曾被 广泛用于血迹鉴定；1928年,Albrecht 观察到鲁米诺在碱 性介质中的化学发光行为[5]
❖ 生物样品中痕量黄酮的高通量、高灵敏分析技术是研究药动 学的基本前提
❖ 中药药动学研究所面临的生物样本具有药物含量低（样品中 的中药成分浓度常在ng / mL水平或以下）、药物浓度变化范 围大（需要测定的血药浓度范围为峰浓度 Cmax ―1/20 Cmax ）、干扰组分多且不确定、样品不易重复获得等特点
微透析液相色谱化学 发光联用微透析技术 应用于中药药动学研
究张群林
个人简历
• 1992.9-1996.6 • 1996.7-2000.8 • 2000.9-2005.6
• 2005.7 • 2005.7－现在 • 2006.8 • 2009.7
沈阳药科大学中药系 安徽省药物研究所中药新药研发 中国科学技术大学获分析化学博士学位
中药沙棘制剂中的三种黄酮含量的测定
沙棘(Hippophae rhamnoides L.) 是胡颓子科沙棘属的植物，主要 种植于中国的北方和西南地区。 它是一种传统的中草药，很早以 前就被人们用于止咳、助消化、 促进血液循环和止痛。沙棘油还 可以治疗皮肤病和血栓。
30
Relative CL Intensity (a.u.)
b Blank+KA+IS
a Blank
25
结果
• 线性关系和检测限
线性范围：2.0 × 10-9－2.0 × 10-6g ·ml-1 线性方程：y = 0.8626 x + 5.553 (r = 0.9991, n = 7) 检测限 ：1.0 × 10-9 g ·mL-1。
结果
• 精密度、准确度与提取回收率
检测限:
HO O
OH
HO
HO
HO
O
8.4 × 10-10 g/mL
OH
R.S.D.:
Puerarin
O
1.86% (n = 11) at 5.0 × 10-8 g/mL
首次报道化学发 光法测定葛根素
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2004, 36(3): 587–592
Chemiluminescence, Instruments and Applications. Vol 1. FL: CRC Press, 1985. [6] K. Gleu, Z. Petsch. Angew. Chem. 48 (1935) 57.
化学发光(CL)的发展历史
• 由于大多数化学发光非常微弱，且稍纵即逝，早期的化学 发光研究主要集中在对化学发光反应现象的观察和反应机 理的探讨上，其发展一直比较缓慢。
F* → F + hυ
化学发光(CL)的定量原理
定量原理：
在化学发光分析中，被分析物相 对于发光试剂小得多，对于一级 动力学反应：dc/dt =Kc
定量依据： （1）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性 （2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与
被测物浓度成线性
A0 tIcltdtcl0 td d c tdtclc
Absorbance (a.u.)
1.0
a
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0 0
3000
2500
5
b
2000
1500
1000
500
0
5
QU IS
KA
10
15
20
25
Time (min)
KA
IS QU
10
15
20
25
Time (min)
QU, IS: 4.5 × 10-7 g mL-1 KA: 2.0 × 10-7 g mL-1
化学发光(CL)的常见反应体系
鲁米诺及其衍生物发光体系 吖啶类发光体系 四价铈发光体系 其它发光体系
前期工作基础
液相色谱—化学发光（HPLC-CL）联用技术 分析中药黄酮成分
复杂体系中低含量物质的检测——分析化学挑战之一 高选择性和高灵敏度的分析技术 化学发光是高灵敏分析技术，灵敏度可与质谱媲美 分布广泛、疗效确切的黄酮，易于发生氧化还原反应
方法学考察
1 专属性 2 线性关系和检测限 3 精密度、准确度与提取回收率 4 稳定性
• 专属性
Relative CL Intensity (a.u.)
500
2
450
400
350 1
300
3
250
200
150
100
50
0
0
5
结果
KA IS
10
15
20
Retention Time (min)
c Sample
日内和日间RSD均小于5.0%，回收率大于80.0%
800
400
5
10
15
20
25
30
0
Time (min)
KA
b
IS
QU
5
10
15
20
25
30
Time (min)
图3 心达康胶囊(a)和沙棘颗粒(b)样品中 三种黄酮醇的CL检测色谱图
Journal of Separation Science, 2005, 28(11): 1117-1256.
首次报道能同时响应化合物 种类最多的CL检测器
HPLC-1C100 L条件的 1050
1500
a
1400
b
优化 1000
1300
Relative CL Intensity (a.u.)
Relative CL Intensity (a.u.)
950
1200
900
1100
850
1000
1.色谱分800 离条件 2.发光反应兼容性
750
分离度70、0 峰形、
图4 二十种黄酮和酚类化合物的化学发光检测色谱图
Journal of Chromatography A 2005, 1095, 94-101.
HPLC-CL联用技术应用于黄酮药动学研究
❖ 黄酮具有抗氧化、抗癌、抑制脂肪酶等显著药理作用，受到 国内外医药界的广泛重视，但其药动学研究资料的缺乏，制 约了黄酮类新药的研发与体内作用机制研究
HPLC Column
Computer Interface
Peristaltic Pump
1.5 mL·min-1 Rho 6G
DAD
Mixing Tee
Cerium (IV) 1.5 mL ·min-1
PMT
Cell
Waste
血浆样品的预处理方法
取血浆样品100 μL，精密加入内标溶液（0.2 mg ·mL-1 异鼠李素）5.0 μL，20%的磷酸溶液10 μL酸化，加甲醇200 μL，涡旋混合1.0 min，离心 （10000 r ·min-1）10 min后，取上清液10 μL进样。
化学发光(Chemiluminescence)技术
发光新体系
规律和机理
液相色谱-化学 发光联用技术
（复方）制剂
指纹图谱
Chemiluminescence
Producing light with chemicals
葛根素注射液中葛根素含量的测定
线性范围:
1.3 × 10-9 - 8.0 × 10-7 g/mL
保留时间0
2
流动相不增加背景、 4 不熄6 灭发光8 信号10；
Concentration of R不ho生dam成ine沉6G淀( mol/l)
1540
1520
c
900
3.
流路的优化
800
发光试剂
700
混合次序 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4
4.发光反应条件
发光反应试剂的 0.5 浓0.6 度0、.7 试0.8剂流0.9 速等
二. 反应历程必须有利于形成激发态产物； 三. 这种激发态物质必须具有一定的发光量子效率，或者
能够将其能量转移给共存的某种荧光物质，产生光 辐射。
化学发光(CL)的基本类型
直接化学发光
A + B → C* + D C* → C + hυ
间接化学发光
A + B →C* + D C* + F → C + F*
• 1935年,Gleu和Petsch[6]报道了光泽精(Lucigenin)与H2O2反 应产生化学发光
这些发光试剂的合成，对于化学发光发展为分 析化学的一种重要手段起到了非常重要的作用
[4] R. Dubois, Acad. Sci. 132 (1901) 431. [5] K. van Dyke, F. McCapra, I. Behesti, Bioluminescnece and
5.易于自动化
适合与HPLC和HPCE等其它的分离技术联用，作 为其高灵敏度的检测器
化学发光(CL)的基本原理
化学反应释放出的化学能激发产物分子或体系共存的其它 分子，这些分子由激发态回到基态时产生光辐射的现象。
化学发光(CL)的必须条件
一. 化学反应必须释放出足够的能量可以使某种反应产物 或中间体到达激发态；
Concentration of Cerium(IV) (mmol/l)
1600
1400
d
1200
Relative CL Intensity (a.u.)
Relative CL Intensity (a.u.)
1500
1480
1460
1440
0.3
0ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ4
0.5
0.6
0.7
Concentration of Sulfuric Acid (mol/l)
1000 800 600 400 200 0.5
HPLC-CL条件的 优化
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
Flow Rate (ml/min)
HPLC-CL实验装置示意图
HPLC Pump
0.4 % aqueous phosphoric acid
Injection Valve
Methanol
30 图2 槲皮素、山萘酚和 异鼠李素标准化合物的 DAD(a) 和CL(b)检测色 谱图
30
Relative CL Intensity (a.u.) Relative CL Intensity (a.u.)
2000 1600 1200
800 400
0
QU
a
2400
KA IS
2000 1600
1200
液相色谱–化学发光法测定大鼠血浆中 山奈酚浓度及其药动学研究
研究背景
• 山奈酚的性质
HO 4' 3'
5' 6'
1'
1
2O
2'
HO 3 4
O
• 药理作用广泛，药动资料缺乏
8 7 OH
6 5 OH
仅有两篇报道：
家兔灌胃，HPLC-DAD，前处理复杂 大鼠静注，HPLC-UV，未报道药动学参数
实验方法
荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析，可 测定210-17 mol/L的ATP，即可检测出一个细菌中 的ATP含量
2.线性范围宽 至少二个数量级以上
3.仪器设备简单 不需要光源、单色器和背景校正
4.分析速度快
多数化学发光反应是快速反应，在瞬间或几秒即 可完成, 100 samples h-1
（导师：崔华教授） “安徽医科大学引进人才” 药学院药物分析教研室 任副教授、硕士生导师、中青年学术带头人 任教研室主任
化学发光(Chemiluminescence, CL)
• 化学发光[1]作为一种自然现象很早就为人类所注意 • 1877年，Radziszewski[2] 证实在乙醇－KOH溶液中洛粉