GenePharma 慢病毒载体 140512
一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用[发明专利]
![一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/515c51e629ea81c758f5f61fb7360b4c2f3f2a5d.png)
(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202111535765.1(22)申请日 2021.12.15(71)申请人 徐州市中心医院地址 221000 江苏省徐州市解放路199号(72)发明人 孟箭 周霖 李欣然 顾徐嘉 陈霖 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限公司 32200专利代理师 曹翠珍(51)Int.Cl.C12N 15/113(2010.01)C12N 15/867(2006.01)A61K 31/713(2006.01)A61P 1/02(2006.01)A61P 25/00(2006.01)(54)发明名称一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用(57)摘要本发明公开了一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用，通过RNA干扰靶点设计及双链DNA oligo制备，将双链DNA oligo与线性化的载体相连，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞进行阳性克隆，构建短发夹RNA慢病毒载体，敲低TSCC内源性PXYLP1基因的表达，抑制了TSCC细胞的增殖能力，诱导了TSCC细胞的凋亡，从而抑制体内肿瘤生长。
权利要求书1页 说明书10页序列表1页 附图9页CN 114457075 A 2022.05.10C N 114457075A1.一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA，其特征在于，所述shRNA包括DNA oligo的正链和反链，所述正链为序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列，所述反链为序列表SEQ ID NO.2所示的碱基序列，所述的正链和反链退火，形成带粘性末端的双链DNA：SEQ 1：5’‑CCGGCCCGGTAAGAAACCAGTATCTCTCGAGAGATACTGGTTTCTTACCGGGTTTTTG ‑3’SEQ 2：5’‑AATTCAAAAACCCGGTAAGAAACCAGTATCTCTCGAGAGATACTGGTTTCTTACCGGG ‑3’。
GenePharma 表达载体使用说明书
GenePharma 表达载体使用说明质粒及菌液说明1、GenePharma 所提供的过表达质粒为高纯度的DNA 粉末制品，经过真空冷冻干燥的质粒是呈薄膜状或粉末状附在离心管中，请适当离心(10000r/min 10~15s)后小心开启，以免飞扬丢失。
请根据实验需要的质粒浓度和质粒的总量加入适量的 ddH 2O (通常建议储存液浓度 500ng~1μg/μL ），合上管盖充分震荡使其溶解后可用于细胞转染及其他分子生物学实验。
粉末制品的 DNA 可长期保存（建议最好不要超过6个月），质粒溶解后建议在-20℃的环境中存贮，避免多次冻融处理。
2、甘油菌液为含有重组质粒的菌液的过夜培养物与甘油的混合物，甘油的终浓度为 20% 。
客户收到甘油菌液建议即刻活化（例如取50~100µL 到5m L 含有相应抗性(根据载体种类可以选择25~50μg/m L 卡那霉素或 50~100μg/m L 氨苄霉素）的 LB 培养基过夜活化（12~16h ），活化后的菌液与适量甘油混匀后于-80℃保存。
）3、重组质粒测序峰值图文件结果请参见附件报告中的.abl 文件。
测序序列文件参见与峰值图文件同名的.seq 文件。
测序结果比对文件参见参见附件报告中的.sqd 文件，还可见同名的.pdf 文件。
基因过表达实验设计在使用载体法针对某一基因进行过表达研究过程中，通常会遇到如下几个问题：实验对照组的确立、细胞转染条件的确定、基因表达效率的检测。
1.实验对照组的确立在一个完善的基因过表达实验设计中，必须考虑设立正确合理的实验对照组。
通常，这些对照组包括阴性对照、转染试剂对照。
阴性对照通常是用基因过表达选择的载体对应的空载体来作为对照。
2.细胞转染条件的确定使用DNA 载体转染细胞时，为了选择合适的转染方法和确定转染效率，通常采用报告基因来检测DNA 的导入情况。
最常用的报告基因是绿色荧光蛋白。
吉玛公司提供的过表达载体有一部分载体中包含绿色荧光蛋白(红色荧光蛋白)的表达框架，转入细胞后可以表达绿色荧光蛋白(红色荧光蛋白)，是用荧光显微镜或流式细胞仪可以很容易地确定转染效率；如果您所订购的载体中不含绿色荧光蛋白(红色荧光蛋白)的表达框架，您可以先使用可以表达绿色荧光蛋白(红色荧光蛋白)的表达载体来确定转染效率和转染条件，然后使用同样的条件来转染过表达质粒。
慢病毒载体介导的RNA干扰抑制PC12细胞MyD88基因的表达
解剖科学进展 Progress of Anatomical Sciences 2010 Mar,16(2):131~134慢病毒载体介导的RNA干扰抑制PC12细胞MyD88基因的表达*崔万鹏，刘晓湘，方秀斌（中国医科大学 基础医学院神经生物学教研室， 辽宁 沈阳 110001） 【摘要】 目的 研究慢病毒介导的RNA干扰对PC12细胞的转染效率和对MyD88基因的抑制效率。
方法 构建针对大鼠MyD88基因3个靶点的ShRNA慢病毒载体，PC12细胞按照不同的转染条件分为 正常组（DMEM完全培养液）、DMEM加入polybrene组、EN.iS（Enhance infection solution）组、EN.iS加入polybrene组。
荧光显微镜下观察不同组的转染效率，采用Real-time PCR和Western blot检测不同的靶点对MyD88的不同沉默效率。
结果 病8毒滴度为1 × 10 TU/ml，MOI为100时，PC12细胞在EN.iS组的转染效率最高，转染试剂polybrene对转染效率无明显影响，沉默效率最高的靶点是5'-CATAC GCAACCAGCAGAAA-3'。
结论 慢病毒介导的RNA干扰是一种高效的基因沉默手段，可以对PC12细胞中MyD88的功能进行长期的研究。
【关键词】 PC12细胞；慢病毒；RNA干扰；髓样分化因子初次应答基因88 【中图分类号】 Q189 【文献标识码】 A 【文章编号】 1006-2947（2010）02-0131-04Lentivirus mediated RNA interference knockdowns the expression of MyD88 in PC12 cells【Abstract】 Objective To investigate the transfection efficiency of lentivirus and silencing efficiency of MyD88 by lentivirus mediated RNA interference in PC12 cell line. Methods Recombinant lentivirus vectors with shRNA targeting rat myeloid differentiation primary response gene 88(MyD88) were constructed and transfected into pheochromocytoma cells (PC12) in vitro, the tranfection efficiency was observed under fluorescence microscope and the expression of MyD88 was 8determined by Real-time PCR and Western Blot respectively. Results The viral titer of lentivirus was 1×10 TU/ml and the MOI(multiplicity of infection) was 100, PC12 cells exhibited the highest transfection efficiency in enhanced infection solution(EN.iS), with no remarkable effect on the transfection efficiency in the presence of the transfection reagent polybrene. According to the result of Real-time PCR and Western Blot, the most efficient targeting sequence was 5'-CATAC GCAACCAGCAGAAA-3'. Conclusion Lentivirus mediated RNA interference is an effective means to silence gene expression in PC12 cells，which can generate stable transfected PC12 cell line with MyD88 expression knocking down.【Key words 】 Pc12 cell line; lentivirus; RNA interference; myeloid differentiation primary response gene88*CUI Wan-peng，LIU Xiao-xiang，FANG Xiu-bin （Department of Neurobiology, China Medical University, Liaoning Shenyang 110001 China）[1]Lentivirus 是逆转录病毒的一种，可将自身携带作用。
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体构建原理
慢病毒载体是一种常用于基因转染和基因治疗研究的工具，其构建原理主要包括载体选择、基因插入、包装和转染等几个关键步骤。
下面将分别对这些步骤进行详细介绍。
首先，载体选择是慢病毒构建的第一步。
常用的慢病毒载体包括pLenti、pSico、pRetro等，这些载体通常具有较高的转染效率和稳定性。
在选择载体时，需要考虑载体的大小、复制能力、转染效率以及转染细胞类型等因素，以确保最终构建的慢病毒载体能够满足实验需求。
其次，基因插入是慢病毒构建的关键步骤之一。
一般来说，可以利用限制性内切酶切割载体，然后将待插入的基因片段与载体连接，形成重组载体。
在进行基因插入时，需要注意选择合适的限制性内切酶，控制酶切的时间和温度，以确保基因能够正确插入到载体中。
接下来是包装步骤。
包装是指将重组载体导入到包装细胞中，通过包装细胞的辅助，使其产生慢病毒颗粒。
常用的包装细胞包括293T细胞、HEK293细胞等。
在包装过程中，需要利用辅助载体，如
pMD2.G和psPAX2等，通过三质体共转染的方式，使包装细胞产生
慢病毒颗粒。
最后是转染步骤。
转染是将包装好的慢病毒颗粒导入到目标细
胞中，实现基因的转染。
在进行转染时，需要根据目标细胞的特性
选择合适的转染方法，如离体转染、体内转染等，以确保慢病毒能
够有效地转染目标细胞，并表达目标基因。
总的来说，慢病毒载体构建的原理涉及到载体选择、基因插入、包装和转染等关键步骤。
通过合理的实验设计和操作，可以构建出
稳定、高效的慢病毒载体，为基因转染和基因治疗研究提供有力的
工具支持。
小鼠miR-122重组慢病毒载体的构建和鉴定
ｃｐ Ｆ ｏＧ Ｐ感 染 的肝 前体细胞 中 ｍｉ．２ Ｒ １２表达 显著增强 。结论 【 关键词 】 ＭｉｒＲ Ａ一２ ； 体构建 ； ｃ Ｎ １２ 载 ｏ 慢病 毒
中图分 类号 ： ９ ７１ Ｑ ８． 文献标 识码 ： Ａ
成功构建 了小 鼠 ｍｉ １ ２重组慢病 Ｒ．２
毒． 并在 肝前体 细胞 中高 效表达 出 ｍ Ｒ １２ 为进行 ｍ Ｒ １２的功能 和机理奠定 了 良好 的基 础 。 ｉ 一２ ， ｉ 一２
邱 荣林 邓 小耿
【 要 】 目的 摘
机 制奠定 基础 。方 法
谢 平 李 治熹 唐 晶
构建携 带 ｍＲ １２ ｉ． 的重 组慢 病毒 表达 载体 ， ２ 为研究 ｍＲ １２的功 能和作 用 ｉ． ２ 从小 鼠基 因组 Ｄ Ａ采用 Ｐ Ｒ法 扩增 出 ｐｅｍ Ｒ １２基 因 ， Ｎ Ｃ ｒ— ｉ 一２ 测序 后克 隆至
慢病毒载体构建步骤
一、简介慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。
由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。
采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体，然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。
慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。
慢病毒作为siRNA的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。
在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶III启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶HI有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。
当RNA 聚合酶I遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。
U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶H依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达〜21ntRNA和〜50ntRNA茎环结构(stem loop)。
在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA),载体包含位于RNA聚合酶I启动子和4〜5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4个U 3 ’突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。
吉玛慢病毒使用手册(genepharma)
量法
Vg/ml
滴度
和操作要求高 倍 2
TU/ml（估计）
GFP 荧光计数 FACS（流式细胞 TU/ml
感染滴度 经典方法，简单、-
法
计数）
重复性好
抗性克隆计 细胞克隆计数 TU/ml
感染滴度 克隆形成需约 2 周 低估 5~10 倍 3
数法
Dot-blot 法 RNA dot-blot RNA/ml
Lentivirus 表达时间较长，但在一般代谢较旺盛的细胞（如 293T， BHK21 等）上，病毒感染 24hrs 后可以观察到 GFP 荧光；代谢比较缓慢 的细胞（如原代培养细胞，神经干细胞，胚胎干细胞等）GFP 蛋白表达 时间较长，感染后 72-96hrs 甚至更长时间才可以观察到 GFP 荧光。感染 后的细胞可以连续培养一周，通过观察 GFP 的表达时间和表达强度来确 定 Lentivirus 对目的细胞的感染情况。感染后期请根据细胞生长的情况对 细胞进行及时换液和传代，以保证细胞良好的生长状态。
生物安全
1、安全性 （1）删除了全部 HIV-1 的编码基因，在介导目的基因的表达时，没有任 何 HIV-1 蛋白的表达； （2）对 5’和 3’ LTR 分别进行了删除改造，5’LTR 缺失 U3，换上 RSV enhancer/promoter，使载体的复制不再依赖 Tat；3’LTR 删除 U3，使其不 再具有启动/增强活性，成为自灭活（self-inactivating, SIN）载体； （3）病毒包装必需的 3 个蛋白 Gag/Pol、Rev、VSV-G（代替 HIV-1 的 Env）分别独立放置在 3 个质粒上（pGag/Pol、pRev、pVSV-G），且互相 之间没有任何同源序列，大大降低了复制型慢病毒（RCL）的产生几率； （4）与 MuLV 等逆转录病毒载体相比，慢病毒载体的整合更偏向于宿主 细胞基因组的基因表达活跃区，激活沉默的原癌基因的几率可能比逆转 录病毒载体低； （5）慢病毒载体未发现有致肿瘤活性，全世界有 4 千万人感染了 HIV-1，
慢病毒载体的构建
慢病毒载体的构建一．构建原理：慢病毒属于逆转录病毒科, 但其基因组结构复杂, 除gag 、po l 和env 这3 个和单纯逆转录病毒相似的结构基因外, 还包括4 个辅助基因, vif 、vp r 、 nef 、vpu 和2 个调节基因tat 和rev 。
H IV 21 是慢病毒中最具特征性的病毒, 第一个慢病毒载体系统即以此病毒为基础进行构建的。
慢病毒载体的构建原理就是将H IV 21 基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列) 和编码反式作用蛋白的序列进行分离。
载体系统包括包装成分和载体成分: 包装成分由H IV 21 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建, 能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白; 载体成分与包装成分互补, 含有包装、逆转录和整合所需的H IV 21 顺式作用序列。
同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。
为降低两种成分同源重组产生有复制能力的病毒(RCV ) 的可能性, 将包装成分的5′ L TR 换成巨细胞病毒(CMV ) 立即早期启动子, 3′ L TR 换成SV 40 po lyA 位点等。
将包装成分分别构建在两个质粒上, 即一个表达gag 和po l 、另一个表达env 。
二．实验操作举例：一）磷酸钙法转染HEK293T 细胞1. 试剂配制:无菌水ddw: 高温灭菌; 分装;2XHBS: 280mM NaCl10mM KCl1.5 mM Na2HPO412 mM glucose50 mM HEPESAdjust the pH , every 0.05pH from 7.00 to 7.45 using 10N NaOH, then add ddw. to the final volume. 过滤灭菌,分装;2M CaCl2: 过滤灭菌,分装.2. 实验过程:1. 铺细胞: 选择状态良好的293T 细胞传代, 2-3x105个细胞/35mm dish.2. 20-24h 后,待细胞长至铺满瓶底约50-70%的时候,进行转染.下面就35mm dish 为例,采用以下转染体系:ddw: 105ulplasmid: 2 ug (如0.5ug/ul, 即用4ul)2M CaCl2: 16.5ul2XHBS: 125ul按上述顺序,往eppendorf管中依次加入上述四种试剂.先将前三者混匀,最后加2XHBS.一种方法是,加2XHBS时要逐滴加入,吹打至微现乳白色,立即均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h后换液.另一种方法是,加入2XHBS后立即吹打约40下(不过这个要根据每个人的力道和吹打的频率而定,建议做一个梯度实验,吹打不同的次数看哪次的转染效率高以后就按这个次数来吹打),之后步骤同上,立即均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h后换液.二）转染方法2-Fugene转染病毒包装1．传293T细胞，将T75用明胶包被，每瓶T75加1.5-2mL明胶，置于37度培养箱10min。
金拓思慢病毒产品说明书
金拓思慢病毒产品说明书一、产品简介慢病毒载体是一类重组逆转录病毒载体，由于其结构和功能的特点，慢病毒载体作为一种重要的基因转移工具应用于基因治疗和细胞分子生物学研究领域。
区别于一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型细胞，达到良好的基因治疗效果。
我公司生产的重组慢病毒均以国际通用的第三代载体四质粒体系生产，通过重组改造后将含有目的基因的慢病毒骨架及其相应的作用元件组合为新质粒，并通过辅助质粒将病毒包装的元件组成重组病毒。
通过自我灭活的方式，阻止病毒自我复制。
保证了慢病毒使用过程中的良好生物安全性。
二、重要说明2.1安全操作说明1.应在Ⅱ级及以上级别生物安全柜中使用慢病毒产品。
2.虽经过改造后病毒安全性极大提高，操作中仍需佩戴口罩、手套等安全防护措施以免产生潜在危害。
3.操作中所有接触慢病毒试剂的样品、耗材、器皿等均需通过84消毒液（1:20）浸泡后，高温121℃灭活15min以上。
4.实验过程中有病毒液洒落的情况时，应用纸巾将病毒液吸干后喷洒70乙醇，并将擦干的纸巾一并高温处理以免造成其它伤害、污染环境。
2.2使用注意事项所有慢病毒产品均通过干冰低温运输，请收到产品后立即转入-80℃冰箱保存。
每次使用时提前取出病毒液放置在4℃冰箱待融化，并保存于4℃冰箱。
每次融化后请尽快使用，病毒液应尽量避免反复冻融降低病毒滴度。
三、慢病毒制备与使用3.1实验材料细胞：人贴壁细胞293T培养基：高糖DMEM培养基血清：胎牛血清抗生素：青链霉素转染试剂：Transfection-mate增强剂：Polybrene3.2病毒制备方法3.2.1细胞准备细胞复苏：1.将液氮保存细胞取出后，迅速放入37℃水浴锅内，应及时轻柔摇动加快解冻速度。
2.将完全溶解的细胞离心，1500rpm，3min。
整理)慢病毒稳转细胞株步骤之欧阳历创编
稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年）（1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分（3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env 基因.三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。
2、包装细胞：293T细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g 溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌**也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。
是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene能提高感染效率2～10 倍。
有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml）7、无血清培养基：optimen8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞）9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤<一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转）第一天1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜2、配制5X PEG8000/NaCl溶液称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃第二天1、配管A+B混合室温静置20min2、加入2ml全培养基DMEM3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基第四天第五天：1、9:00和17:00各收取一次5ml培养液，共20ml（-80℃保存）2、过滤：用孔径为0.45mm的过滤器除去上清中的293T细胞3、加入5ml 5XPEG8000/NaCl溶液，每30min-1h上下摇匀一次4、4℃过夜第六天1、4℃，3500rpm，20min2、弃上清，倒扣纸上静置1-2min，吸干残余液体3、加入120-150μl PBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶4、50μl分装，-80℃保存。
吉凯基因慢病毒包装系统说明书
吉凯基因慢病毒包装系统由一个包装质粒混合物（Lenti-Easy Packaging Mix） 和一个慢病毒载体质粒（Lentiviral Vector）组成，包装质粒混合物中含有编码 HIV 病毒主要的结构蛋白的 gag 基因、编码病毒特异性的酶的 pol 基因，和编码 调节 gag 和 pol 基因表达的调节因子 rev 基因，以及提供病毒包装所需要的单纯 疱疹病毒来源的 VSVG 基因，慢病毒载体 Lentiviral Vector（图 3）中含有 HIV 的基本元件 5’LTR 和 3’LTR 以及其他辅助元件，例如 WRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。
5．慢病毒产品优势 1）感染效率高：与传统的质粒转染相比，慢病毒感染细胞时无需转染试剂，
且转染效率高。 （参见附录：图 1. 质粒转染与慢病毒感染效率比较） 2） 感染谱更广：慢病毒可以高效的感染神经细胞、肝细胞、心肌细胞、内
皮细胞、干细胞、原代细胞等多种通常不容易转染的细胞。（参见附录：图 2. 慢 病毒可以高效感染多种细胞）
要多次使用，建议在第一次融化后分装保存。
3．您还需要准备的其他实验材料 1）表达目的基因慢病毒载体质粒（详见 7.2，第 4 页） 2）慢病毒包装用 293T 细胞株 3）细胞培养基及血清 4）质粒转染试剂 5）其他常用实验耗材（如 100mm 培养皿，50ml 离心管等）
一种重组慢病毒载体、重组慢病毒及其应用[发明专利]
![一种重组慢病毒载体、重组慢病毒及其应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/b51c1bfaa21614791611280f.png)
专利名称：一种重组慢病毒载体、重组慢病毒及其应用
专利类型：发明专利
发明人：张守全,陈云,卫恒习,赵志宏,冯美莹,叶超,王凯,李莉,孟立
申请号：CN201811476996.8
申请日：20181204
公开号：CN109439688A
公开日：
20190308
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开一种重组慢病毒载体、重组慢病毒及其应用。
本发明是在慢病毒载体多克隆位点的上游插入HSA信号肽，下游插入纯化标签6×His序列，得到改装的慢病毒载体，然后将
6′His‑OPN片段插入到改装的慢病毒载体的XbaI和BamHI酶切位点之间得到重组慢病毒载体。
本发明通过稳转CHO细胞系，纯化后得到OPN重组蛋白，表达时间和水平可以人为的控制，纯化便捷，结构更接近于天然蛋白，本身更加有活性，功能更全面。
该蛋白加入到猪体外受精培养系中，可大大提高受精率，改善胚胎的发育。
可进一步应用到猪精液中，提高种猪的繁殖率。
此蛋白的出现会给猪场带来更好的发展前景，将养猪业推向新的发展阶段。
申请人：华南农业大学
地址：510642 广东省广州市天河区五山路483号
国籍：CN
代理机构：广州市华学知识产权代理有限公司
代理人：崔红丽
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GPR142 敲除慢病毒说明书
GPR142 Knockout Lentivirus产品简介：GPR142 Knockout Lentivirus (GPR142基因敲除慢病毒)是一种感染动物细胞后可以同时表达Cas9、目的基因sgRNA 和puromycin 抗性基因的慢病毒。
本产品用于在动物细胞中基于CRISPR/Cas9技术敲除目的基因，并且本慢病毒中sgRNA 的有效性已经通过T7EI 法的验证。
本慢病毒基因序列的关键图谱信息请参考图1。
本慢病毒可用于感染细胞或组织并进行目的基因的CRISPR/Cas9敲除。
图1. 可同时表达sgRNA 、Cas9和puromycin 抗性的本慢病毒其基因序列的关键图谱信息。
用于包装本慢病毒的质粒中的sgRNA 基于碧云天研发的CRISPR/Cas9 sgRNA 快速筛选和验证体系获得，sgRNA 的有效性已经通过T7EI 法验证。
本慢病毒用于实验时，建议同时选购无任何靶向的对照慢病毒Control Knockout Lentivirus (L00015)或靶向GFP 的对照慢病毒GFP Knockout Lentivirus (L00017)。
碧云天同时提供基于CRISPR/Cas9技术的GPR142基因敲除的质粒(L27170 pLenti-GPR142-sgRNA)、慢病毒(L27171 GPR142 Knockout Lentivirus)、HEK293T 细胞(L27172 GPR142 Knockout HEK293T Cells)、HEK293T 敲除细胞的RIPA 裂解液(L27173 GPR142 Knockout HEK293T RIPA Lysate)、HEK293T 敲除细胞的Trizol 裂解液(L27174 GPR142 Knockout HEK293T Trizol Lysate)等产品，具体请在碧云天网站查询或在本产品网页点击相应产品。
保存条件：-80ºC 保存，至少一年有效。
GenePharma 慢病毒载体 140512
6
LV6 穿梭质粒
Amp CMV HIV-1 5 LTR HIV-1 psi pack RRE HIV-1 3 LTR
LV6
8527 bp
WPRE EF-1a Puromycin CMV
Sph I (3798) Not I (3932) Nsi I (3964) Avr II (3969) Bam HI (3978)
Amp
CMV HIV-1 5 LTR HIV-1 psi pack
HIV-1 3 LTR
LV12
8087 bp
RRE
WPRE Puromycin T2A Luciferase05 CMV
U6
Hpa I (2936) Xho I (2951 )
Amp
CMV HIV-1 5 LTR HIV-1 psi pack
8
LV8 穿梭质粒
Amp CMV HIV-1 5 LTR HIV-1 psi pack HIV-1 3 LTR RRE
LV8
9262 bp
WPRE EF-1a Puromycin T2A RFP CMV
Sph I (3798) Not I (3932) Nsi I (3964) Avr II (3969) Bam HI (3978)
慢病毒相关载体：
编号 LV1 LV2 LV3 LV4 LV5 LV6 LV7 LV8 LV9 LV10 LV11 LV12 LV13 LV14
启动子 U6 U6 H1 EF-1a EF-1a EF-1a EF-1a EF-1a U6 U6 CMV u6 EF-1a EF-1a
荧光标签 GFP -GFP GFP GFP -RFP RFP RFP RFP -luci05 luci05 luci17
CD151基因RNAi慢病毒载体构建与稳转细胞株建立
CD151基因RNAi慢病毒载体构建与稳转细胞株建立傅立波;陶朝阳【期刊名称】《临床军医杂志》【年(卷),期】2008(36)3【摘要】目的构建人的CD151基因RNAi慢病毒载体,并建立A549-CD151i稳定细胞株。
方法根据人的CD151基因序列,设计三对RNAi序列,筛选出有效序列,利用此有效序列,合成相对应的Oligo DNA,退火后形成黏性末端的DNA双链,与双酶切后的pshRNA-Lentivector载体连接得到LV-CD151i慢病毒载体,转化TOP10感受态细胞,PCR筛选阳性克隆,并进行测序鉴定。
用LV-CD151i和包装质粒共转染慢病毒包装用293T细胞,生产慢病毒并检测获得的病毒滴度。
利用所获得的慢病毒感染A549细胞,筛选稳定转染细胞株。
结果测序证实,成功构建CD151 RNAi的慢病毒载体,并包装慢病毒,检测病毒悬液的滴度为5×108ifu,并利用此病毒悬液,成功感染A549细胞,筛选到稳定表达细胞株。
结论成功构建人CD151基因RNAi慢病毒载体,并建立稳定的A549-CD151i细胞株。
【总页数】4页(P330-333)【关键词】RNA干扰;慢病毒;CD;151【作者】傅立波;陶朝阳【作者单位】解放军广州军区武汉总医院保健科;解放军成都军区西藏总医院药剂科【正文语种】中文【中图分类】R373【相关文献】1.人PETA-3／CD151基因RNAi慢病毒载体的构建及沉默效应鉴定 [J], 王绍清;王俊平;徐凤琳;艾中伟;刘婷2.Ku80基因RNAi逆转录病毒载体的构建及稳定转染人肾癌786-O细胞株的建立[J], 戚德峰;胡渊;曾国华;纪卫东3.靶向程序性死亡因子-1配体的RNA干扰慢病毒载体构建及人胰腺癌稳转细胞株的建立 [J], 赵鑫;张光波;干文娟;李智;张子祥;李德春4.IGF-Ⅱ基因RNAi慢病毒载体构建与稳定转染细胞株建立 [J], 杨翠英;罗佐杰5.人肌细胞增强因子2A基因病毒载体构建及嗜铬细胞瘤PC12稳转细胞系的建立和鉴定 [J], 陆菡;于布为因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人CDH22基因RNAi慢病毒载体的构建及稳定干扰CDH22基因的表达
人CDH22基因RNAi慢病毒载体的构建及稳定干扰CDH22基因的表达周军;李建明;杨发达;柳玉红;丁彦青【期刊名称】《南方医科大学学报》【年(卷),期】2008(028)004【摘要】目的构建人CDH22基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默大肠癌细胞的CDH22基因表达,为研究CDH22在大肠癌转移中参与的信号转导机制提供研究基础.方法利用在线软件设计人CDH22基因shRNA序列,合成、退火形成双链寡核酸后克隆到pENTRTM/U6载体的黏性末端,测序.得到的阳性重组子再与慢病毒载体进行重组,获得真核表达慢病毒干扰载体.在脂质体的介导下将慢病毒包装辅助质粒和CDH22基因重组慢病毒载体导入293FT细胞包装病毒,测定病毒滴度,感染大肠癌细胞SW480,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰CDH22基因的细胞亚系.结果成功构建CDH22真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒滴度为8×105U/ml.荧光定量PCR结果表明,所获得的细胞克隆11中CDH22 mRNA水平的表达显著降低.结论成功构建出CDH22基因慢病毒RNAi表达载体,并获得CDH22基因稳定干扰的大肠癌细胞亚系,为研究CDH22在大肠癌转移中的作用机制提供了研究基础.【总页数】4页(P589-592)【作者】周军;李建明;杨发达;柳玉红;丁彦青【作者单位】南方医科大学南方医院病理科,南方医科大学病理学教研室,教育部广东省共建人类重大疾病转录组学和蛋白组学重点实验室,广东省分子肿瘤病理重点实验室,广东广州,510515;南方医科大学南方医院病理科,南方医科大学病理学教研室,教育部广东省共建人类重大疾病转录组学和蛋白组学重点实验室,广东省分子肿瘤病理重点实验室,广东广州,510515;南方医科大学南方医院病理科,南方医科大学病理学教研室,教育部广东省共建人类重大疾病转录组学和蛋白组学重点实验室,广东省分子肿瘤病理重点实验室,广东广州,510515;南方医科大学南方医院病理科,南方医科大学病理学教研室,教育部广东省共建人类重大疾病转录组学和蛋白组学重点实验室,广东省分子肿瘤病理重点实验室,广东广州,510515;南方医科大学南方医院病理科,南方医科大学病理学教研室,教育部广东省共建人类重大疾病转录组学和蛋白组学重点实验室,广东省分子肿瘤病理重点实验室,广东广州,510515【正文语种】中文【中图分类】R322【相关文献】1.Ku80基因RNAi逆转录病毒载体的构建及稳定转染人肾癌786-O细胞株的建立[J], 戚德峰;胡渊;曾国华;纪卫东2.应用RNA干扰技术建立PRL-3和CDH22双基因表达抑制的结直肠癌细胞模型[J], 姚娟;丁彦青;周军;柳玉红;李建明3.基因组不稳定肝细胞CDT1基因过表达和RNAi慢病毒载体的构建 [J], 原雅艺;党旭红;张睿凤;张忠新;任越;左雅慧4.Sirt3基因RNA干扰慢病毒载体及稳定表达的人神经母细胞瘤SH-SY5 Y细胞株的构建 [J], 张静怡;邓永宁;张萌;屈秋民5.CDH22基因克隆及其真核表达载体的构建与表达 [J], 周军;李建明;杨发达;柳玉红;丁彦青因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
慢病毒知识详解汇编
慢病毒——基因转移的潜在新载体用于基因治疗的载体系统可分为病毒性载体和非病毒性载体两类。
目前常用的病毒载体包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体等，但是这些载体均存在不足之处，严重影响了基因治疗的有效性及安全性。
在基因治疗中广泛应用的逆转录病毒载体存在的主要问题，是无法高效转导非分裂期细胞，而腺病毒载体虽然能转导非分裂期细胞，但在体内不能实现目的基因稳定的长期表达，且反复应用容易引起免疫反应。
慢病毒载体不但可以感染非分裂期细胞，还具有容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等优点，在基因治疗中具有广泛的应用前景。
现以HIV-1 为例，就慢病毒载体的生物学特征、慢病毒载体的构建、在基因治疗中的应用以及生物安全性等方面作一综述。
一、慢病毒载体的生物学特征慢病毒包括灵长类慢病毒，如人类免疫缺陷病毒(HIV) 和猴免疫缺陷病毒(SIV) ，以及非灵长类慢病毒如猫免疫缺陷病毒( FIV) 、马传染性贫血病毒(EIAV) 、牛免疫缺陷病毒(BIV) 和维斯纳-梅迪病毒(VMV)等。
目前，HIV-1、HIV-2、SIV、FIV 及EIAV被广泛研究用作基因治疗的载体，而其中又以H I V-1最为热门。
1.1H I V-1病毒形态与结构成熟的HIV-1 病毒直径100～120nm、呈20 面体对称结构、球形，电镜下可见一致密圆锥状核心，内有病毒RNA分子和酶，后者包括逆转录酶、整合酶(integrase) 和蛋白酶(proteas e)。
HIV-1的最外层为脂蛋白包膜，膜上有表面蛋白 (gp120) 和相嵌蛋白(gp41) 两种糖蛋白，gp120为刺突，gp41为跨膜蛋白。
包膜内面为P17 构成的基质蛋白(matrix) ，包膜内为衣壳蛋白(P24)包裹的RNA。
（若有条件在电镜下观察经多质粒系统制备成功的慢病毒颗粒，是否有利于慢病毒的多质粒包装工艺？）1.2H I V-1病毒基因组结构及其功能特征 HIV-1 的基因组由两条相同的正股RNA 链在5′端通过部分碱基互补配对而成二聚体。
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9
LV9 穿梭质粒
10
LV10 穿梭质粒
11
LV11 穿梭质粒
5'LTR Amp
RRE pUC ori
LV11
8.3Kb
CMV
Eco RI (2804) Xho I (281 0) Spe I (281 6) Xba I (2822) Not I (2829) BamHI (2836)
3'LTR IRES WPRE NEO
HIV-1 3 LTR
LV14
9580 bp
WPRE EF-1a
Not I (3932)
Luciferase17 CMV
Nsi I (3964) Avr II (3969) BamHI (3978)
6
LV6 穿梭质粒
Amp CMV HIV-1 5 LTR HIV-1 psi pack RRE HIV-1 3 LTR
LV6
8527 bp
WPRE EF-1a Puromycin CMV
Sph I (3798) Not I (3932) Nsi I (3964) Avr II (3969) Bam HI (3978)
HIV-1 3 LTR
RRE
LV13
91 00 bp
WPRE EF-1a Puromycin T2A Luciferase05 CMV
Sph I (3798) Not I (3932) Nsi I (3964) Avr II (3969) BamHI (3978)
Amp
CMV HIV-1 5 LTR HIV-1 psi pack RRE
8
LV8 穿梭质粒
Amp CMV HIV-1 5 LTR HIV-1 psi pack HIV-1 3 LTR RREຫໍສະໝຸດ LV89262 bp
WPRE EF-1a Puromycin T2A RFP CMV
Sph I (3798) Not I (3932) Nsi I (3964) Avr II (3969) Bam HI (3978)
慢病毒相关载体：
编号 LV1 LV2 LV3 LV4 LV5 LV6 LV7 LV8 LV9 LV10 LV11 LV12 LV13 LV14
启动子 U6 U6 H1 EF-1a EF-1a EF-1a EF-1a EF-1a U6 U6 CMV u6 EF-1a EF-1a
荧光标签 GFP -GFP GFP GFP -RFP RFP RFP RFP -luci05 luci05 luci17
7
LV7 穿梭质粒
Amp
CMV HIV-1 5 LTR HIV-1 psi pack RRE
HIV-1 3 LTR
LV7
861 1 bp
WPRE EF-1a RFP CMV
Sph I (3798) Not I (3932) Nsi I (3964) Avr II (3969) Bam HI (3978)
Amp
CMV HIV-1 5 LTR HIV-1 psi pack
HIV-1 3 LTR
LV12
8087 bp
RRE
WPRE Puromycin T2A Luciferase05 CMV
U6
Hpa I (2936) Xho I (2951 )
Amp
CMV HIV-1 5 LTR HIV-1 psi pack
Amp
CMV HIV-1 5 LTR HIV-1 psi pack
HIV-1 3 LTR
RRE
LV5
9337 bp
WPRE EF-1a Puromycin T2A GFP CMV
Sph I (3798) Not I (3932) Nsi I (3964) Avr II (3969) Bam HI (3978)
Amp CMV HIV-1 5 LTR HIV-1 psi pack
RRE HIV-1 3 LTR
LV4
8663 bp
WPRE EF-1a
Sph I (3798)
GFP CMV
Not I (3932) Nsi I (3964) Avr II (3969) Bam HI (3978)
5
LV5 穿梭质粒
真核核抗性 -Puro Puro -Puro Puro -Puro -Puro Neo Puro Puro --
原核抗性 Amp Amp Amp Amp Amp Amp Amp Amp Amp Amp Amp Amp Amp Amp
1
LV1 穿梭质粒
2
LV2 穿梭质粒
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LV3 穿梭质粒
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