荧光共振能量转移
1荧光共振能量转移 原理 如果两个荧光团相距在1~10 nm之间,且一个
1.荧光共振能量转移如果两个荧光团相距在1~10 nm之间,且一个荧光团的发射光谱与另一个荧光团的吸收光谱有重叠,当供体被入射光激发时,可通过偶极-偶极耦合作用将其能量以非辐射方式传递给受体分子,供体分子衰变到基态而不发射荧光,受体分子由基态跃迁到激发态,再衰变到基态同时发射荧光。
这一过程称为荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)。
1.适用于活细胞和固定细胞的各类分子,2.灵敏度和分辨率高,并能清晰成像,3.准确度高，操作简便4.最直观地提供蛋白质相互作用的定位和定量信息,首先,FRET对空间构想改变十分敏感,其测量范围在1~10 nm,但如果待测蛋白原本就相当接近, FRET信号已经达到最大值,此时一些刺激引起的微小的构想改变就可能无法引起FRET信号的很大改变;其次,存在光漂白作用, FRET需要起始激发光激发D,这时就很难避免对A的间接激发,这样的交叉激发降低了分析的灵敏性; 第三,存在其他一些本底荧光的干扰;另外,起始激发光可能会破坏一些光敏的组织和细胞,产生光毒性。
这些缺点很大程度上限制了FRET的进一步发展。
2.蛋白质双杂交技术以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。
由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。
如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转录与表达。
这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报道基因(reporter gene)。
通过对报道基因表达产物的检测, 反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。
荧光共振能量转移FERT
动生物医学研究的发展。
人工智能和机器学习在FERT数据分析中应用
数据处理和分析自
动化
利用人工智能和机器学习技术， 实现FERT数据的自动处理和分析， 提高数据处理效率。
特征提取和分类识
别
通过机器学习方法，对FERT数据 进行特征提取和分类识别，辅助 研究人员对实验结果进行解读和 分析。
预测模型构建
荧光探针
设计具有特异性识别功能 的荧光探针，用于检测生 物体内的特定分子或离子。
荧光成像技术
结合显微镜、荧光共聚焦 等技术，对生物样品进行 高分辨率、高灵敏度的荧 光成像。
药物筛选与设计
药物靶标研究
01
利用FERT技术，研究药物与靶标蛋白之间的相互作用，为药物
设计提供理论依据。
药物代谢动力学研究
02
在本次项目中，我们将FERT技术应用于多种生物分子相互作用的研究，如蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA等，进一步 验证了该技术的通用性和可靠性。
建立了完善的实验流程和数据分析方法
通过不断摸索和实践，我们建立了一套完善的FERT实验流程和数据分析方法，为后续的研究提供了重要 的参考和借鉴。
展望未来发展趋势和挑战
开发新型荧光染料和荧光蛋白，提高荧光信号的强度和稳定性， 以增加检测的灵敏度和特异性。
优化实验条件
通过调整实验条件，如温度、pH值、离子强度等，改善荧光共振 能量转移的效率，提高检测效果。
引入信号放大技术
结合信号放大技术，如酶联反应、纳米材料等，增强荧光信号，提 高检测灵敏度。
多模态成像技术在FERT中应用前景
活体成像的应用前景
FERT技术具有非侵入性、高灵敏度等优点，未来有望在活 体成像领域发挥重要作用。然而，活体成像需要解决荧光 染料的生物相容性、光稳定性等问题，这也是未来FERT技 术发展的重要方向之一。
13 荧光共振能量转移
Fluorescence resonance energy transfer, FRET
导言
荧光共振能量转移（FRET）已广泛应用于荧光的所有应用，包括 医学诊断、DNA分析和光学成像。FRET的广泛使用是由于能量传 递的有利距离，通常为蛋白质的大小或膜的厚度。此外，FRET的 程度很容易从荧光团的光谱特性预测。如果荧光团的光谱特性允 许FRET，它将发生，并且不会受到样品中生物分子的显著影响。 这些有利的特性允许基于样品的已知尺寸和结构特征来设计实验。 FRET是一种可以用经典物理学解释的电动力学现象。FRET发生 在激发态的供体（D）分子和基态的受体（A）分子之间。供体分 子通常以较短的波长发射，与受体的吸收光谱重叠。能量转移发 生在没有光子出现的情况下，并且是供体和受体之间的长程偶极偶极相互作用的结果。术语共振能量转移（RET）是优选的，因 为该过程不涉及光子的出现。能量转移率取决于供体的发射光谱 与受体的吸收光谱的光谱重叠程度、供体的量子产率、供体和受 体跃迁偶极的相对取向以及供体与受体之间的距离。受体分子 RET的距离依赖性允许测量供体和受体之间的距离。
FRET的理论基础
两种不同的发荧光分子，一个为D，另一个为 A 。当D吸收激发光，使D处于激发态D*。这 时如果在附近存在A，D*的激发能传给附近的 A，使A处于激发态A*, A* 就会发荧光
D * A D A* A hv (荧光）
这一现象称为激发能量转移或荧光共振能量转 移。D为供能者（donor , D),A为受能者 （acceptor, A),A发出的荧光称敏化荧光。
荧光与荧光光谱
与发光速率常数Kf呈反比关系，即 Kf越大，则 τ越小 一般物质的为10-9s 数量级，因而测量时所用 的脉冲时间必须小于10-9s ，在测量时只能用 光脉冲，所用仪器为瞬态荧光光谱仪 一般荧光光谱仪用氙灯产生荧光，发出的荧光 是稳定的, 因此普通所用的荧光光谱仪不能测量
荧光共振能量转移
1990年代
荧光共振能量转移技术开始应用于生物成像 领域。
1970年代
荧光共振能量转移技术开始应用于生物分子 相互作用的研究。
2000年代至今
随着技术的发展和仪器的改进，荧光共振能 量转移技术不断得到优化和应用拓展。
02
荧光共振能量转移
的实验技术
实验设备与试剂
荧光光谱仪
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激发态与荧光态
激发态
分子吸收光子后进入的较高能级状态。
荧光态
激发态分子通过辐射衰变回到基态，释放出光子，即荧光。
能量转移与荧光寿命
能量转移
当一个荧光分子的发射光谱与另一个分子的吸收光谱重叠时，后者可能从前者接收能量， 实现能量转移。
荧光寿命
荧光态分子的平均寿命，即荧光辐射衰变至基态的平均时间。
04
影响因素分析
分析实验结果，探讨荧光共振 能量转移的影响因素，如染料 浓度、溶剂性质、温度等。
应用前景
根据实验结果，探讨荧光共振 能量转移在生物医学、化学、
物理等领域的应用前景。
03
荧光共振能量转移
的理论基础
能级与光谱
能级
分子在吸收特定能量后，电子从基态 跃迁至激发态，形成不同的能级。
光谱
不同能级间存在能量差，当光子能量 与能级差相匹配时，分子吸收光子并 跃迁至激发态。
太阳能电池的光电转换效率和稳定性。
光电器件与太阳能电池的优化
03
通过荧光共振能量转移技术可以对光电器件和太阳能电池进行
优化，提高其性能和应用范围。
05
荧光共振能量转移
的挑战与展望
荧光共振能量转移的局限性
1荧光共振能量转移原理如果两个荧光团相距在1~10nm之间,且一个
1荧光共振能量转移原理如果两个荧光团相距在1~10nm之间,且一个1.荧光共振能量转移原理如果两个荧光团相距在1~10 nm之间,且一个荧光团的发射光谱与另一个荧光团的吸收光谱有重叠,当供体被入射光激发时,可通过偶极-偶极耦合作用将其能量以非辐射方式传递给受体分子,供体分子衰变到基态而不发射荧光,受体分子由基态跃迁到激发态,再衰变到基态同时发射荧光。
这一过程称为荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)。
优点1.适用于活细胞和固定细胞的各类分子,2.灵敏度和分辨率高,并能清晰成像,3.准确度高，操作简便4.最直观地提供蛋白质相互作用的定位和定量信息,缺点首先,FRET对空间构想改变十分敏感,其测量范围在1~10 nm,但如果待测蛋白原本就相当接近, FRET信号已经达到最大值,此时一些刺激引起的微小的构想改变就可能无法引起FRET信号的很大改变;其次,存在光漂白作用, FRET需要起始激发光激发D,这时就很难避免对A的间接激发,这样的交叉激发降低了分析的灵敏性; 第三,存在其他一些本底荧光的干扰;另外,起始激发光可能会破坏一些光敏的组织和细胞,产生光毒性。
这些缺点很大程度上限制了FRET的进一步发展。
2.蛋白质双杂交技术原理以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。
由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。
如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转录与表达。
这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报道基因(reporter gene)。
荧光共振能量转移技术的应用
荧光共振能量转移技术的应用荧光共振能量转移技术是一种基于分子间非辐射能量传递的原理的研究方法，被广泛应用于生物医学、化学和材料科学等领域。
本文将从基本原理、应用领域和未来发展方向等方面介绍荧光共振能量转移技术的应用。
一、基本原理荧光共振能量转移技术基于分子间的非辐射能量传递原理，通过能量传递的方式实现了荧光信号的转移。
在这种技术中，通常有两种分子参与，一种是受体分子，另一种是供体分子。
供体分子吸收外界激发光能后，通过非辐射能量传递的方式将能量传递给受体分子，使受体分子获得足够的能量从而产生荧光信号。
通过测量受体分子的荧光信号的强度和性质，可以间接地推断出供体分子的存在和性质。
这种技术在生物医学研究中被广泛应用于分子间相互作用的研究、分子结构的解析以及药物筛选等方面。
二、应用领域1. 药物筛选和疾病诊断荧光共振能量转移技术在药物筛选和疾病诊断中发挥着重要作用。
通过将荧光标记的供体分子和受体分子与待测药物或疾病标志物结合，可以通过监测荧光信号的变化来判断药物与受体的相互作用情况或疾病标志物的存在与浓度，从而实现药物筛选和疾病诊断的目的。
2. 分子间相互作用研究荧光共振能量转移技术可以用于研究分子间的相互作用，如蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA/RNA、蛋白质与小分子等之间的相互作用。
通过将荧光标记的供体分子和受体分子结合到待研究的分子上，可以通过监测荧光信号的强度和性质来推断分子间的相互作用方式和强度，从而深入了解分子间相互作用的机制。
3. 生物分子结构解析荧光共振能量转移技术在生物分子结构解析中也具有重要的应用价值。
通过将荧光标记的供体分子和受体分子结合到待测分子上，可以通过监测荧光信号的强度和性质来推断分子的构象和结构，从而解析生物分子的结构。
三、未来发展方向荧光共振能量转移技术在过去几十年取得了巨大的进展，但仍存在一些挑战和限制。
未来的发展方向主要包括以下几个方面：1. 提高检测灵敏度和分辨率：目前，荧光共振能量转移技术的检测灵敏度和分辨率还有待提高，可以通过改进荧光标记物的性能和开发新的检测方法来实现。
荧光共振能量转移 相互作用 酶标仪
荧光共振能量转移 (FRET) 相互作用是一种重要的生物化学现象，它在许多生物学研究领域中都有着重要的应用。
而酶标仪是一种常用的实验仪器，用于检测和测量各种生物分子的浓度和活性。
本文将从荧光共振能量转移的基本原理、在生物学研究中的应用、以及酶标仪的工作原理和应用等方面进行介绍。
一、荧光共振能量转移的基本原理1. 荧光共振能量转移是指一个荧光分子的激发态能量通过非辐射能量转移的过程，被另一个非激发态的荧光分子吸收的现象。
在此过程中，有一个荧光分子的激发态能量转移到另一个荧光分子，从而导致后者产生荧光。
这种荧光共振能量转移的现象通常用于研究蛋白质、核酸和其他生物大分子的构象变化、相互作用、以及测定它们之间的距离等。
二、荧光共振能量转移在生物学研究中的应用2. 荧光共振能量转移在生物学研究中有着广泛的应用，例如用于研究蛋白质与蛋白质、蛋白质与核酸、蛋白质与小分子的相互作用，以及在细胞内的功能和信号传导等方面的研究中。
荧光共振能量转移技术的发展，促进了生物学研究对分子相互作用、细胞信号传导以及疾病机制等方面的深入了解。
三、酶标仪的工作原理和应用3. 酶标仪是一种用于检测生物分子浓度和活性的仪器，它基于酶标记技术，利用酶和底物之间的特异性反应来测定样品中生物分子的浓度。
酶标仪通过光电检测技术，将样品中的荧光、吸光度等信号转换成可视化的数据，从而实现对生物分子的定量分析。
四、荧光共振能量转移与酶标仪的结合应用4. 荧光共振能量转移技术与酶标仪的结合应用，拓展了酶标记技术在生物学研究中的应用范围。
利用荧光共振能量转移技术可以实现对生物分子的高灵敏度、高通量的检测分析，结合酶标仪的定量测量功能，可以实现对生物分子浓度和活性的精准测定，极大地促进了生物学研究的深入发展。
五、结语在生物学研究领域中，荧光共振能量转移技术和酶标仪的结合应用，为科研工作者提供了强大的工具，促进了对生物分子相互作用、疾病机制和细胞信号传导等方面的深入研究。
荧光共振能量转移技术在生命科学中的应用及研究进展
荧光共振能量转移技术在生命科学中的应用及研究进展一、本文概述荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）是一种在分子尺度上测量距离和相互作用的强大技术，广泛应用于生命科学领域。
FRET依赖于两个荧光分子间的非辐射能量转移，当两个荧光分子足够接近时，一个荧光分子（称为供体）可以通过偶极-偶极相互作用将其激发态能量转移给另一个荧光分子（称为受体）。
由于能量转移效率与供体和受体之间的距离紧密相关，因此，FRET可以被用作一种灵敏的分子尺度的距离探测器。
本文将对荧光共振能量转移技术在生命科学中的应用及其研究进展进行全面的探讨，旨在展现这一技术在生物学、医学等领域中的重要作用和潜在价值。
二、FRET技术的基本原理荧光共振能量转移（FRET）是一种非辐射性的能量转移过程，它发生在两个荧光分子之间，其中一个分子（称为供体）在激发状态下，能够将能量转移给另一个邻近的且激发态能量较低的荧光分子（称为受体）。
这一过程的发生需要供体和受体之间的距离足够近，通常在10纳米以内。
当供体被光激发后，它的电子会从基态跃迁到激发态，如果这个激发态的能量高于受体的基态与激发态之间的能量差，那么供体就可以通过偶极-偶极相互作用将能量传递给受体，使其从基态跃迁到激发态。
受体随后会以发射荧光的形式释放能量，返回到基态。
FRET技术的关键参数包括能量转移效率、供体与受体之间的距离以及供体和受体的相对光谱重叠程度。
能量转移效率通常与供体和受体之间的距离的六次方成反比，这意味着当两者之间的距离稍有增加时，能量转移效率会迅速下降。
因此，FRET对距离的变化非常敏感，使得它成为一种强大的工具，能够用于研究分子间的相互作用、蛋白质构象变化以及生物分子间的动态过程。
FRET技术还可以通过比较供体和受体的荧光信号强度来定量测量分子间的距离，从而揭示生物分子间的相互作用机制。
例如，在蛋白质相互作用的研究中，可以通过将供体和受体分别标记在两个不同的蛋白质上，观察它们之间的FRET信号变化来推断蛋白质之间的结合和解离过程。
药物分析中的荧光共振能量转移技术研究
药物分析中的荧光共振能量转移技术研究药物分析是一门重要的科学领域，其研究的目标是准确测定药物的成分、结构和含量，以便探索其活性与功效，同时确保药物的质量和安全性。
荧光共振能量转移技术（Fluorescence Resonance Energy Transfer，简称FRET）是近年来在药物分析研究中得到广泛应用的一种方法。
本文将探讨荧光共振能量转移技术在药物分析中的应用和研究进展。
一、荧光共振能量转移技术的基本原理荧光共振能量转移技术是一种通过能量的非辐射传递来实现分子间相互作用的手段。
它基于荧光共振现象，即在分子间距离一定范围内，当一个分子激发并发射荧光时，其荧光能量可通过非辐射方式传递给另一个接受体分子，使其产生荧光。
荧光共振能量转移过程受到多个因素的影响，如距离、取向、摩尔吸光系数、量子产率等。
二、荧光共振能量转移技术在药物分析中的应用1. 蛋白质相互作用研究荧光共振能量转移技术可用于研究药物与蛋白质之间的相互作用。
通过标记不同的荧光剂，将其分别连接到药物和蛋白质上，当两者相互作用时，荧光共振能量转移过程将发生。
通过测量能量转移后的荧光强度变化，可以揭示药物与蛋白质之间的结合情况和相互作用机制。
2. 药物代谢研究荧光共振能量转移技术可用于研究药物在体内的代谢过程。
将荧光剂标记到药物分子上，将其注入活体体内，随着药物的代谢，荧光共振能量转移强度将发生变化。
通过测量代谢产物的荧光强度，可以定量了解药物的代谢情况和代谢产物的生成速率。
3. 荧光传感器开发荧光共振能量转移技术可以用于开发药物分析的传感器。
通过合理设计荧光剂和目标药物的结构，利用能量转移过程的敏感性，可以实现对目标药物的快速、准确检测。
这种基于荧光共振能量转移的传感器具有灵敏度高、选择性好、操作简便等优点，在临床医学和药物研发中具有广阔的应用前景。
三、荧光共振能量转移技术研究的进展随着科学技术的不断发展，荧光共振能量转移技术在药物分析领域得到了广泛研究和应用。
荧光共振能量转移技术的应用
荧光共振能量转移技术的应用荧光共振能量转移技术，又称FRET技术（Förster Resonance Energy Transfer），是一种在生物医学领域广泛应用的技术，它利用分子间能量的传递来研究蛋白质、细胞及其各种生物分子的结构和功能。
FRET技术的应用涵盖了生物医学研究的许多领域，如药物发现、疾病诊断、蛋白质交互作用研究等，因此，FRET技术被认为是生物医学领域的重要技术之一。
FRET技术的基本原理是利用发射光与吸收光之间的相互作用来传递能量。
FRET现象的发生需要两个荧光分子，一个是受体分子（也称接受者），另一个是供体分子（也称激发物）。
当供体分子被激发时，它的激发态能量可以传递给受体分子，导致受体分子发生荧光发射。
这种荧光发射的能量是低于供体分子的能量的，这表明能量已经被传递给了受体分子。
FRET技术通过测量物质之间荧光发射的变化来确定分子间的距离和相互作用。
FRET技术在药物发现中的应用日益突出。
药物发现是一项复杂的过程，需要了解药物分子和靶分子之间的相互作用。
使用FRET技术可以探测药物分子和靶分子之间的相互作用，并且可以通过荧光发射能量的变化来确定药物分子的结构和功能。
FRET技术的应用可以加速药物发现的速度和效率，并且可以减少在药物发现中的试错次数。
除了在药物发现中的应用外，FRET技术还在生物医学领域的疾病诊断中发挥着重要的作用。
例如，FRET技术可以用于患者体内对某些分子的检测。
例如，FRET技术可以检测已经被标记的癌细胞，特别是早期癌症病人的癌细胞，通过治疗后观察癌细胞的减少情况，可以评估治疗效果。
这种方法可以大大减少对病人的伤害，并且提高癌症诊断的准确性。
FRET技术还在研究蛋白质和细胞的交互作用中发挥着重要作用。
蛋白质和细胞间的相互作用是生命活动中的重要过程，研究这些过程有助于揭示生命活动的机理并且进一步发现治疗疾病的方法。
FRET技术通过测量荧光信号来研究蛋白质和细胞的交互作用。
FRET荧光共振能量转移
FRET荧光共振能量转移本词条由“科普中国”科学百科词条编写与应用工作项目审核。
当一个荧光分子（又称为供体分子）的荧光光谱与另一个荧光分子（又称为受体分子）的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。
FRET 程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，一般为7～10 nm 时即可发生FRET; 随着距离延长，FRET呈显著减弱。
供体和受体之间FRET的效率，可以由E=1/1+(R/R0)exp6反映，其中R表示供体和受体之间的距离，R0表示福氏半径，依赖供体发射谱和受体激发谱的重叠程度，以及供体和受体能量转移的偶极子的相对方位。
中文名•荧光共振能量转移外文名•Förster resonance energy transfer, fluorescence resonance energy transfer(FRET)条件•激发光谱相重叠时简介•供体荧光分子自身的荧光强度衰减范围•两个不同的荧光基团中发生原理荧光共振能量转移是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体 Donor）的发射光谱与另一个基发生条件能量供给体－接受体（D–A）对之间发生有效能量转移的条件是苛刻的，主要包括：(1)能量供体的发射光谱与能量受体的吸收光谱必须重叠；(2)能量供体与能量受体的荧光生色团必须以适当的方式排列；(3)能量供体、能量受体之间必须足够接近，这样发生能量转移的几率才会高。
此外，对于合适的供体、受体分子在量子产率、消光系数、水溶性、抗干扰能力等方面还有众多的要求。
可见，要找到一个合荧光共振能量转移适的D–A对是很不容易的。
tamra 荧光共振能量转移
Tamra 荧光共振能量转移一、概述荧光共振能量转移（FRET）是一种分子之间能量转移的过程，通过这种过程，一个激发态分子的能量可以传递给另一个分子，从而激发另一个分子成为激发态。
这种过程在生物学、生物化学和生物医学等领域中有着重要的应用和意义。
二、原理在FRET中，通常存在一个受体分子和一个给体分子。
当给体分子受到激发而处于激发态时，它会发出一个能量恰好与受体分子的激发态能量相匹配的光子。
这时，受体分子会吸收这个光子，使得受体分子也处于激发态。
在一些情况下，受体分子会通过发出荧光或者其他方式释放掉这部分能量。
三、应用1. 生物标记FRET被广泛应用于生物标记技术中，通过激发和检测受体分子和给体分子之间的能量转移来实现生物分子的定位和监测。
利用荧光共振能量转移技术可以观察蛋白质在细胞内的相互作用，研究生物膜上的受体、通道、酶等分子，并且还可以用作高通量筛选技术。
2. 光学成像FRET也被应用于光学成像领域，通过观察分子间的荧光共振能量转移过程，可以实现高分辨率的光学成像，例如在研究细胞内分子的定位和互作关系方面有着重要的应用。
3. 荧光传感FRET在分析化学和生物医学领域中也有重要应用，例如可以将FRET 技术应用于生物分子或者环境中的化学物质的传感与检测。
四、发展随着生物技术和光学成像技术的不断发展，FRET技术也在不断改进和应用扩展。
更加灵敏和可视化的FRET探针正在不断被设计和制备，为生物医学和生命科学研究提供了更好的工具。
FRET技术也与其他技术相结合，如单分子成像技术、光学和电化学技术等，以实现更加全面和深入的生物分子研究。
五、结语荧光共振能量转移作为一种重要的分子间能量转移方式，在生物学、生物化学和生物医学领域中有着广泛的应用前景。
随着技术的不断进步和发展，相信FRET技术将在更广泛的领域中发挥更加重要的作用。
六、优势和挑战FRET技术的优势在于其高度的灵敏度和分辨率，能够实现单个分子层面的检测和成像，同时对生物分子的动态过程有着极佳的监测能力。
荧光共振能量转移
FRET技术研究PEDF和目标蛋白之间在小鼠神经元（神经胶质细胞）的相互作用一、FRET技术基本原理荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。
FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。
能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。
作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件：①受、供体的激发光要足够分得开；②供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。
人们已经利用生物体自身的荧光或者将有机荧光染料标记到所研究的对象上，成功地应用于核酸检测、蛋白质结构、功能分析、免疫分析及细胞器结构功能检测等诸多方面。
（传统有机荧光染料吸收光谱窄，发射光谱常常伴有拖尾，这样会影响供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，而且供、受体发射光谱产生相互干扰。
最新的一些报道将发光量子点用于共振能量转移研究，克服了有机荧光染料的不足之处。
相对于传统有机荧光染料分子，量子点的发射光谱很窄而且不拖尾，减少了供体与受体发射光谱的重叠，避免了相互间的干扰；由于量子点具有较宽的光谱激发范围，当它作为能量供体时，可以更自由地选择激发波长，可以最大限度地避免对能量受体的直接激发；通过改变量子点的组成或尺寸，可以使其发射可见光区任一波长的光，也就是说它可以为吸收光谱在可见区的任一生色团作能量供体，并且保证了供体发射波长与受体吸收波长的良好重叠，增加了共振能量转移效率。
）以GFP的两个突变体CFP（cyan fluorescent protein）、YFP（yellow fluorescent protein）为例简要说明其原理：CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱有相当的重叠，当它们足够接近时，用CFP的吸收波长激发，CFP的发色基团将会把能量高效率地共振转移至YFP的发色基团上，所以CFP的发射荧光将减弱或消失，主要发射将是YFP的荧光。
荧光共振能量转移(FERT)
荧光共振能量转移技术
fluorescence resonance energy transfer (FRET)
概念
当供体荧光分子（荧光基团）的发射光谱与受 体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的 距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放 射性的能量转移，即FRET现象，使得供Байду номын сангаас的 荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝 灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧 光）。
荧光共振能量转移(FRET)现象
1. 供体(Donor, D) 2. 受体(Acceptor, A) 3. FRET现象的特征: 选择性激发供体,却能检测到受体发射的荧光
Donor
Em. 470nm
CFP
YFP Em. 535nm
Ex. 470nm Acceptor
Ex. 440nm
FRET 原理(Principle)
利用FRET技术检测不发光分子间相互作用的策略
FRET技术应用三: 检测分子的折叠与构象变化
Laser
FRET技术应用四：细胞内钙离子浓度的实时测量
(b)
Miyawaki A, et al., Nature 1997, 388:882-887
我们的方向：
荧光共振能量转移在生物医学检测中的应用 ➢ 荧光共振能量转移用于蛋白质分子检测 ➢ 荧光共振能量转移用于核酸分子检测 ➢ 荧光共振能量转移用于糖分子检测 ➢ 荧光共振能量转移用于其他分子检测 ➢ 荧光共振能量转移用于无机盐离子检测
FRET应用
➢分子定位研究 ➢大分子在细胞内的弥散过程和运输过程研究 ➢蛋白质构象改变研究 ➢分子与分子间相互作用研究 ➢分子合成和降解过程研究 ➢酶活性检测方面
Fret荧光共振能量转移
Fret荧光共振能量转移对于分子生物学来讲，生物分析手段的发展，是阐明机理的必要条件。
在研究分子间相互作用的道路上，人们不断探索，总结出很多方法，免疫技术，晶体衍射，核磁共振等。
1948年，荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）理论被首次提出，它可以测定1.0-6.0nm距离内分子间的相互作用。
1967年，这一理论得到了实验验证，将1.0-6.0nm的距离称为光学尺。
二十世纪八十年代出，通过科学家的不断探索，Fret技术成功运用到蛋白质结构的研究中。
自Fret荧光共振能量技术诞生以来，已结合多种先进的技术和方法，如电子显微镜，X射线衍射等，推动了分子生物学检测手段的发展。
作用原理荧光共振能量转移技术，是采用物理方法去检测分子间的相互作用的方法。
他适用于在细胞正常的生理条件下，验证已知分子间是否存在相互作用。
此方法的检测原理如下；将我们要检测的蛋白（如图X和Y），分别偶联上D和A荧光蛋白，D和A是一对荧光物质，我们称之为供体（donor）和受体（acceptor）。
当用430nm的紫光去激发X融合蛋白时，它能够产生490nm的蓝色荧光；同样，当我们用490nm的蓝光去激发Y融合蛋白时，它能够产生530nm的黄色荧光。
（结合图1）。
当蛋白X和Y间没有相互作用时（两者的空间距离>10nm），融合蛋白X和Y分别产生相应的荧光而被检测到，如果蛋白X和Y间存在相互作用（两者的空间距离需<10nm，结合图2），用紫光激发融合蛋白X其产生的蓝光会被融合蛋白Y吸收，从而产生黄色荧光，这时，在细胞内将检测不到蓝色荧光的存在。
这时因为能量从X融合蛋白转移到了Y融合蛋白，这就是荧光共振能量转移技术。
技术难点一个理想的Fret相互作用体系，要求要有一对合适的荧光物质，即供体的发射光谱与受体的吸收光谱有明显的重叠。
且当供体的激发波长时对受体无影响，供体和受体的发射光谱要完全分开，否则容易造成光谱干涉，而使反应体系不稳定。
荧光共振能量转移技术
1.2 FRET的理论基础
两种不同的发荧光分子，一个为D，另一个为 A 。当D吸收激发光，使D处于激发态D*。这 时如果在附近存在A，D*的激发能传给附近的 A，使A处于激发态A*, A* 就会发荧光
D * A D A* A hv (荧光）
这一现象称为激发能量转移或荧光共振能量转 移。D为供能者（donor , D),A为受能者 （acceptor, A),A发出的荧光称敏化荧光。
FRET研究受体二聚化
FR/FG
1.7 1.5
1.3 1.1 0.9 0.7 0.5 0 5 10 15 20
FR
FG
25
time[min]
GFP 和 RFP 共同表达并定位在 GH3 细胞 膜上； 在共聚焦显微镜下观察活细胞膜上GFP 和RFP各自的荧光； 加入激动剂处理，分别记录处理前后 RFP与GFP荧光的比例 FR/FG, 图中最下的是绿色荧光蛋白的荧光强 度随时间的变化曲线 (FG), 中间的是红 色荧光蛋白的荧光强度随时间的变化曲 线 (FR), 最上的是 FR/FG 比值随时间的变 化曲线； 刚加入时，FR/FG约为1，二者荧光强度 几乎相同，随着时间的推移，比值增加， 说明GFP的荧光逐渐移到RFP上。
FRET的理论基础
用荧光共振能量转移方法测量二基团之间的距 离r，称光谱尺（Spectroscopic ruler） 在受体结构与功能研究中， FRET常用来研究
受体-配体之间的距离 配体-受体相互作用的平衡常数 受体二聚化 受体构象变化
2. FRET在受体研究中的应用
2.1 测配基-受体结合的距离
荧光能量共振转移技术
荧光能量共振转移技术
荧光能量共振转移技术（FRET）是当今生物学中应用广泛的一种分子生物学技术。
它是基于一种荧光原理，可以实现在细胞和生物组织水平上检测分子间的距离和相互作用。
FRET技术基于两种荧光蛋白质之间的共振转移，这两种荧光蛋白质分别称为供体（donor）和受体（acceptor）。
它们的结构类似，但有不同的激发和发射光谱特点。
当供体分子受到激发而荧光发出时，它的荧光能量可以通过空间距离非常近的受体分子转移出去，使受体分子被激发，产生荧光。
这种共振转移只会发生在供体和受体分子之间的距离非常近的情况下，通常是小于10纳米。
因此，通过测量供体激发和受体荧光等光谱特征的变化，可以精确地测量分子间的距离和相互作用。
FRET技术的应用非常广泛，包括蛋白质相互作用、药物筛选、细胞信号转导、核酸适配体筛选等方面。
例如，利用FRET技术可以研究蛋白质之间的相互作用，研究蛋白质的结构和功能；在药物开发中，FRET技术可以用于筛选化合物的相互作用和选择最优的化合物；在细胞信号转导的研究中，FRET技术可以用来监测细胞中的许多信号分子的匀布和相互作用情况等。
总之，荧光能量共振转移技术是一种灵敏、精确、无标记、非侵入性的技术，其应用领域非常广泛，在生命科学和药学等领域有着很重要的作用。
随着FRET技
术的不断发展，其应用将变得更加广泛，并为生命科学领域带来更多的新的发现。
荧光共振能量转移fret寿命
荧光共振能量转移fret寿命
荧光共振能量转移（FRET）是一种非辐射能量转移过程，它涉及到两个相互作用的荧光分子，一个作为供体，另一个作为受体。
在FRET中，供体分子的激发态能量通过非辐射耦合传递给受体分子的激发态，这种转移是距离依赖性的。
FRET的寿命是指供体分子在激发态下发生FRET的平均时间，通常以寿命来描述FRET的效率。
FRET的寿命可以从几个方面来理解和解释。
首先，从技术角度来看，FRET的寿命可以通过实验测量得到。
通过激发供体分子并观察受体分子的荧光寿命的变化，可以推断出FRET的发生和效率。
其次，从理论角度来看，FRET的寿命受到供体和受体之间的距离、取向、介质环境等因素的影响。
这些因素会影响FRET的速率和效率，进而影响FRET的寿命。
此外，FRET的寿命还可以用来研究供体和受体之间的相对运动、结构变化等动力学过程。
总之，FRET的寿命是描述供体分子激发态能量转移给受体分子的平均时间，它既可以通过实验测量得到，也可以从理论上解释和研究。
理解FRET的寿命有助于揭示分子间相互作用的动力学过程，对于生物学、化学和材料科学等领域具有重要意义。
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FRET技术研究PEDF和目标蛋白之间在小鼠神经元（神经胶质细胞）的相互作用一、FRET技术基本原理荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。
FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。
能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。
作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件：①受、供体的激发光要足够分得开；②供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。
人们已经利用生物体自身的荧光或者将有机荧光染料标记到所研究的对象上，成功地应用于核酸检测、蛋白质结构、功能分析、免疫分析及细胞器结构功能检测等诸多方面。
（传统有机荧光染料吸收光谱窄，发射光谱常常伴有拖尾，这样会影响供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，而且供、受体发射光谱产生相互干扰。
最新的一些报道将发光量子点用于共振能量转移研究，克服了有机荧光染料的不足之处。
相对于传统有机荧光染料分子，量子点的发射光谱很窄而且不拖尾，减少了供体与受体发射光谱的重叠，避免了相互间的干扰；由于量子点具有较宽的光谱激发范围，当它作为能量供体时，可以更自由地选择激发波长，可以最大限度地避免对能量受体的直接激发；通过改变量子点的组成或尺寸，可以使其发射可见光区任一波长的光，也就是说它可以为吸收光谱在可见区的任一生色团作能量供体，并且保证了供体发射波长与受体吸收波长的良好重叠，增加了共振能量转移效率。
）以GFP的两个突变体CFP（cyan fluorescent protein）、YFP（yellow fluorescent protein）为例简要说明其原理：CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱有相当的重叠，当它们足够接近时，用CFP的吸收波长激发，CFP的发色基团将会把能量高效率地共振转移至YFP的发色基团上，所以CFP的发射荧光将减弱或消失，主要发射将是YFP的荧光。
两个发色基团之间的能量转换效率与它们之间的空间距离的6次方成反比，对空间位置的改变非常灵敏。
例如要研究两种蛋白质a和b间的相互作用，可以根据FRET原理构建融合蛋白，这种融合蛋白由三部分组成：CFP（cyan fluorescent protein）、蛋白质b、YFP（yellow fluorescent protein）。
用CFP吸收波长433nm作为激发波长，实验灵巧设计，使当蛋白质a与b没有发生相互作用时，CFP与YFP相距很远不能发生荧光共振能量转移，因而检测到的是CFP的发射波长为476nm的荧光；但当蛋白质a与b发生相互作用时，由于蛋白质b受蛋白质a作用而发生构象变化，使CFP与YFP充分靠近发生荧光共振能量转移，此时检测到的就是YFP的发射波长为527nm的荧光。
将编码这种融合蛋白的基因通过转基因技术使其在细胞内表达，这样就可以在活细胞生理条件下研究蛋白质-蛋白质间的相互作用。
黄色荧光蛋白报告载体，如下图：青色荧光蛋白报告载体，如下图：一．质粒的选择及载体构建：订购：1.带有Sal I和Sac II两个酶切位点的小鼠PEDF过表达克隆质粒2.带有Kpn I和Xba I两个酶切位点的小鼠目标蛋白过表达克隆质粒3.pECFP．C1质粒4.pEYFP．C1质粒5. Sal I、Sac II、Kpn I、Xba I内切酶6.dna合成酶等二． PEDF核青色荧光蛋白（pECFP-C1）表达载体的构建及鉴定小鼠c57PEDF序列blst获得：1 atgcaggccc tggtgctact cctctggact ggagccctgc tcgggcacgg cagcagccag61 aacgtcccca gcagctctga gggctcccca gtcccggaca gcacgggcga gcccgtggag121 gaggaggacc ccttcttcaa ggtccctgtg aacaagctgg cagcagctgt ctccaacttc181 ggctacgatc tgtaccgcct gagatccagt gccagcccaa cgggcaacgt cctgctgtct241 ccactcagcg tggccacggc cctctctgcc ctttctctgg gagctgaaca tcgaacagag301 tctgtcattc accgggctct ctactacgac ctgatcacca accctgacat ccacagcacc361 tacaaggagc tccttgcctc tgttactgcc cctgagaaga acctcaagag tgcttccaga421 attgtgtttg agaggaaact tcgagtcaaa tccagctttg ttgcccctct ggagaagtcc481 tatgggacca ggccccggat cctcacgggc aaccctcgag tagaccttca ggagattaac541 aactgggtgc aggcccagat gaaagggaag attgcccggt ccacgaggga aatgcccagt601 gccctcagca tccttctcct tggcgtggct tacttcaagg ggcagtgggt aaccaagttt661 gactcgagaa agacgaccct ccaggatttt catttggacg aggacaggac cgtgagagtc721 cccatgatgt cagatcctaa ggccatctta cgatacggct tggactctga tctcaactgc781 aagattgccc agctgccctt gacaggaagt atgagcatca tcttcttcct gcccctgacc841 gtgacccaga acttgaccat gatagaagag agcctcacct ctgagttcat tcatgacatc901 gaccgagaac tgaagactat ccaagctgtg ctgactgtcc ccaagctgaa gctgagcttc961 gaaggcgaac ttaccaagtc tctgcaggac atgaagctac agtcgttgtt tgaatcaccc1021 gacttcagca agattactgg caaacccgtg aagctcaccc aagtggaaca cagggctgct1081 ttcgagtgga atgaagaggg ggcaggaagc agccccagcc caggcctcca gcccgtccgc1141 ctcaccttcc cgctagacta tcaccttaac caacctttcc tctttgttct gagggacacg1201 gacacggggg ccctcctctt cataggcaga atcctggacc ccagtagtac ttaa分别在上游引物序列的5’端和下游引物的5’分别加入Sal I和Sac II 两个酶切位点序列。
设计引物序列如下：Primer F：5、GTCGAC-atgcaggccctggtgctact-3、Primer R：5、CCGCGG-ttaagtactactggggtcca-3、其中GTCGAC为酶切位点Sal I，CCGCGG为酶切位点Sac II。
引物中未加入保护碱基。
具体构建质粒pECFP-C1-pedf步骤：1.pedf片段的pcr扩增，提取和纯化2.有文献报道利用一次中间载体topo载体的构建可以相对容易的将pedf构建到pECFP-C1中，不知道这个实验需要不需要做这一步？3.pECFP-C1质粒的扩增、提取和纯化4.pECFP-C1质粒的酶切5.pECFP-C1片段的去磷酸化用去磷酸化试剂盒ClonedAlkaline Phosphatase(CIAP)将pECFP-C1片段切口去磷酸化。
（不知道是不是必须做这一步）6.pECFP-C1酶切片段的纯化(~4．7kb)试剂盒(琼脂糖凝胶DNA／PCR产物小量回收试剂盒——TaKaR A：DV805A)1．2％琼脂糖凝胶回收的DNA量应大于200ng／ul7.pECFP-C1-pedf质粒的连接和转化8.pECFP-C1-pedf质粒的扩增、提取和纯化（菌液pcr）9.pECFP-C1-pedf质粒的鉴定（送公司测序）三．目标蛋白基因序列及引物设计：分别在上游引物序列的5’端和下游引物的5’分别加入Kpn I和Xba I 两个酶切位点序列。
设计引物序列如下：Primer F：5、ATGGTACC-。
-3、Primer R：5、ATTCTAGA- 。
-3、其中GTCGAC为酶切位点Kpn I，，CCGCGG为酶切位点点Xba I。
引物中5，端加入保护碱基AT。
pEYFP-C1-目标蛋白载体的构建与上述步骤类似。
四．阳性对照质粒pECFP-C1-YFP的构建及鉴定Primer F：5、-GTCGACATGGTGAGCAAG-3、Primer R：5、-CCGCGGTCTAGATCCGGTG-3、其中GTCGAC为Sal I酶切位点，CCGCGG为Sac II酶切位点。
载体具体构建过程与上述过程相同。
五．PEDF和目标蛋白在神经细胞（或胶质细胞）中的FRET研究1.神经细胞（或胶质细胞）的培养2.PEDF蛋白和目标蛋白在神经细胞（或胶质细胞）中的免疫荧光定位：将神经细胞（或胶质细胞）均匀种植在petri皿里，24h后待细胞贴壁。
PBS液洗细胞3次，再用4％多聚甲醛固定15min，PBS液洗3次。
用0.5％Triton穿孔15min，再用PBS洗3次每次5min。
然后用I％BSA 封闭30min。
将petri皿小室内液体吸干净，加入用I％BSA按1：1000稀释好的PEDF和目标蛋白抗体，4℃过夜后，用PBS洗3次，加入二抗，37。
C孵育1h。
用PBS洗3次。
此过程注意避光。
加200ulFluo—Anti fading medium防止荧光淬灭，在共聚焦显微镜下观察。
3.荧光融合蛋白在神经细胞（或胶质细胞）中的表达：质粒转染48h后荧光显微镜下观察并拍照后，细胞提取总蛋白进行免疫蛋白印迹分析4.激光共聚焦显微镜检测FRET：利用脂质体法将pECFP-PEDF和pEYFP-目标蛋白共转染原代神经细胞。