HA标签融合蛋白纯化试剂盒
His标签蛋白纯化实验步骤
His标签蛋白纯化实验通过实验，学习和了解 His-Tag 融合蛋白的表达、纯化原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用。
一、实验原理金属螯合离子亲和色谱（IMAC）是常见的亲和纯化方案之一，主要利用介质配体螯合的金属离子吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白。
His-tag 融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性。
Ni IDA Beads 可以用于各种表达来源（如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞）的组氨酸标签（6xHis-tagged）蛋白的纯化。
它是以 4%琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联了三配位的亚氨基二乙酸（IDA），螯合镍离子（Ni ）后，可以形成比较稳定的平面四边形结构，从而有更多的位点与组氨酸标签上的咪唑环继续配位，达到结合目的蛋白的效果（产品化学结构见图 1.1 所示）。
二、实验准备试剂菌种、LB 培养基、氨卞青霉素、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、His-Tag 蛋白纯化试剂盒实验仪器和设备移液器、恒温振荡箱、超声破碎仪、离心机、紫外检测仪、冰箱三、实验步骤第一步、菌体制备1、取 2 支 4ml LB 培养基试管，超净台中操作。
每管加入 4ul 菌种，4ul 氨卞青霉素。
放入 37 度恒温振荡箱 180rpm，过夜培养，16 小时。
2、将菌种加入 800ml LB 培养基，800ul 氨卞青霉素，放入 37 度恒温振荡箱 180rpm培养 4 小时，OD600 约 0.6-0.8。
3、加入 IPTG 800ul，放入 37 度恒温振荡箱 180rpm 培养 4 小时。
4、离心 8000rpm 离心 10min 收集菌体，-80 度保存菌体。
第二步、菌体破碎1、将菌体取出，加入 50ml Lysis Buffer 磁力搅拌悬浮，待无明显块状即可。
2、超声 4s 停 6s，36°保护温度，超声 30min。
3、将破碎好的裂解液离心取上清（11000rpm ,20min ,4℃），准备上样。
6xHis Tag 融合蛋白纯化说明书
Code No. Product No. supplied 17-5247-01 HisTrap HP 1 ml 5 × 1 ml 17-5247-05 HisTrap HP 1 ml 100 × 1 ml* 17-5248-01 HisTrap HP 5 ml 1 × 5 ml 17-5248-02 HisTrap HP 5 ml 5 × 5 ml 17-5248-05 HisTrap HP 5 ml 100 × 5 ml* * Pack size available by special order.Connector kitConnectors supplied Usage No. supplied 1/16” male/luer female Connection of syringe to top ofHiTrap column 1 Tubing connector Connection of tubing (e.g. Peristalticflangeless/M6 female Pump P1) to bottom of HiTrap column* 1 Tubing connector Connection of tubing (e.g. Peristalticflangeless/M6 male Pump P1) to top of HiTrap column** 1 Union 1/16” female/ Connection to original FPLC SystemM6 male through bottom of HiTrap column 1 Union M6 female/ Connection to original FPLC System1/16” male through top of HiTrap column 1 Stop plug female, 1/16” Sealing bottom of HiTrap column 2, 5 or 7 * Union 1/16” female/M6 male is also needed.** Union M6 female/1/16” male is also needed.Table of contents1. Description 32. General Considerations 63. Operation 74. Optimization 115. Stripping and recharging 126. Cleaning-in-place 137. Scaling-up 138. Storage 149. Troubleshooting 1410. Further Information 1711. Ordering Information 18p. 21. DescriptionMedium propertiesHisTrap HP 1 ml and 5 ml columns are prepacked with Ni Sepharose High Performance, which consists of 34 µm highly cross-linked agarose beads with an immobilized chelating group. The medium has then been charged with Ni2+-ions.Several amino acids, for example histidine, form complexes with many metal ions. Ni Sepharose High Performance selectively binds proteins if suitable complex-forming amino acid residues are exposed on the proteinsurface. Additional histidines, such as in the case of (histidine)6 -tag,increase affinity for Ni2+ and generally make the histidine-tagged proteinthe strongest binder among other proteins in e.g. an E. coli extract. Column propertiesHisTrap HP columns are made of biocompatible polypropylene that doesnot interact with biomolecules. Columns are delivered with a stopper on the inlet and a snap-off end on the outlet. The columns have porous top and bottom frits that allow high flow rates. They cannot be opened or refilled. Columns can be operated with either a syringe and the supplied luer adapter, a peristaltic pump, or a chromatography system such asÄKTAdesign or FPLC System.Note: To prevent leakage, ensure that the adapter is tight.p. 3Table 1. HisTrap HP characteristics.Matrix Highly cross-linked spherical agarose, 6% Average particle size 34 µmMetal ion capacity ~15 µmol Ni2+/ml mediumDynamic bindingcapacity* At least 40 mg (histidine)6-tagged protein/ml mediumColumn volumes 1 ml or 5 mlColumn dimensions i.d. × H: 0.7 × 2.5 cm (1 ml)1.6 ×2.5 cm (5 ml)Recommended flow rate 1 and 5 ml/min for 1 and 5 ml column respectively Max. flow rates 4 and 20 ml/min for 1 and 5 ml column respectively Max back pressure††0.3 MPa, 3 barCompatibility during use Stable in all commonly used buffers, reducing agents,denaturants, and detergents. See Table 2.Chemical stability§§§0.01 M HCl, 0.1 M NaOH. Tested for 1 week at 40 ºC.1 M NaOH, 70% acetic acid. Tested for 12 hours.2% SDS. Tested for 1 hour.30% 2-propanol. Tested for 30 min.Avoid in buffers Chelating agents, e.g. EDTA, EGTA, citrate (see Table 2) pH stability§§§short term (< 2 hours): 2–14long term (< 1 week): 3–12Storage 20% ethanolStorage temperature +4 to +30 ºC* Dynamic binding capacity conditions:Sample: 1 mg/ml (histidine)6-tagged pure protein (Mr28 000 or 43 000) inbinding buffer (QB, 10% determination) or (histidine)6-tagged proteinbound from E. coli extractColumn volume: 0.25 ml or 1 mlFlow rate: 0.25 ml/min or 1 ml/minBinding buffer: 20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 5 mM imidazole, pH 7.4Elution buffer: 20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 0.5 M imidazole, pH 7.4 Note: Dynamic binding capacity is protein-dependent.††H2O at room temperature§§§Ni2+-stripped mediumThe Ni2+-charged medium is compatible with all commonly used aqueous buffers, reducing agents, denaturants such as 6 M Gua-HCl and 8 M urea, and a range of other additives (see Table 2).p. 4Table 2. Ni Sepharose High Performance is compatible with the following compounds, at least at the concentrations given.Reducing agents* 5 mM DTE5 mM DTT20 mM ß-mercaptoethanol5 mM TCEP10 mM reduced glutathioneDenaturing agents 8 M urea††6 M guanidine hydrochloride††Detergents 2% Triton X-100 (nonionic)2% Tween 20 (nonionic)2% NP-40 (nonionic)2% cholate (anionic)1% CHAPS (zwitterionic)Other additives 500 mM imidazole20% ethanol50% glycerol100 mM Na2SO41.5 M NaCl1 mM EDTA§§§60 mM citrate§§§Buffer substances 50 mM sodium phosphate, pH 7.4100 mM Tris-HCl, pH 7.4100 mM Tris-acetate, pH 7.4100 mM HEPES, pH 7.4100 mM MOPS, pH 7.4100 mM sodium acetate, pH 4††* See Notes and blank run, p. 10–11.††Tested for 1 week at +40 °C.§§§The strong chelator EDTA has been used successfully in some cases, at 1 mM.Generally, chelating agents should be used with caution (and only in the sample,not the buffers). Any metal-ion stripping may be counteracted by addition of a smallexcess of MgCl2 before centrifugation/filtration of the sample. Note that stripping effectsmay vary with applied sample volume.p. 52. General considerationsHisTrap HP is supplied precharged with Ni2+ ions. In general, Ni2+ is thepreferred metal ion for purification of recombinant histidine-taggedproteins. Note, however, that in some cases it may be wise to test othermetal ions, e.g. Zn2+ and Co2+, as the strength of binding depends onthe nature of the histidine-tagged protein as well as the metal ion (seeOptimization).We recommend binding at neutral to slightly alkaline pH (pH 7–8) in thepresence of 0.5–1.0 M NaCl. Sodium phosphate buffers are often used.Tris-HCl can generally be used, but should be avoided in cases where the metal-protein affinity is very weak, since it may reduce binding strength.Avoid chelating agents such as EDTA or citrate in buffers, see Table 2.Including salt e.g. 0.5–1.0 M NaCl in the buffers and samples, eliminatesion-exchange effects but can also have a marginal effect on the retention of proteins.Imidazole at low concentrations is commonly used in the binding and the wash buffers to minimize binding of host cell proteins. For the same reason, it is important to also include imidazole in the sample (generally, at the same concentration as in the wash buffer). At somewhat higher concentrations, imidazole may also decrease the binding of histidine-tagged proteins. The imidazole concentration must therefore be optimized to ensure the best balance of high purity (low binding of host cell proteins) and high yield(binding of histidine-tagged target protein). This optimal concentration is different for different histidine-tagged proteins, and is usually slightly higher for Ni Sepharose High Performance than for similar IMAC media on themarket (see Data File 18-1174-40). Use highly pure imidazole; such imidazole gives essentially no absorbance at 280 nm.As alternatives to imidazole elution, histidine-tagged proteins can be eluted from the medium by several other methods or combinations of methods – a lowering of pH within the range of 2.5–7.5 can be used, for example. At pH values below 4, metal ions will be stripped off the medium.Note:If the proteins are sensitive to low pH, we recommend collection of the eluted fractions in tubes containing 1 M Tris-HCl, pH 9.0(60–200 µl/ml fraction) to restore the pH to neutral.p. 6Chelating agents such as EGTA or EDTA will also strip metal ions from the medium and thereby cause protein elution, but the target protein pool will then contain Ni2+ ions. In this case, Ni2+ ions can be removed by desalting ona HiTrap™ Desalting, a PD-10 Desalting Column, or HiPrep™ 26/10 Desalting, (see Table 4).Leakage of Ni2+ from Ni Sepharose High Performance is very low underall normal conditions, lower than for other IMAC media tested. For applications where extremely low leakage during purification is critical, leakage can be even further reduced by performing a blank run (see page 11).Likewise, a blank run should also be performed before applying buffers/ samples containing reducing agents (see page 11).Whatever conditions are chosen, HisTrap HP columns can be operated witha syringe, peristaltic pump, or chromatography system.Note:If Peristaltic Pump P-1 is used, the maximum flow rate that can be run on a HisTrap HP 1 ml column is 3 ml/min.3. OperationBuffer preparationWater and chemicals used for buffer preparation should be of high purity. Filter buffers through a 0.22 µm or a 0.45 µm filter before use.Use high purity imidazole as this will give very low or no absorbance at 280 nm.If the recombinant histidine-tagged protein is expressed as inclusion bodies, include 6 M Gua-HCl or 8 M urea in all buffers and sample. On-column refolding of the denatured protein may be possible.p. 7Recommended conditionsBinding buffer: 20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 20–40 mMimidazole, pH 7.4 (The optimal imidazoleconcentration is protein-dependent; 20–40 mM issuitable for many proteins.)Elution buffer: 20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 500 mMimidazole, pH 7.4 (The imidazole concentrationrequired for elution is protein-dependent). Sample preparationFor optimal growth, induction, and cell lysis conditions for your recombinant histidine-tagged clones, please refer to established protocols.Adjust the sample to the composition and pH of the binding bufferby: Adding buffer, NaCl, imidazole, and additives from concentratedstock solutions; by diluting the sample with binding buffer; or by bufferexchange, (see Table 4). Do not use strong bases or acids for pH-adjustment (precipitation risk). Filter the sample through a 0.22 µm or a 0.45 µm filter and/or centrifuge it immediately before applying it to the column.To prevent the binding of host cell proteins with exposed histidine, it isessential to include imidazole at a low concentration in the sample andbinding buffer (see Optimization).p. 8p. 9T a b l e 4. P r e p a c k e d c o l u m n s f o r d e s a l t i n g a n d b u f f e r e x c h a n g e .C o d e N o C o l u m nL o a d i n g v o l u m e E l u t i o n v o l u m e C o m m e n t sA p p l i c a t i o n17-1408-01 H i T r a p 0.1–1.5 m l 1.3–4.0 m l P r e p a c k e d w i t h F o r d e s a l t i n g a n d b u f f e r D e s a l t i n g S e p h a d e x ™ G -25 e x c h a n g e o f p r o t e i n S u p e r f i n e . R e q u i r e s e x t r a c t s (M r >5000). a s y r i n g e o r p u m p t o r u n . 17-5087-01 H i P r e p U p t o 15–20 m l P r e p a c k e d w i t h F o r d e s a l t i n g a n d 26/10 15 m l S e p h a d e x G -25 b u f f e r e x c h a n g e o f D e s a l t i n g F i n e . R e q u i r e s a p r o t e i n e x t r a c t s p u m p t o r u n . (M r >5000).17-0851-01 P D -10 2.5 m l 3.5 m l P r e p a c k e d w i t h F o r d e s a l t i n g a n d D e s a l t i n g S e p h a d e x G -25. b u f f e r e x c h a n g e R e q u i r e s o n l y o f p r o t e i n e x t r a c t s g r a v i t y t o r u n . (M r >5000).17-0855-01 N I C K ™ 0.1 m l 0.4 m l P r e p a c k e d w i t h F o r s e p a r a t i o n o f S e p h a d e x G -25. p r o t e i n s (M r >5000) a n d n i c k t r a n s l a t e d D N A f r o m r a d i o l a b e l l e d n u c l e o t i d e s n o t s h o r t e r t h a n 120 m e r s , a n d s i m i l a r s e p a r a t i o n s .17-0853-01 N A P ™-5 0.5 m l 1.0 m l P r e p a c k e d w i t h F o r p u r i f i c a t i o n o f 17-0854-01 N A P -10 1.0 m l 1.5 m l S e p h a d e x G -25 p r o t e i n s (M r >5000),17-0852-01 N A P -25 2.5 m l 3.5 m l D N A g r a d e . D N A a n d o l i g o - R e q u i r e s o n l y n u c l e o t i d e s g r e a t e rg r a v i t y t o r u n . t h a n 10 b a s e s i n l e n g t h .Purification1. Fill the syringe or pump tubing with distilled water. Remove the stopperand connect the column to the syringe (use the adapter provided),laboratory pump or chromatography system tubing “drop-to-drop” toavoid introducing air into the system.2. Remove the snap-off end at the column outlet.3. Wash the column with 3–5 column volumes of distilled water.4. Equilibrate the column with at least 5 column volumes of binding buffer.Recommended flow rates are 1 ml/min or 5 ml/min for the 1 and 5 mlcolumns respectively.In some cases a blank run is recommended before final equilibration/sample application (see page 11).5. Apply the pretreated sample using a syringe or a pump.6. Wash with binding buffer until the absorbance reaches a steadybaseline (generally, at least 10–15 column volumes).Note:Purification results are improved by using imidazole in sample and binding buffer (see Optimization).7. Elute with elution buffer using a one-step or linear gradient.Five column volumes are usually sufficient if the protein of interest iseluted by a one-step gradient. A shallow gradient, e.g. a linear gradient over 20 column volumes or more, may separate proteins with similarbinding strengths.Note:If imidazole needs to be removed from the protein, use HiTrap Desalting, a PD-10 Desalting Column, or HiPrep 26/10 Desaltingdepending on the sample volume (see Table 4).Note:Ni Sepharose High Performance is compatible with reducing agents.However, removal of any weakly bound Ni2+ ions by performing ablank run without reducing agents (as described on page 11) beforeapplying buffer/sample including reducing agents is recommended.Do not leave HisTrap HP columns with buffers including reducingagents when not in use.p. 10Note:Leakage of Ni2+ from Ni Sepharose High Performance is low under all normal conditions. The leakage is lower than for other IMAC mediatested (see Data File Ni Sepharose High Performance, 18-1174-40).For very critical applications, leakage during purification can be even further diminished by performing a blank run (as described below)before loading sample.Blank run:Use binding buffer and elution buffer without reducing agents.1. Wash the column with 5 column volumes of distilled water (to removethe 20% ethanol).2. Wash with 5 column volumes of elution buffer.3. Equilibrate with 10 column volumes of binding buffer.4. OptimizationImidazole at low concentrations is commonly used in the binding and the wash buffers to minimize binding of host cell proteins. For the same reason, it is important to also include imidazole in the sample (generally, at the same concentration as in the wash buffer). At somewhat higher concentrations, imidazole may also decrease the binding of histidine-tagged proteins. The imidazole concentration must therefore be optimized to ensure the best balance of high purity (low binding of host cell proteins), and high yield (binding of histidine-tagged target protein). This optimal concentration is different for different histidine-tagged proteins, and is usually slightly higher for Ni Sepharose High Performance than for similar IMAC media on the market (see Data File Ni Sepharose High Performance, 18-1174-40). Finding the optimal imidazole concentration for a specific histidine-tagged protein is a trial-and-error effort, but 20–40 mM in the binding and wash buffers is a good starting point for many proteins. Use a high purity imidazole, such imidazole gives essentially no absorbance at 280 nm.Ni2+ is usually the first choice metal ion for purifying most (histidine)6-taggedrecombinant proteins from nontagged host cell proteins, and also the ion most generally used. Nevertheless, it is not always possible to predict whichp. 11metal ion will be best for a given protein. The strength of binding between a protein and a metal ion is affected by several factors, including the length, position, and exposure of the affinity tag on the protein, the type of ion used, and the pH of buffers, so some proteins may be easier to purify with ions other than Ni2+.A quick and efficient way to test this possibility and optimize separation conditions is to use HiTrap IMAC HP 1 ml columns, which are packed with IMAC Sepharose High Performance (not charged with metal ions). Each column can be charged with different metal ions, e.g. Cu2+, Co2+, Zn2+, Ca2+, or Fe2+. Instructions are included with each column.A study to compare the purification of six (histidine)6-tagged recombinantproteins, including three variants of maltose-binding protein, with different metal ions has indicated that Ni2+ generally gives best selectivity between (histidine)-tagged and nontagged host-cell proteins (see Application Note 18-1145-18).5. Stripping and rechargingNote:The column does not have to be stripped and recharged between each purification if the same protein is going to be purified; it issufficient to strip and recharge it after 5–7 purifications, dependingon the cell extract, extract volume, target protein, etc. Recommended stripping buffer: 20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl,50 mM EDTA, pH 7.4Strip the column by washing with at least 5–10 column volumes of stripping buffer. Wash with at least 5–10 column volumes of binding buffer and 5–10 column volumes of distilled water before recharging the column. Recharge the water-washed column by loading 0.5 ml or 2.5 ml of 0.1 MNiSO4 in distilled water on HisTrap HP 1 ml and5 ml column, respectively.Salts of other metals, chlorides, or sulfates, may also be used (seeOptimization). Wash with 5 column volumes distilled water, and 5 column volumes binding buffer (to adjust pH) before storage in 20% ethanol.p. 126. Cleaning-in-placeWhen an increase in back-pressure is seen, the column can be cleaned. Before cleaning, strip off Ni2+ ions using the recommended procedure described above.After cleaning, store in 20% ethanol (wash with 5 column volumes) or recharge with Ni2+ prior to storage in ethanol.The Ni2+-stripped column can be cleaned by the following methods;• Remove ionically bound proteins by washing the column with several column volumes of 1.5 M NaCl; then wash the column with approx. 10column volumes of distilled water.• Remove precipitated proteins, hydrophobically bound proteins, and lipoproteins by washing the column with 1 M NaOH, contact time usually 1–2 hours (12 hours or more for endotoxin removal). Then wash thecolumn with approx. 10 column volumes of binding buffer, followed by5–10 column volumes of distilled water.• Remove hydrophobically bound proteins, lipoproteins, and lipids by washing the column with 5–10 column volumes 30% isopropanol forabout 15–20 minutes. Then wash the column with approx. 10 columnvolumes of distilled water.Alternatively, wash the column with 2 column volumes of detergent in a basic or acidic solution. Use, for example, 0.1–0.5% nonionic detergentin 0.1 M acetic acid, contact time 1–2 hours. After treatment, alwaysremove residual detergent by washing with at least 5 column volumes of 70% ethanol. Then wash the column with approx. 10 column volumes of distilled water.7. Scaling-upTwo or three HisTrap HP 1 ml or 5 ml columns can be connected in series for quick scale-up (note that back-pressure will increase).Ni Sepharose High Performance, the medium prepacked in HisTrap HP columns, is supplied preswollen in 25 and 100 ml lab packs (see ordering information). An alternative scale-up strategy is thus to pack the medium in empty columns – Tricorn™ and XK columns are suitable for this purpose.p. 138. StorageStore HisTrap HP columns in 20% ethanol at +4 to +30 °C.9. TroubleshootingThe following tips may be of assistance. If you have any further questions about your HisTrap HP column, please visit/hitrap, contact our technical support, or your local representative.Note:When using high concentrations of urea or Gua-HCl, protein unfolding generally takes place. Refolding on-column (or afterelution) is protein-dependent.Tips:To minimize dilution of the sample, solid urea or Gua-HCl can be added.Tips:Samples containing urea can be analyzed directly by SDS-PAGE whereas samples containing Gua-HCl must be buffer-exchanged toa buffer with urea before SDS-PAGE.Column has clogged:• Cell debris in the sample may clog the column. Clean the column according to the section Cleaning-in-place.• It is important to centrifuge and/or filter the sample through a 0.22 µm or a 0.45 µm filter, see Sample preparation.Sample is too viscous:• If the lysate is very viscous due to a high concentration of host nucleic acid, continue sonication until the viscosity is reduced, and/or addDNase I to 5 µg/ml, Mg2+ to 1 mM, and incubate on ice for 10–15 min.Alternatively, draw the lysate through a syringe needle several times. p. 14Protein is difficult to dissolve or precipitates during purification:• The following additives may be used: 2% Triton™ X-100, 2% Tween™20, 2% NP-40, 2% cholate, 1% CHAPS, 1.5 M NaCl, 50% glycerol, 20 mMß-mercaptoethanol, 1–3 mM DTT or DTE (up to 5 mM is possible butdepends on the sample and the sample volume), 5 mM TCEP, 10 mMreduced glutathione, 8 M urea, or 6 M Gua-HCl. Mix gently for 30 min toaid solubilization of the tagged protein (inclusion bodies may requirelonger mixing). Note that Triton X-100 and NP-40 (but not Tween) have a high absorbance at 280 nm. Furthermore, detergents cannot be easilyremoved by buffer exchange.No histidine-tagged protein in the purified fractions:• Elution conditions are too mild (histidine-tagged protein still bound): Elute with an increasing imidazole gradient or decreasing pH todetermine the optimal elution conditions.• Protein has precipitated in the column: For the next experiment, decrease amount of sample, or decrease protein concentration byeluting with linear imidazole gradient instead of imidazole steps. Trydetergents or changed NaCl concentration, or elute under denaturing(unfolding) conditions (add 4–8 M urea or 4–6 M Gua-HCl).• Nonspecific hydrophobic or other interaction: Add a nonionic detergent to the elution buffer (e.g. 0.2% Triton X-100) or increase theNaCl concentration.• Concentration of imidazole in the sample and/or binding buffer is too high: The protein is found in the flow-through material. Decrease theimidazole concentration.• Histidine-tag may be insufficiently exposed: The protein is found in the flowthrough material; perform purification of unfolded protein in urea or Gua-HCl as for inclusion bodies.• Buffer/sample composition is incorrect: The protein is found in the flowthrough material. Check pH and composition of sample and binding buffer. Ensure that chelating or strong reducing agents are not presentin the sample at too high concentration, and that the concentration ofimidazole is not too high.p. 15SDS-PAGE of samples collected during the preparation of the bacterial lysate may indicate that most of histidine-tagged protein is located in the centrifugation pellet. Possible causes and solutions are:• Sonication may be insufficient: Cell disruption may be checked by microscopic examination or monitored by measuring the release ofnucleic acids at A260. Addition of lysozyme (up to 0.1 volume of a 10 mg/mllysozyme solution in 25 mM Tris-HCl, pH 8.0) prior to sonication mayimprove results. Avoid frothing and overheating as this may denaturethe target protein. Over-sonication can also lead to copurification of host proteins with the target protein.• The protein may be insoluble (inclusion bodies): The protein can usually be solubilized (and unfolded) from inclusion bodies usingcommon denaturants such as 4–6 M Gua-HCl, 4–8 M urea, or strongdetergents.Prepare buffers containing 20 mM sodium phosphate, 8 M urea,or 6 M Gua-HCl, and suitable imidazole concentrations, pH 7.4–7.6.Buffers with urea should also include 500 mM NaCl. Use these buffersfor sample preparation, as binding buffer and as elution buffer. Forsample preparation and binding buffer, use 10–20 mM imidazole or theconcentration selected during optimization trials (including urea or Gua-HCl).The protein is collected but is not pure (multiple bands on SDS polyacrylamide gel):• Partial degradation of tagged protein by proteases: Add protease inhibitors (use EDTA with caution, see Table 2).• Contaminants have high affinity for nickel ions: Elute with a stepwise or linear imidazole gradient to determine optimal imidazoleconcentrations to use for binding and for wash; add imidazole to thesample in the same concentration as the binding buffer. Wash beforeelution with binding buffer containing as high concentration of imidazole as possible, without causing elution of the tagged protein. A shallowimidazole gradient (20 column volumes or more), may separate proteins with similar binding strengths. If optimized conditions do not removecontaminants, further purification by ion exchange chromotographyp. 16(HiTrap Q HP or HiTrap SP HP) and/or gel filtration (Superdex™ Peptide,Superdex 75 or Superdex 200) may be necessary.• Contaminants are associated with tagged proteins: Add detergent and/or reducing agents before sonicating cells. Increase detergent levels(e.g. up to 2% Triton X-100 or 2% Tween 20), or add glycerol (up to 50%)to the wash buffer to disrupt nonspecific interactions.Histidine-tagged protein is eluted during sample loading/wash:• Buffer/sample composition is incorrect: Check pH and composition of sample and binding buffer. Ensure that chelating or strong reducingagents are not present in the sample at a too high concentration, andthat the concentration of imidazole is not too high.• Histidine-tag is partially obstructed: Purify under denaturing conditions (use 4–8 M urea or 4–6 M Gua-HCl).• Column capacity is exceeded: Join two or three HisTrap HP 1 ml columns together or change to a HisTrap HP 5 ml column.10. Further informationVisit /hitrap for further information. Several handbooks also contain useful information, see ordering information.p. 1711. Ordering InformationProduct No. supplied Code No.HisTrap HP 5 × 1 ml 17-5247-01 HisTrap HP 100 × 1 ml * 17-5247-05 HisTrap HP 1 × 5 ml 17-5248-01 HisTrap HP 5 × 5 ml 17-5248-02 HisTrap HP 100 × 5 ml * 17-5248-05 Related products No. supplied Code No.Ni Sepharose High Performance 25 ml 17-5268-01 Ni Sepharose High Performance 100 ml 17-5268-02 HiTrap Desalting 5 × 5 ml 17-1408-01 HiTrap Desalting 100 × 5 ml * 11-0003-29 PD-10 Desalting Column 30 17-0851-01 HiPrep 26/10 Desalting 1 × 53 ml 17-5087-01 HiPrep 26/10 Desalting 4 × 53 ml 17-5087-02 HisTrap FF 5 × 1 ml 17-5319-01 HisTrap FF 100 × 1 ml * 17-5319-02 HisTrap FF 5 × 5 ml 17-5255-01 HisTrap FF 100 × 5 ml * 17-5255-02 HisTrap FF crude 5 × 1 ml 11-0004-58 HisTrap FF crude 100 × 1 ml * 11-0004-59 HisTrap FF crude 5 × 5 ml 17-5286-01 HisTrap FF crude 100 × 5 ml * 17-5286-02 HisTrap FF crude Kit 1 kit 28-4014-77 HisPrep™ FF 16/10 1 × 20 ml 17-5256-01 * Pack size available by special order.p. 18。
P2226 His标签蛋白纯化试剂盒
His标签蛋白纯化试剂盒产品简介：碧云天生产的His标签蛋白纯化试剂盒(His-tag Protein Purification Kit)，俗称镍柱试剂盒，是一种采用了新型的BeyoGold TM His-tag Purification Resin的可以兼容还原剂和螯合剂，并能简单、快速、高效并且高特异性地纯化His标签蛋白的试剂盒。
试剂盒提供了His标签蛋白所需的相关试剂和亲和层析空柱管，为His标签蛋白的纯化带来了极大的便利。
通常带有6个组氨酸标签的重组蛋白(6xHis-tagged recombinant protein)或带有6个以上连续组氨酸标签的重组蛋白，被称为His 标签蛋白。
蛋白样品溶液通过BeyoGold TM His-tag Purification Resin时，重组蛋白His标签上的组氨酸残基能特异性地结合到BeyoGold TM His-tag Purification Resin中的镍离子上，其它蛋白则不能被结合。
洗涤后，His标签重组蛋白可在非变性条件下被洗脱，从而被分离纯化。
BeyoGold TM His-tag Purification Resin对His标签重组蛋白的亲和力强、选择性高、结合容量大，可以获得高纯度的His标签重组蛋白，可用于简单、快速、高效地纯化细菌、哺乳动物细胞、昆虫及杆状病毒等多种表达系统中表达的His标签重组蛋白。
纯化的蛋白可以用于结构和功能研究、抗体制备、蛋白与蛋白相互作用、蛋白与核酸相互作用等方面的研究。
BeyoGold TM His-tag Purification Resin采用了一种高度交联的6%琼脂糖凝胶(Sepharose CL-6B)为基质，并使用了进一步优化的接臂和镍离子螯合技术，和目前市售的大多数Ni-NTA agarose或类似产品相比，非特异性蛋白结合显著降低，耐受压力强，镍离子螯合非常稳定。
和同类产品相比，本产品由于镍离子基本不会流失，重复使用本纯化介质时不需要重新装载镍离子。
FLAG标签融合蛋白纯化试剂盒使用说明书
FLAG标签（DYKDDDDK）融合蛋白纯化试剂盒Cat#：KAP0064（本品仅用于科学研究，不可用于诊断及治疗）1.背景信息Flag-Tag（DYKDDDDK），常用于真核蛋白质重组表达标记。
FLAG标签（DYKDDDDK）融合蛋白纯化试剂盒，主要成分是Anti-Flag亲和纯化凝胶（Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel），由高品质的Flag兔多克隆抗体与Sepharose 4B琼脂糖颗粒共价偶联制成，具有高载量（至少为1.2mg protein/ml凝胶），高特异性，性质稳定，可反复使用的特点，可用于Flag 标签融合蛋白的亲和纯化。
2.性能指标应用范围：可用于Met修饰的N端Flag融合蛋白（Met-Flag–Protein），N端Flag融合蛋白（Flag–Protein）和C端Flag融合蛋白（Protein-Flag）的亲和纯化。
载量：1ml Sepharose 4B琼脂糖颗粒，共价偶联800μg Anti-Flag 兔多克隆抗体，可纯化至少1.2mg Flag融合蛋白。
强度：重力柱纯化，可反复使用5次以上。
保存方法：在加入了50%甘油和0.2‰叠氮钠的PBS保存液后，预装纯化柱可于-20℃可保存1年。
3.试剂盒组成50 mM Tris HCl, pH 7.4, 150 mMNaCl, 1 mM EDTA, and 1%Triton X-100（说明见5.3）4.使用方法4.1细胞裂解液制备4.1.1悬浮细胞和半贴壁细胞从细胞培养瓶上吹下来后放入离心管中，1000rpm离心5分钟。
贴壁细胞用细胞刮子轻轻从瓶壁上刮下来，放入离心管中1000rpm离心5分钟。
4.1.2预冷的PBS工作液重悬细胞，1000rpm离心3min，弃上清。
重复一次。
4.1.3根据细胞的量加入相应体积的细胞裂解液，反复吹打后冰上放置10-20min，让细胞充分裂解。
4.1.4用超声破碎仪将细胞裂解液超声，直至细胞裂解液透明，不再粘稠。
融合蛋白标签与纯化
蛋白标签蛋白标签蛋白标签（proteintag）是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。
随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。
目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。
美国GeneCopoeia（复能基因）为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等；也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。
以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询克隆产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。
标签纯化促进溶解度抗体效价细胞标记His6 + +/- +/-Flag + +/- +GST + + +MBP + ++ +His-MBP ++ + +HA +eGFP/CFP/YFP +++Myc +His-Myc + +His-AviTag? ++ ++ ++Sumo +++ +His-Sumo ++ ++ +SNAP-Tag? ++ + +++Halo Tag? ++ + +++TrxHISHis6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。
当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征（结合配体）利于纯化。
组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。
使用His-tag有下面优点：∙标签的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能；∙His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性；∙His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究；∙His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。
融合蛋白纯化实验报告
1. 学习并掌握融合蛋白的纯化方法；2. 掌握金属螯合亲和层析技术；3. 提高蛋白质分离纯化操作技能。
二、实验原理融合蛋白是指将目的蛋白与另一个蛋白（如载体蛋白、酶等）通过化学键连接在一起形成的蛋白质。
融合蛋白的纯化可以通过多种方法实现，其中金属螯合亲和层析是一种常用的纯化技术。
该方法利用目的蛋白与载体蛋白之间特定的相互作用，将目的蛋白从混合物中分离出来。
三、实验材料1. 融合蛋白样品；2. 金属螯合亲和层析柱；3. 亲和层析介质（如Ni-NTA）；4. 洗脱缓冲液；5. 蛋白质检测试剂；6. 离心机；7. 其他实验试剂。
四、实验步骤1. 准备亲和层析柱：将亲和层析介质加入层析柱中，用洗脱缓冲液平衡层析柱。
2. 样品上柱：将融合蛋白样品加至层析柱中，让其自然流出。
3. 洗脱：用洗脱缓冲液冲洗层析柱，收集洗脱液。
4. 收集目标蛋白：将收集到的洗脱液进行蛋白质检测，确定目标蛋白的存在。
5. 离心分离：将收集到的目标蛋白样品进行离心，分离出纯化的融合蛋白。
6. 蛋白质检测：对纯化的融合蛋白进行SDS-PAGE、Western blot等检测，验证纯化效果。
1. 亲和层析柱平衡后，样品顺利上柱，洗脱过程中目标蛋白得以分离。
2. 蛋白质检测结果显示，纯化的融合蛋白在预期位置出现条带，证明纯化效果良好。
3. SDS-PAGE结果显示，纯化的融合蛋白纯度较高，未发现其他杂蛋白。
4. Western blot结果显示，纯化的融合蛋白与特异性抗体结合良好，进一步证明纯化效果。
六、实验讨论1. 在实验过程中，应注意控制层析柱的流速，避免样品过快通过层析柱，导致目标蛋白丢失。
2. 亲和层析介质的装载量对纯化效果有较大影响，需根据实验需求调整。
3. 洗脱缓冲液的pH、离子强度等参数对目标蛋白的洗脱效果有较大影响，需根据实验需求优化。
4. 实验过程中，应注意蛋白质的稳定性，避免蛋白质降解。
七、实验结论本实验成功纯化了融合蛋白，验证了金属螯合亲和层析技术在融合蛋白纯化中的应用。
6X组氨酸标记(His-tag)蛋白纯化试剂盒产品说明书(中文
1． 本产品为 5 次操作 2． 操作时，须戴手套 3． 整个操作在 4℃温度下进行 4． 如果用户需要获得变性标记蛋白，建议使用变性液（Reagent D），整个操作在室温下进行 5． 用户扩增的细菌可溶性总蛋白样品须完全可溶状态，否则影响蛋白的结合（例如包涵体）；建议使用
不溶性融合蛋白溶解试剂盒（ 30016 ）帮在纯化前，须进行目标蛋白鉴定试验，例如 IPTG 测试；建议使用
2
白浓度 14．本公司提供系列融合蛋白处理试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能长期稳定 2． 本产品经鉴定结合效果满意
HIS 标记蛋白扩增试剂盒（ ＨＬ30018.1 ） 7． 用户扩增的细菌可溶性总蛋白样品避免含有二硫苏糖醇（DTT）、巯基乙醇（BME）、EDTA、EGTA 等
化学成分 8． 亲和液（Reagent B）建议保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融，建议分装 9． 亲和液（Reagent B）每次使用 1 毫升，可结合 5 至 10 毫克目标蛋白，回收率高达 95％。
产品内容
平衡液（Reagent A） 亲和液（Reagent B） 洗脱液（Reagent C） 产品说明书
XX 毫升 XX 毫升 XX 毫升 1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里；有效保证 6 月
用户自备
变性液（Reagent D）：用于变性融合蛋白纯化 透析液（Reagent E）：用于蛋白纯化后透析 细菌可溶性总蛋白样品：用于纯化的待测样品 1.5 毫升离心管：用于反应操作的容器 50 毫升锥形离心管：用于胶体溶液配制的容器 平式摇荡仪：用于混匀反应物 4℃台式离心机：用于沉淀反应物 4℃微型台式离心机：用于沉淀反应物
6 X 组氨酸标记（His-tag）蛋白纯化试剂盒产品说明书（中文版）
HisTag_融合蛋白纯化(默克新版)
默克生命科学服务热线：400 820 8872 bioteam@
高纯度包涵体的制备 以下操作可用于任何 BugBuster®系列产品抽提的包涵体纯化。 1. 如可溶蛋白抽提步骤1-4进行操作。 2. 将步骤“4”所得到的沉淀重悬于BugBuster（货号70584），BugBuster的量与当初重悬细胞糊的体积相同。
默克生命科学服务热线：400 820 8872 bioteam@
一、亲和纯化样品的前处理
1. 菌液体积-起始目的蛋白量
纯化条件的优化需考虑多个因素，包括 His·Tag 融合蛋白表达水平和上样量。若目的蛋白未能高效表达，需要采 用一个较高的浓缩系数（concentration factor）进行菌的裂解，即在较大培养体系中，按一定比例加入一定体积 的裂解/结合缓冲液。浓缩系数定义为菌液体积与裂解/结合缓冲液体积之比。不同目的蛋白表达水平推荐使用的 裂解/结合缓冲液体积、对应的浓缩系数大小，请参考表 1。 例如，某蛋白表达水平约为 0.1mg/ml，需要在变性条件下进行小批提纯，则 100ml 的培养物离心获得的菌体， 按浓缩 100 倍比例重悬于含变性剂的 1ml 裂解/结合缓冲液中。 在非变性条件下进行纯化时，要准确预计裂解液中可溶蛋白的含量比较困难，一般建议采用 50-100 倍浓缩。
产品使用说明书
His·Tag 融合蛋白纯化操作手册
采用 pET 系统进行原核蛋白表达，蛋白的表达量达到 20mg/100ml 培养物并不是困难的事。 在大肠杆菌中表达的目的蛋白，其可溶性（可溶蛋白或包涵体）、细胞定位（细胞质、细胞周 质、培养基上清），都会对后续的纯化策略造成影响。我们建议研究者在蛋白表达后，首先进 行目的蛋白的细胞定位（请参考 pET 系统操作手册）；在进行大量纯化之前，小量纯化蛋 白，摸索确定适合于具体蛋白的纯化条件，也是值得推荐的好方法。外源蛋白在大肠杆菌中表 达，可能以可溶形式存在，也可能以包涵体形式存在。尤其在高水平表达的条件下，更容易形 成包涵体。包涵体的形成与外源蛋白本身性质、载体、宿主菌、以及表达水平都有关系，可以 通过选择不同表达载体和 E.coli 宿主菌组合，摸索生长条件和适宜诱导条件，达到优化蛋白表 达的目的。His·Tag®融合蛋白，可以在天然条件或变性条件下用 NTA His·Bind 树脂或 IDA His·Bind 树脂进行纯化。
蛋白纯化试剂的原理及蛋白纯化实验问题分析
蛋白纯化试剂的原理及蛋白纯化实验问题分析蛋白纯化试剂盒主要是利用蛋白与亲和介质的亲和能力不同达到蛋白分离纯化的目的。
蛋白纯化试剂常见的蛋白标签有GST标签、HIS 标签等，本文主要介绍了蛋白纯化试剂盒的原理、His Tag 蛋白纯化方法试剂选择的方法、GST 标签融合蛋白纯化问题分析等。
蛋白抽提试剂盒和蛋白纯化试剂盒用途有什么不同?蛋白抽提试剂盒是从细菌、真菌、新鲜动植物组织或细胞蛋白、培养动植物组织将全细胞蛋白、核蛋白、胞浆蛋白、带化学修饰基团的天然蛋白(例如磷酸化蛋白)中的一种或两种以上作为目标从样品中分离收集的一套试剂。
用于液体样品中蛋白浓缩、提取、或脱盐、脱去垢剂、脱还原剂等目的。
蛋白纯化试剂盒用于将连接有Flag标签GST HIS 标签的重组蛋白、包涵体蛋白、抗体从重组蛋白表达系统中高效浓缩分离出来。
主要原理是利用蛋白A或蛋白G与抗体的不变区有多个结合位点或Ni- Sepharose与HIS标签蛋白在不同缓冲液条件下亲和能力多得多差异分离目标蛋白。
将蛋白A与Sepharose共价交联制备的层析介质，可以用于纯化抗体。
抗体与蛋白A或蛋白G在高盐高pH值条件下结合，在低盐低pH值条件下解离。
蛋白纯化试剂盒广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。
GST常见问题解答集锦纯化方法的问题解决以下解决问题的指南指出了对于大多数纯化方法的普遍问题,对于特别的纯化方法的问题也有提及,这种情况下会指出相应的纯化方法.问题可能原因解决方法G S T 标签蛋白GST标签蛋白被机械裂解的方法在裂解过程中,用温和的机械/化学裂解条件.裂解的条件不结合柱子或变性(比如超声).过分的裂解必须依照经验来决定. 结合非常弱会使标签蛋白变性,阻止其结合. GST标签蛋白在样品中有聚集, 在细胞裂解前加入DTT,在缓冲液中也加入DTT.1-20mM 导致沉淀标签蛋白的浓度过低的DTT会显著增加某些GST蛋白的结合. 浓缩样品.结合能力是浓度依赖的.低表达量的蛋白可能不会像高表达量蛋白那样有效地结合柱子.因此,浓缩样品会提高结合. 标签蛋白可能改变了G S T 的构检测所使用的pGEX载体中GST的结合.准备带有所使用的象,因此降低了GST标签蛋白的pGEX的细胞超声裂解物,检测其与柱材的结合.如果结合结合能力. 的很好,则可能是标签蛋白改变了GST的构象,因此降低了GST标签蛋白的亲和力.可以通过降低结合的温度到4°C限制洗涤来改善结果. 平衡时间太短确认柱材至少用5倍柱体积的pH6.5到8.0的缓冲液平衡过(比如PBS). GST标签蛋白在pH值低于6.5和高在净化好的样品上样前用pH6.5到8.0的缓冲液平衡过(比如于8时结合效率低GSTrap柱:柱子需要清洗PBS). 根据标准的清洗步骤清洗柱子(见附录2).如果GSTrap柱已经用过几次了,可能需要换用新柱. Glutathione Sepharose柱材使用使用新的Glutathione Sepharose柱材(清洗过程请见附录次数过多样品上样过程中的流速过高2) 降低在上样时的流速.影响GST标签蛋白结合的一个重要参数就是流速.由于GST与谷胱甘肽相对慢的结合,在样品上样过程中保持低流速以获得最大结合能力很重要. 在KTAprime plus上的GSTrap 柱子堵住了:根据说明书清洁柱子,确认样品已经离心或柱:柱子或系统被堵住了,导致用0.45m的滤膜过滤过了. 高压力和无结合. 系统堵住了:将柱子换成一段管子.如果压力高于0.3MPa,根据手册清洗系统在KTAprime plus上的GSTrap 检测是否使用了正确的柱子. 柱:样品不结合检测流入管是否接入了正确的流入端口. 检测缓冲液的组成和pH值是否正确.检测样品是否已经被调节到适合结合缓冲液的条件.1G S T 标签蛋白洗脱缓冲液的体积不够不能被高效的洗脱洗脱的时间不够增加洗脱缓冲液的体积.有些情况下,尤其是柱上酶切有标签蛋白时,需要更大体积的缓冲液来洗脱标签蛋白. 通过降低洗脱过程中的流速来增加洗脱时间. 对于GSTrap柱,为了获得最好的结果,在样品上样时,用0.2到1ml/min的流速(1ml HiTrap柱),0.5到5ml/min的流速(5ml HiTrap柱).对于离心方法,降低洗脱过程中的离心速度.谷胱甘肽的浓度不够增加洗脱缓冲液中谷胱甘肽的浓度:本方案中建议的10mM 浓度对于大多数应用来说足够了,但是也存在例外.尝试使用50mM Tris-HCl,20-40mM 还原型谷胱甘肽,pH8.0作为洗脱缓冲液.洗脱缓冲液的pH过低增加洗脱缓冲液的pH值:将pH增加到8-9会增强洗脱而不用提高洗脱所用谷胱甘肽的浓度.洗脱缓冲液的离子强度过低.增加洗脱缓冲液中的离子强度,在洗脱缓冲液中加入0.10.2M的氯化钠也会使结果变好.洗脱缓冲也中的谷胱甘肽被氧化使用新鲜的洗脱缓冲液. 了加入DTT.非特异的疏水相互作用导致蛋白向洗脱缓冲液中加入非离子去垢剂.加入1%的TritonX-100 和柱材非特异的结合或聚集,从或2%的n-octylglucoside可以显著提高某些GST标签蛋白的而阻止了标签蛋白的溶解和洗洗脱. 脱. 电泳或蛋白质分子量为70 000 的蛋白与GST标分子量为70 000 的蛋白可能是大肠杆菌dnaK基因的产物. 免疫印迹检测签蛋白共纯化发现多条条带该蛋白参与大肠杆菌中蛋白质折叠.有报道这种相互作用可以通过上样前在50mM Tris-HCl,2mM ATP,10mM MgSO4,pH7.4中37°C温浴10分钟而破坏.或者把有标签蛋白通过A TP-agarose或相似的纯化介质或进行离子交换层析来除去. 标签蛋白被蛋白酶部分降解加入蛋白酶抑制剂.多条条带可能是由于目的蛋白被蛋白酶部分降解的结果.在裂解溶液中加入1mM PMSF可能会使结果变好.一种无毒的水溶性的PMSF替代物是AEBSF, Roche Biochemicals的商品名为Pefabloc SC.注:丝氨酸蛋白酶抑制剂必须在使用凝血酶或凝血因子Xa前除去. Prescission Protease不是一种经典的丝氨酸蛋白酶.经GE Healthcare检测,它对很多蛋白酶抑制剂不敏感. PMSF有毒,有急性作用.如果可能的话使用Pefabloc SC.2在宿主细菌中的蛋白降解用一种蛋白酶缺失型宿主:多条带可能是在宿主细菌中蛋白酶切造成的.如果是这种情况,或许需要蛋白酶缺陷型菌株(比如lon-或ompT).大肠杆菌BL21随pGEX载体提供. 这种菌株是ompT和lon缺陷型菌株.在机械裂解过程中细胞破碎降低裂解时间:细胞裂解表面上是使悬浊液部分澄清,可以通过镜检检测.机械裂解前加入溶菌酶(0.1倍体积的10 毫克/毫升溶菌酶溶液,溶菌酶保存在25mM Tris-HCl,pH8.0 )可能会使结果变好.避免发泡,因为这可能使标签蛋白变性.过分裂解也会导致宿主细胞蛋白和GST标签蛋白共纯化.分子伴侣可能被共纯化了包括额外的纯化步骤:多余的条带可能由于共纯化一些分子伴侣所造成.这些分子伴侣参与大肠杆菌中新生成的蛋白的正确折叠.这些包括,但不仅仅是:DnaK(分子量70 000)DnaJ(分子量37 000)GrpE(分子量40 000)GroEL (分子量57 000)GroES(分子量10 000).一些从这些共纯化的蛋白中分离GST标签蛋白的方法已经发表.抗体和很多种大肠杆菌中的蛋白抗体和大肠杆菌蛋白交叉反应:取决于抗GST抗体的来源. 反应它可能包含一些抗体,这些抗体与标签蛋白样品中的大肠杆菌蛋白能够反应.通过和大肠杆菌的超声裂解物反应来除掉那些能够交叉反应的抗体.GE Healthcare的GST抗体已经和大肠杆菌蛋白进行过交叉吸附,并检测证明其在蛋白质免疫印迹中没有非特异条带. 目的蛋白酶切蛋白酶切发生在宿主细菌内后电泳检测发现多条条带检测条带何时出现:确定多余的条带在Precission Protease,凝血酶,凝血因子Xa切割前不存在.这些条带可能是在宿主细菌中降解的结果. 目的蛋白可能含有Precission Protease,凝血酶,凝血因子Xa 的切割位点,检查序列.细节请参见《GST基因融合系统手册》.His Tag 蛋白纯化方法之选择全攻略HisTag 蛋白纯化篇：用基因工程的方法来表达蛋白质，必须经过纯化才能实现最终目的。
融合his-tag蛋白质纯化步骤(英文翻译)
一：在自然条件下从大肠杆菌纯化带组氨酸的蛋白质1.推荐培养的大肠杆菌的体积：这是根据表达系统和组氨酸标记的蛋白质的性质来决定的。
Midi型号的养25-150mL的大肠杆菌。
2.收集菌的细胞：注：菌体不用的时候需要保存在-800C。
a.将过夜培养的细菌离心（6000g，40C，15min），然后小心的除掉上清。
b.制备1X LEW Buffer 和1X Elution Buffer。
3.悬浮细胞体：这步在冰上进行用1X LEW Buffer将上步离心过后的菌体吹悬，一般来说每150mL菌液加3mL的1X LEW Buffer（每湿重1g的菌体加5mL的1X LEW Buffer）。
如果菌体冻住，则需要在冰上用1X LEW Buffer将其溶解,溶解后转入15 ml的离心管中，便于进行超声裂解。
4.使裂解物澄清a.将溶菌酶添加到上面得到的溶液中（1mL的LEW混合液+20uL的50mg/mL的溶菌酶）。
然后将它放置在冰上30mins，可能的话中间偶尔混合一下。
b.超声裂解：工作2s，间歇2s，如此循环180次，总共18mins。
注：超声在冰浴上进行。
如果得到的溶液有粘着，可加入DNase1。
c.离心（13000rmp，40C，15mins），收集上清。
注：如果上清不是澄清的，进行第二次离心，是为了防止没有溶解的菌体堵塞柱子。
5.平衡PrepEase® Ni-NTA Columna.将柱子放在合适的离心管中，最好是15mL的离心管。
可以将15ml离心管插到冰上。
将柱子放到带圆孔的纸片中，放入15ml离心管中b.用2mL的1X LEW Buffer平衡柱子。
允许柱子在重力的作用下排干。
6.将样品结合到PrepEase® Ni-NTA Column将步骤4c得到的上清加到柱子里，并允许柱子在重力的作用下排干。
7.洗柱子:用1X LEW Buffer洗柱子，洗两次，每次用2mL的1X LEW Buffer。
IP0063 HA标签亲和凝胶,蛋白质纯化用HA标签亲和凝胶
Anti-HA标签（YPYDVPDYA）亲和凝胶Cat#：IP0063（本品仅用于科学研究，不可用于诊断及治疗）一．背景信息HA-Tag （YPYDVPDYA），常用于真核蛋白质重组表达标记。
Anti-HA标签（YPYDVPDYA）亲和凝胶，由高品质的HA兔多克隆抗体与Sepharose 4B琼脂糖颗粒共价偶联制成，具有高载量（至少为1.2mg protein/ml凝胶），高特异性，性质稳定，可反复使用的特点，可用于HA标签融合蛋白的亲和纯化及免疫（共）沉淀。
二．性能指标应用范围：可用于Met修饰的N端HA融合蛋白（Met-HA–Protein），N端HA融合蛋白（HA–Protein）和C端HA融合蛋白（Protein-HA）的亲和纯化及免疫（共）沉淀。
载量：1ml Sepharose4B琼脂糖颗粒，共价偶联800μg Anti-HA兔多克隆抗体，可纯化或沉淀至少1.2mg HA融合蛋白。
成分：共价偶联Anti-HA抗体的Sepharose4B琼脂糖颗粒, 1ml溶于2ml PBS+50%甘油中。
保存方法：在加入了50%甘油和0.2‰叠氮钠的PBS保存液中，-20℃可保存1年。
三．使用方法（以下步骤仅供参考，客户可根据经验自行调整）细胞裂解液制备(以培养的哺乳动物细胞为例)1)悬浮细胞和半贴壁细胞从细胞培养瓶上吹下来后放入离心管中，1000rpm 离心5分钟。
贴壁细胞用细胞刮子轻轻从瓶壁上刮下来，放入离心管中1000rpm离心5分钟。
2)预冷的PBS重悬细胞，1000rpm离心3min，弃上清。
重复一次。
3)根据细胞的量加入相应体积的细胞裂解液，反复吹打后冰上放置10-20min，让细胞充分裂解。
4)用超声破碎仪将细胞裂解液超声，直至细胞裂解液透明，不再粘稠。
冰上放置30min之后，12000rpm，4℃离心10min。
取上清，冷冻保存。
应用一. 免疫（共）沉淀法检测HA标签蛋白质1)重悬Anti-HA标签亲和凝胶至均一，转移30ul混合液(约含15ul凝胶)至离心管中，加入5倍凝胶体积PBS，5000rpm x 30sec，弃上清，重复该步骤清洗凝胶三次。
蛋白纯化试剂盒说明书
蛋白纯化试剂盒介绍试剂盒有10个重力流柱，而该柱在自然条件下纯化可重新装填Ni-IDA Sefinose TM 6 Fast Flow 和结合缓冲液，洗脱液。
这10个柱子通过固定化金属亲和层析可用于纯化带组氨酸标签的蛋白。
Ni-IDA Sefinose 6 Fast Flow 有很高的蛋白结合能力，低镍离子（Ni2 +）的泄漏以及可与变性剂和广泛的添加剂相兼容。
澄清和非澄清的样品可使用该柱。
特殊的frits 在纯化过程可防止介质变干燥。
一次纯化平均需要30分钟。
在变性下纯化，请自备额外的结合缓冲液和洗脱液。
特征柱材料聚丙烯桶，聚乙烯筛板介质Ni-IDA Sefinose 6 Fast Flow平均粒径90 µm蛋白结合能力约6 mg组氨酸标签蛋白/1毫升树脂床体积 1 mL/柱使用时兼容性在各种通用缓冲液，洗涤剂和变性剂中稳定避免在缓冲液中含螯合剂，例如EDTA，EGTA，柠檬酸等pH稳定性，短期（2h）2-14储存20%乙醇保存温度4或30℃与NI-IDA树脂相兼容的试剂还原试剂5 mmol/L DTE(二硫赤藓糖醇)5 mmol/L DTT(二硫苏糖醇)20 mmol/L β-巯基乙醇5 mmol/L TCEP(磷酸三氯乙酯)10 mmol/L 还原型谷胱甘肽变性剂8 mol/L尿素6 mol/L 盐酸胍洗涤剂2% TritonX-100(非离子物质)2% Tween 20（非离子物质）2% NP-40 (非离子物质)2% 胆酸盐1% CHAPS（两性离子）其他添加剂20% 乙醇50% 甘油100 mmol/L Na2SO41.5 mol/L NaCl1 mmol/L EDTA60 mmol/L柠檬酸盐100 mmol/L 磷酸钠，pH 7.4 缓冲液100 mmol/L Tris-HCl pH 7.4100 mmol/L Tris pH 7.4100 mmol/L HEPES pH 7.4100 mmol/L MOPS pH 7.4100 mmol/L 醋酸钠pH 4注意：1.为了最佳的操作过程，按照上述纯化步骤进行预洗以除去任何削弱结合镍离子的物质。
纯化试剂盒Ni-Agarose-His-标签蛋白纯化试剂盒
纯化试剂盒目 录 号： CW0009 规 格： 2ml产品简介： 该镍柱纯化系统对6×His-tag 蛋白具有显著特异吸附能力，能够高效一步纯化带有6个组氨酸亲和标签的蛋白。
该系统具有4个Ni 2+ 螯合位点，较只有3个螯合位点的Ni-IDA 结合Ni 2+ 更为牢固，有效防止纯化过程中Ni 2+ 脱落且增强对His 标签蛋白的结合能力，提高纯化效率。
较高的基团密度，大大提高了蛋白载量。
该系统在天然或变性条件下，对来源于各种表达系统（如杆状病毒，哺乳细胞，酵母以及细菌）中的His 标签蛋白，均有很好的纯化效果。
本产品已螯合镍离子，可直接使用，方便，快捷。
支持 物： CL-6B 琼脂糖凝胶 载 量： 20-30mg His 标签蛋白/ml 填料 粒 径： 50-160μm 保存条件： 填料请于20%乙醇中2-8℃保存，PMSF 于-20℃保存，其余试剂2-8℃放置保 质 期： 一年1: 蛋白分子量标准（分子量由大到小分别为：90/66/45/27/14.4kDa ） 2: 全菌裂解液3: 流穿收集液 4: 洗脱收集液1（洗脱缓冲液，含500mM咪唑，收集第1个柱体积） 5: 洗脱收集液2（洗脱缓冲液，含500mM咪唑，收集第2个柱体积） 6: 洗脱收集液3（洗脱缓冲液，含500mM咪唑，收集第3个柱体积）7: 洗脱收集液4（洗脱缓冲液，含500mM咪唑，收集第4个柱体积）Ni-Agarose His 标签蛋白纯化试剂盒北京康为世纪生物科技有限公司Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒CW0009组分说明：序号 试剂 规格1 Ni-Agarose填料 2ml2 细菌裂解液 25 ml3 8M尿素 40 ml4 6M盐酸胍 25 ml5 200mMTris(pH7.9) 25 ml6 1M咪唑 25 ml7 氯化钠 7.305 g8 PMSF 0.5 ml。
AhAO2融合蛋白表达、纯化与抗体制备
ｍ ｌＬＮ Ｃ ） ｍｏ ａ Ｉ 漂洗 膜 以去除 膜 表 面 的 Ｔ ｅｎ２ ． ／ ｗ ｅ ０ 免 疫 复合 体 用 碱 性 磷 酸 酶 反 应 试 剂 盒 （ 根 生 化 科 天
３ Ｐ Ｏ Ｘ—Ｈａ—Ａ Ａ ２诱导 后菌体 总蛋 白（ ｒｔｉ ｆＩＴ ：ｐ Ｒ Ｅ ｔ ｈＯ Ｐｏｅ ｏ Ｐ Ｇ—ｉ— ｎ ｎ
心脏 采 血 ， 离 出血 清． 分
１ ６ Ｗ ｅ ｔｒ ｏ ． ｓｅ Ｂｌｔ ｎ
Ｍ：５ ｐＤＮ ａｄｒ１ Ｐ Ｒ空 白 对 照 （ Ｃ ｅａｉ ｏｔ １ ； ： ２ ０ｂ Ａ ｌ ｅ； ：Ｃ ｄ Ｐ Ｒ ｎｇｔ ｅｃｎ ｏ） ２ 重 ｖ ｒ
组质粒 Ｐ Ｒ检测 （ Ｃ ｒ ｕ ｔ ｆｐ Ｒ Ｅ Ｃ Ｐ Ｒ ｐｏ ｃ Ｐ Ｏ Ｘ—Ｈｔ ｄ ｏ ａ—Ａ Ａ０ ； 重组 ｈ ２） ３：
ｅ ｌｔ ｒ ｂｏ 检测显示其只 与 Ｈ ｓ ｈ Ｏ Ｒ ｉ—Ａ Ａ ２融合 蛋 白结合． 实验成功制备 了抗 Ａ Ａ ２特异抗体． ｈＯ 关键词 ： 花生 ； ｈ Ｏ ；ｐ Ｒ Ｅ Ｈ ａ Ａ Ａ ２ Ｐ Ｏ Ｘ Ｔ ；原核表达 ； 抗体
中 图 分 类 号 ： ７ Ｑ８ 文献标志码 ： Ａ
１３ ｐＲ Ｅ ． Ｐ Ｏ Ｘ—Ｈ ａ—Ａ Ａ ２重 组表 达载体 构 建 ｔ ｈ０
ｏｉａｅＡ Ａ ｘ ｓ， Ｂ Ｏ）催 化 的 反 应 是 高 等 植 物 脱 落 酸 ｄ （Ｂ Ａ Ａ）生 物 合 成 途 径 的 重 要 步 骤 ¨Ｉ ． 中 由 ２ 其 Ｊ
ＡＡ Ｂ Ｏ催化 Ａ Ａ生物合成 的最后一步反应 ， Ａ Ａ Ｂ 将 Ｂ
２ 华南师范大学生命科学学院 ， ． 广东省植 物发育生物工程重点实验室 ， 广东广州 ，１６ １３ 广州甘蔗糖业研究所 ， ５０ ３ ；． 广东广 州 ，１３６ ５０１）
pTAT-HA-ARC和pTAT-HA-eGFP的原核表达及r转导神经元活性初步鉴定
pTAT-HA-ARC和pTAT-HA-eGFP的原核表达及r转导神经元活性初步鉴定和祯泉;张春;丁娜;左娣;牛建国;崔建奇;扈启宽【摘要】目的构建原核表达质粒,表达并纯化pTAT-HA-ARC和pTAT-HA-eGFP 融合蛋白,初步探讨其转导神经元细胞的活性.方法构建pTAT-HA-ARC和pTAT-HA-eGFP原核表达载体,将载体转化大肠杆菌,通过IPTG诱导表达目的蛋白,优化IPTG诱导浓度,通过镍亲和层析柱和脱盐柱纯化蛋白,SDS-PAGE和Western blot 印迹鉴定目的蛋白;并通过荧光显微镜观察pTAT-HA-eGFP转导小鼠海马神经元细胞HT22的活性.结果成功表达、纯化pTAT-HA-ARC和pTAT-HA-eGFP融合蛋白,本试验中优化的IPTG诱导浓度为0.1mM;pTAT-HA-eGFP融合蛋白能充分转导入HT22细胞中.结论表达和纯化了能直接转导入HT22细胞的带有TAT-HA 标签的融合蛋白,为进一步在体外和体内研究pTAT-HA-ARC蛋白对神经元的保护作用奠定了基础.%Objective To contruct the prokaryotic expression vectors,pTAT-HA-ARC and pTAT-HA-eGFP, to express and purify the fusion proteins and to investigate their transduction activities in neuronal cells. MethodsProkaryotic expression vectors,pTAT-HA-ARC and pTAT-HA-eGFP were constructed and then the constructed recombinant plasmids were transformed into E.coli and the target proteins were induced with IPTG. The inductive concentration of IPTG was optimized. The target proteins were purified by Ni+-NTA affinity chromatography and desalting columns,and identified by SDS-PAGE and Western blot assay. The transduction activities of pTAT-HA-eGFP on neuronal cells were observed directly under fluorescent microscope.ResultsThe fusion proteins of pTAT-HA-ARC and pTAT-HA-eGFP were successfully expressed and purified and the optimized inductive concentration of IPTG used in this experiment was 0.1mM. The fusion protein of pTAT-HA-eGFP could efficiently transduce into HT22 cells.ConclusionThe TAT-protein transduction technique was successfully established,and the fusion protein with TAT-HA tag which could directly transduce into HT22 cells have been successfully expressed and purified. It laid a foundation for the further investigation on the protective effects of fusion protein pTAT-HA-ARC in neuronal cells both in vivo and in vitro.【期刊名称】《宁夏医科大学学报》【年(卷),期】2017(039)006【总页数】5页(P658-661,666)【关键词】pTAT-HA-ARC;pTAT-HA-eGFP;原核表达;纯化;蛋白转导【作者】和祯泉;张春;丁娜;左娣;牛建国;崔建奇;扈启宽【作者单位】宁夏颅脑疾病重点实验室,银川 750004;宁夏颅脑疾病重点实验室,银川 750004;宁夏颅脑疾病重点实验室,银川 750004;宁夏颅脑疾病重点实验室,银川750004;宁夏颅脑疾病重点实验室,银川 750004;宁夏颅脑疾病重点实验室,银川750004;宁夏颅脑疾病重点实验室,银川 750004【正文语种】中文【中图分类】R741TAT-蛋白转导技术是基于人类HIV-1反式激活因子TAT的蛋白质转导域（protein transduction domain，PTD）发展起来的一项新技术，其最大特点是能够将与TAT连接的靶蛋白快速而高效地转导入细胞内部，包括破骨细胞、外周血单核细胞及原代细胞等常规方法难以转染的细胞，甚至还可以透过血脑屏障进入脑细胞中[1]。
ha蛋白标签的作用
ha蛋白标签的作用
"HA蛋白标签"通常指的是与蛋白质共价结合的一种标签，这个标签的名字来源于Hemagglutinin（血凝素）蛋白，它是一种存在于流感病毒中的膜蛋白。
HA蛋白标签被广泛用于生物学研究和蛋白质工程中。
以下是HA蛋白标签的一些常见作用：
1. 蛋白质表达和纯化：HA标签通常被用作蛋白质表达系统中的一种标记，以便在细胞或微生物中追踪蛋白质的表达。
它使研究人员能够利用HA标签来纯化目标蛋白质，通过对HA 标签的特异性结合来实现蛋白质的简便高效的纯化。
2. 免疫共沉淀：HA标签的抗体常用于免疫共沉淀实验，用于鉴定与HA标记的蛋白质相互作用的其他蛋白质。
这有助于研究蛋白质在细胞内的相互作用网络。
3. 流式细胞术：HA标签也常用于流式细胞术，通过流式细胞仪检测带有HA标签的蛋白质的表达水平，从而进行细胞表面标记和分析。
4. 免疫荧光染色：HA标签可以用作在细胞或组织中检测蛋白质的位置和表达水平的免疫染色的标记。
总的来说，HA蛋白标签在分子生物学和细胞生物学研究中发挥着重要的作用，为科研人员提供了一种方便而高效的方法来标记、纯化和研究目标蛋白质。
GST蛋白纯化试剂盒说明书及操作指南
GST蛋白纯化试剂盒说明书及操作指南GST蛋白纯化试剂盒是一种常用的实验工具，用于从细胞裂解液中高效纯化谷胱甘肽S转移酶（GST）标签融合蛋白。
下面将详细介绍试剂盒的组成、使用步骤以及注意事项，以帮助用户顺利进行GST蛋白纯化实验。
一、试剂盒组成蛋白纯化试剂盒由以下几个主要组分组成：1、离心管：提供用于样品处理和离心过程的离心管。
2、细胞裂解缓冲液：含有适量的洗脱缓冲液和辅助物质，在细胞裂解过程中保护目标蛋白的完整性。
3、离心管悬浮粉末：用于牢固固定GST亲和树脂。
4、清洗缓冲液：用于去除非特异性结合物质，保证目标蛋白的纯度。
5、洗脱缓冲液：用于洗脱目标蛋白，使其从GST亲和树脂上解离。
二、操作步骤以下是使用GST蛋白纯化试剂盒进行GST蛋白纯化的基本步骤：1、细胞裂解：将经过表达的GST标签融合蛋白的细胞用细胞裂解缓冲液裂解，并加入适量的离心管悬浮粉末。
轻轻摇晃或旋转离心管，使粉末均匀分布。
2、离心：将裂解液转移至离心管中，并以适当的速度离心使GST亲和树脂沉淀到离心管底部。
3、除去上清：谨慎倒出上清液，避免破坏沉积的GST亲和树脂。
4、清洗：加入适量的清洗缓冲液，轻轻摇晃离心管，使清洗缓冲液与GST 亲和树脂充分接触，去除非特异性结合物质。
重复此步骤两次以确保清洗。
5、洗脱：加入适量的洗脱缓冲液，轻轻摇晃或旋转离心管，使目标蛋白从GST亲和树脂上洗脱。
6、收集洗脱液：将洗脱液收集于新的离心管中，这样就得到了纯化的GST 标签融合蛋白。
三、注意事项在使用蛋白纯化试剂盒过程中，请注意以下几点：1、严格按照说明书中的步骤进行操作，避免操作失误导致结果不准确。
2、所有悬浮粉末和缓冲液应按照说明书中的要求储存，并避免暴露在高温、阳光直射或湿度过高的环境中。
3、使用前请检查试剂盒是否有损坏或过期，如有问题请勿使用。
4、操作过程中请佩戴适当的实验防护设备，避免对自己和他人造成伤害。
准确使用GST蛋白纯化试剂盒可以高效地纯化目标蛋白，为科研工作者提供了一个有效的实验工具。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
HA标签（YPYDVPDYA）融合蛋白纯化试剂盒
Cat#：KAP0063
（本品仅用于科学研究，不可用于诊断及治疗）
1.背景信息
HA-Tag（YPYDVPDYA），常用于真核蛋白质重组表达标记。
HA标签（YPYDVPDYA）融合蛋白纯化试剂盒，主要成分是Anti-HA亲和纯化凝胶（Anti-YPYDVPDYA (HA) Affinity Gel），由高品质的HA兔多克隆抗体与Sepharose 4B琼脂糖颗粒共价偶联制成，具有高载量（至少为1.2mg protein/ml 凝胶），高特异性，性质稳定，可反复使用的特点，可用于HA标签融合蛋白的亲和纯化。
2.性能指标
应用范围：可用于Met修饰的N端HA融合蛋白（Met-HA–Protein），N端HA融合蛋白（HA–Protein），C端HA融合蛋白（Protein-HA）及中部HA融合蛋白的亲和纯化。
载量：1ml Sepharose 4B琼脂糖颗粒，共价偶联800μg Anti-HA 兔多克隆抗体，可结合至少1.2mg HA融合蛋白。
强度：重力柱纯化，可反复使用5次以上。
保存方法：在加入了50%甘油和0.2‰叠氮钠的PBS保存液后，预装纯化柱可于-20℃可保存1年。
3.试剂盒组成
-100（说明见5.3）
注意事项（开箱前必读）
3.1本试剂盒冷藏条件下运输，如果暂时不用，请将纯化柱（空柱）取出，室温保存；亲和凝胶于-20℃
保存；试剂盒及其它成分保存于4℃。
3.2HA peptide溶解方法：该多肽为轻质粉末，开盖前应离心。
建议将40ul 10xPBS溶液加至
1mg多肽粉末中，彻底溶解后，加入160ul双蒸水，制成5mg/ml储存液，-20℃保存。
使用
时用1xPBS稀释至需要的浓度。
按需求浓度稀释至工作浓度。
3.3有文献显示，与传统的Glycine-HCl洗脱液相比，本试剂盒提供的pH3.0的Arginine-HCl做为
洗脱液，可以减少蛋白质变性，延长抗体亲和纯化柱的使用寿命。
客户也可以根据实际情况自行
选用配制
4.使用方法（所有步骤尽可能在冰上进行，以避免目标蛋白质降解。
）
4.1细胞裂解液制备
4.1.1悬浮细胞和半贴壁细胞从细胞培养瓶上吹下来后放入离心管中，1000rpm离心5分
钟。
贴壁细胞用细胞刮子轻轻从瓶壁上刮下来，放入离心管中1000rpm离心5分钟。
4.1.2预冷的PBS工作液重悬细胞，1000rpm离心3min，弃上清。
重复一次。
4.1.3根据细胞的量加入相应体积的细胞裂解液，反复吹打后冰上放置10-20min，让细胞
充分裂解。
4.1.4用超声破碎仪将细胞裂解液超声，直至细胞裂解液透明，不再粘稠。
冰上放置30min
之后，12000rpm，4℃离心10min。
取上清，冷冻保存。
4.2装柱及孵育
4.2.1温和重悬Anti-HA亲和纯化凝胶，至均匀混合，用剪去末端的枪头吸取适量的凝胶至
空纯化柱中。
4.2.210ml（10倍凝胶体积）PBS清洗Anti-HA亲和纯化柱。
4.2.3加入含有目标蛋白的真核细胞裂解液，4℃旋转孵育过夜。
4.2.45ml PBS（5倍凝胶体积）洗柱三次。
4.2.5根据蛋白质性质选择洗脱方法，具体可参见第5部分问题和建议
5.1。
4.3HA peptide洗脱液竞争洗脱
4.3.1用1xPBS配制HA peptide洗脱液，终浓度为100μg/ml，也可根据具体情况自行调
整工作浓度。
4.3.2加入2ml HA peptide洗脱液（或10倍凝胶体积），轻柔混匀，浸泡0.5小时后，
收集洗脱液，每次收集1ml。
如有必要，再次加入2ml HA peptide洗脱液（或10
倍凝胶体积），重复洗脱一次。
4.3.3用紫外检测仪测定收集液, 合并收集液。
4.3.4SDS-PAGE鉴定蛋白质纯度及浓度，并按照需求处理和保存蛋白质。
4.4酸性洗脱液酸性洗脱
4.4.1预冷的5ml pH
5.0酸性预洗液（5倍凝胶体积）洗涤纯化柱，除去非特异性结合蛋
白。
4.4.2预冷的10ml pH 3.0的酸性洗脱液（10倍凝胶体积）进行洗脱，每次收集1ml, 收
集管中预先放入中和液50μl。
注意：酸性环境放置太久会缩短亲和纯化柱的使用寿命，
应尽量缩短亲和纯化柱与酸性洗脱液的接触时间。
4.4.3用紫外检测仪测定收集峰, 合并收集峰。
4.4.4SDS-PAGE鉴定蛋白质纯度及浓度，并按照需求处理和保存蛋白质。
4.5纯化柱的清洗与再生（洗脱后须立即进行纯化柱的清洗与再生）
4.5.110倍凝胶体积PBS清洗纯化柱。
4.5.2酸性洗脱液（pH3.0）洗涤纯化柱，每次三倍凝胶体积。
4.5.3中和液（pH8.0）洗涤柱子三次，每次三倍凝胶体积。
4.5.4检测流穿液pH，如为中性，则进行下一步；如仍为酸性，则重复4.5.2和4.5.3。
4.5.5用1xPBS（含50%甘油，0.2‰叠氮钠）清洗，再加入适量该保存溶液至填料中，保
存在-20℃。
4.6保存
纯化产物加入50%甘油保存在-80℃，用于后续功能性实验。
5.问题与建议
5.1如何选择竞争性洗脱和酸性洗脱？
HA peptide洗脱液与蛋白质上的HA标签竞争亲和纯化柱上的抗体，使蛋白质与抗体的结合被取代而脱离纯化柱，从而被洗脱下来。
这种洗脱的特点有：
5.1.1洗脱条件温和，一般不会造成蛋白质变性；有利于亲和纯化柱的保存和反复使用。
5.1.2由于亲和吸附达到平衡比较慢，所以往往需要较常的时间和较大的洗脱体积。
5.1.3特异性强，可以进一步消除非特异性吸附的影响，从而得到较高的分辨率。
基本上不会
有anti-HA的抗体被洗脱下来。
酸性洗脱是通过改变环境pH，破坏抗原抗体的结合从而使蛋白质脱离纯化柱被洗脱下来，这种洗脱方式的特点有：
5.1.4成本低廉。
5.1.5纯化速度较快。
5.1.6酸性pH会造成部分蛋白质变性，引起目的蛋白质沉淀，降解或失活。
5.1.7有时会有少部分Anti-HA抗体被洗脱，造成非特异性信号。
5.1.8反复使用酸性洗脱，会造成抗体脱落，也会破坏纯化柱的理化性质，减少纯化柱的反复
使用次数。
5.2常见的蛋白质的后续处理方法有哪些？
5.2.1透析与超滤
透析法是利用半膜将分子大小不同的蛋白质分开。
超滤法是利用高压力或离心，强使水
和其他小的溶质分子通过半透膜而蛋白留在超滤管内。
两者都可以达到换液的目的。
使
用时需注意选择正确分子量的透析袋和超滤管。
5.2.2过滤除菌
可采用微孔滤膜滤器操作，让蛋白质溶液通过0.22um滤膜，即可达到除菌的目的。
5.2.3蛋白质定量鉴定浓度。
5.2.4SDS-PAGE鉴定纯度。
5.3如何选择细胞/组织裂解液？
本试剂盒提供的细胞裂解液成分如下：
Nacl 150mM
Tris-HCL(PH8.0) 50 mM
-100 1%
EDTA 1mM
使用前可加入1%PMSF和0.5%原钒酸钠, 或其他蛋白酶抑制剂，避免蛋白质降解。
客户可根据目的蛋白的性质和后继用途，自行配制细胞裂解液及选择是否加入蛋白酶抑制剂。
6.使用中的常见问题及解决方案
详情请咨询武汉戴安生物技术有限公司。