回眸干扰素研究历程,全面认识干扰素

回眸干扰素研究历程，全面认识干扰素

缪晓辉

2007年是干扰素发现50年周年。有关干扰素的基础和临床研究涉及诸多领域，临床应用价值已经得到充分肯定，尤其是干扰素在治疗慢性病毒性肝炎的临床应用，彻底打破了慢性病毒性肝炎抗病毒治疗“无药可治”的局面，使得大量患者获益：或痊愈，或延长了寿命，或改善了生活质量。干扰素的生物活性非常广泛，临床应用范围有待进一步拓宽。本文对干扰素的研（究）发历程和临床应用价值作简要评述。

一、病毒学的快速发展催生了干扰素的发现

病毒是一种最微小的生命物质，早年曾被定义为“可过滤因子”。1892年Ivanowsky 发现了病毒颗粒，此后证实病毒是由核酸和蛋白质组成的、寄生于细胞的微生物。1935年Magrassi描述了一种现象：可引起脑炎的疱疹病毒株在家兔体内能够干扰同型脑炎病毒株的生长；同年Hoskin报道猴子感染黄热病毒亲神经株后能够免除同一病毒嗜内脏株的致死作用。此后，上述“干扰现象”不断被发现，并确认非抗体和病毒本身所为。1957年英格兰Mill Hill实验室的Isaacs和一位瑞士访问学者Lindenmann，发现鸡胚细胞与加热灭活的流感病毒一起处理后对活的流感病毒有抵抗能力，继而从细胞上清中分离出一种蛋白质，在干扰现象（interfere）的基础上命名其为干扰素（interferon）。从此，干扰现象的神秘面纱被揭开。从干扰素的发现和早期的研究历程，不难理解为什么干扰素更多地被视为一种抗病毒因子。

二、干扰素是由细胞分泌的、具有广泛生物活性的细胞因子

包括干扰素在内的许多具有免疫活性的蛋白质曾一度被称为淋巴因子（lymphokin），后来发现这些所谓淋巴因子可以由多种细胞产生，故至20世纪80年代初期淋巴因子逐渐被细胞因子取代，而在当时，干扰素是最重要的细胞因子。1979年至1987年间，Gresser担任主编，先后出版了9集《Interferon》年系列丛书集。1980年，国际干扰素研究协会还创办了一本名为《Journal of Interferon Research》的期刊，至1994年更名为《Journal of Interferon & Cytokine Research》，可见干扰素的地位。随着对干扰素研究的不断深入，干扰素的更多生物活性被揭示，值得一提的是干扰素抗肿瘤作用的发现。早年，很多学者推测恶性肿瘤是病毒慢性感染的结果，因此进行了若干实验，试图通过抑制病毒复制而抑制模型肿瘤生长，从而间接证明这一设想。1967年，Gresser在他的研究日志中记录了一段有趣的故事：他设计了注射癌细胞株制备小鼠肿瘤模型，实验动物分为预先注射和未注射干扰素两组，初期的设想是注射干扰素组鼠荷瘤时间和荷瘤率要比对照组低，结果意外地发现，注射干扰素组癌细胞未能在小鼠体内生长，Gresser认为实验技师忘记了注射癌细胞株，而技师坚持认为已经按要求注射，争论相持不下。几个月后Gresser亲自重复试验，取得了相同结果，这才使他意识到干扰素可能有直接抗肿瘤作用。

随着免疫学理论和技术的迅猛发展，在随后的研究中发现干扰素实际上还是一类具有很强免疫调节作用的细胞因子。并据此将干扰素分为Ⅰ型和Ⅱ型干扰素，后者被称为“免疫干扰素”。大量研究表明，干扰素的免疫调节作用很强，作用环节十分复杂。比如，可以增强和激活NK细胞活性，促进MHCⅠ、Ⅱ类分子表达，提高免疫活性细胞表面免疫球蛋白Fc段受体表达量，增加其他具有免疫活性的细胞因子的分泌等作用。最近发现α干扰素对特异性CTL和DC细胞有很强的激活作用，有利于增强免疫清除功能。可见，干扰素通过以上种种免疫调节作用直接或“放大”了抗病毒和抗肿瘤等作用。

国际细胞因子命名委员会根据各种干扰素的来源和活性特征对干扰素作了统一分类和命名。下表对比了各种干扰素的新旧命名和免疫活性。

表人干扰素命名和免疫活性比较

Ⅰ型Ⅱ型曾用名称 LeIFN FiIFN 免疫IFN

现用名称 IFNα IFNβ IFNω IFN? IFNγ

产生细胞白细胞纤母细胞白细胞滋养层细胞 T细胞、NK细胞

直接抗增殖是是是是

促MHCⅠ表达是是是是

促MHCⅡ表达否否轻是

刺激NK活性是是是低于Ⅰ型，迟发

三、干扰素作为抗肝炎病毒药物的研（究）发进展迅速

在干扰素被发现后的20余年，全球很多实验室或研究中心从人血或脐带血白细胞中诱生天然干扰素，开展了大量动物试验和人体试验，为干扰素的临床应用奠定了基础。我国学者或医药研发机构也做过不少有益的尝试，可惜当时实验基础较差，大多缺乏规范性。天然干扰素最终没有成为“药物”的关键是它获取困难、费用昂贵，而且得率很低，因此，干扰素的临床应用价值未能充分显现。

至20世纪70年代末期基因克隆和蛋白表达为主的基因重组技术的诞生和成熟，利用大肠埃希菌或酵母体外大量表达重组人干扰素成为可能。Taniguchi在1979年首先获得了β干扰素的cDNA，并在大肠埃希菌成功表达具有活性的β干扰素。1980，Nagata等报告从人白细胞中成功克隆出人α干扰素基因，并得到相应的基因工程α干扰素产物。通过发酵技术，一个发酵罐一次可获得数克甚至百克干扰素蛋白（总活性高达1011－1014国际单位），可供数十万人使用为期一年的一个疗程。1991年第一个重组α干扰素得到美国FDA批准应用于临床，次年我国重组干扰素正式批准上市。

其时，用于治疗慢性乙型肝炎的重组干扰素为隔天注射一次，若以E抗原的血清

转换为疗效标准，长期疗效在25％左右，远远低于期望值，也与干扰素的体外细胞抗病毒活性检测试验结果相差甚大。为此，研究人员和生物医药研发公司不断努力和尝试，包括改变干扰素结构和剂型等，以期进一步提高干扰素抗病毒疗效。有四大“事件”值得一提：一是上世纪90年代中期由美国安进公司推出了一种所谓混合干扰素，商品名为Infergen，它是通过对已知天然α干扰素亚型序列扫描，采用每个位点上最常出现的氨基酸决定簇，构建对应的DNA 序列经大肠杆菌表达而成，氨基酸残基数166。但由于没有取得期望的疗效，不久即退出医疗市场。二是脂质体干扰素的研制。脂质体是由磷脂双层构成的具有水相内核的脂质微囊，其脂质双分子层与生物膜有较大的相似性与组织相溶性，易于被组织吸收。可降低药物毒性，减小药物使用量，具有缓释和控释作用。脂质体干扰素曾经风靡一时，与普通干扰素相比提高了血药半寿期。但是由于技术工艺（包裹效率、纯度、包裹后易于自然解离等）、干扰素蛋白的不稳定、体内靶向作用不明显等原因，未能成为主流产品。三是干扰素与利巴韦林联合使用治疗丙型肝炎。20世纪八十年代发现了丙型肝炎之后，分别使用干扰素和利巴韦林抗病毒治疗都进行过有益的尝试，但是效果不满意，尤其是利巴韦林作为一种广谱抗病毒药物在清除丙型肝炎病毒方面的作用非常有限。然而，后来研究发现，干扰素联合利巴韦林能显著提高抗病毒效果，尤其是聚乙二醇干扰素联合利巴韦林治疗，疗效高达70％！四是聚乙二醇干扰素（PegIFN）的研制和广泛临床应用。聚乙二醇是一种发泡剂，有很广泛的工业用途。研究者发现把聚乙二醇与蛋白质结合之后明显延长蛋白质的半寿期。本世纪初两种聚乙二醇干扰素诞生，分别为两个分子聚乙二醇结合一个分子IFN－α2a（PegIFNα2a，派罗欣）和一个分子聚乙二醇结核一个分子IFN－α2b （PegIFNα2b，佩乐能）。药代动力学研究发现，PegIFN可以在体内维持有效血药浓度长达一周，这种“长效”干扰素彻底改变了传统干扰素（PegIFN诞生之后，既往临床使用的单一分子结构的重组干扰素被赋予了新的称谓，包括“传统干扰素”和“标准干扰素”，我国医学界习惯称“普通干扰素”）血药浓度在24小时内从高峰到消失的短期效应，理论上可以实现对病毒的持续抑制作用。另外，PegIFN还可以降低干扰素抗体的产生，减少治疗失败的可能。PegIFN的“长效”的优点（一周注射一次）也给患者带来了极大的便利。PegIFN用于治疗慢性乙型肝炎和丙型肝炎的疗效比传统干扰素明显提高。但是PegIFN降低白细胞的副作用要比传统干扰素明显和发生率高。在2007年的欧洲肝病年会上，有人报告了一种新型的大分子干扰素已经进入临床研究，可望进一步提高干扰素抗病毒效果。

四、当前对干扰素抗病毒作用的认识方面值得商榷的几个问题

1．干扰素是免疫调节剂。如前所述，干扰素有多种生物活性，至少包括抗病毒、抗细胞增殖、抗肿瘤、免疫调节和抗纤维化五大作用，实际上干扰素还能够抑制某些细菌和杀灭某些原虫。诚然，干扰素的免疫调节作用是很强的，但是就抗乙肝或丙肝

病毒而言，如果单纯地把干扰素视为免疫调节剂，笔者若认为不妥。最简单的证据莫过于干扰素体外抗病毒活性的测定方法，即细胞病变抑制试验（cytopathic effect inhibition，CPEI）。该试验包括三个“系统”：支持细胞（多用人羊膜细胞株，WISH）、攻击病毒（多用水疱口炎病毒，VSV）和待测标本。测定时先将将待测标本适当稀释后与支持细胞共同培养，使细胞建立一种“抗病毒状态”，实际上是细胞在干扰素的作用下产生了多个具有抵御病毒入侵的蛋白质和磷酸激酶，细胞一旦被干扰素“激活”，就具备了防御病毒攻击的能力。不难注意到，在这个体外试验中没有任何免疫细胞参与！因此，我们有理由认为，干扰素治疗慢性病毒性肝炎是保护细胞免受病毒感染（抗病毒）和免疫调节作用的双重机制。

2．把HBsAg阴转甚至血清转换作为理想的干扰素治疗终点。众所周知，HBsAg自然阴转或者在核苷（酸）类似物抗病毒治疗后的阴转率在2％左右，而干扰素治疗后HBsAg的阴转率可以高达8％左右，由于出现了抗HBsAg，基本上可以认定慢性乙型肝炎得到治愈。于是我们就理想化地试图追求更高的HBsAg血清转换率，以求得到相应的更高治愈率。在这个目标的驱使下，近年来对于HBsAg定量检测技术的研发和临床价值评价也日趋成为热点。笔者认为，我们有必要用分子生物学理论审视一个经典的现象，即基因转座，这源自研究玉米变色中的基因转座现象。在对乙型肝炎病毒基因组研究中，X基因的转座以及与肝癌的关系已经得到明确的阐述，S基因的转座也偶有报告。如果我们承认乙肝病毒基因组或基因片断转座（整合）到人类染色体的事实，那么，转座后的S基因在体内持续表达不形成Dane颗粒的包括S抗原在内的膜蛋白成分就是普遍现象，若如此，干扰素治疗就不可能实现更高的S抗原血清转换率，S抗原的定量价值也是十分有限的。事实上自身清除病毒后HBV DNA阴性的HBsAg终身携带者非常普遍，这既可以作为转座的佐证，也提示把HBsAg阴转甚至血清转换作为理想的治疗终点是不现实的。

3．与核苷（酸）类似物合并使用治疗慢性乙肝的疗效之争仍未休止。抗生素应用规则之一是除少数情况外避免抑菌和杀菌药物联合使用，否则会降低杀菌药物的疗效。笔者早就提出把抗生素使用规则沿引至抗病毒药物的观点，但一直未被重视。新近研究表明，干扰素与拉米夫丁联合使用可提高降低血清HBV DNA水平的速度，但病毒清除率和E抗原血清转换率没有提高。从机制上考虑，即使转氨酶水平不高，HBV持久复制仍然是启动肝脏炎症反应的决定因素，有鉴于此，可以认为迅速抑制病毒复制的结果必然对调动机体自身清除病毒的不利，因而也不利于干扰素抗病毒和免疫调节作用的最大发挥。当然我们不能据此理解核苷（酸）类似物具有免疫抑制作用。在联合治疗的问题上，还有人提出核苷（酸）类似物与干扰素“阶梯治疗”方案。笔者认同这一方案，但顺序上应该使用干扰素在先而不是相反，对于“先把HBV DNA水平尽可能降低然后再使用干扰素效果会更好的”提法笔者不敢苟同。但是，当前任何一个联合

方案都还需要更多的循证医学证据支持。

4．干扰素的其他生物活性没有得到应有的重视。前文已经提及干扰素具有抗纤维化和抗癌的作用。事实上关于干扰素具有改善肝组织炎症反应和纤维化的试验和临床研究均有报告。早在1997年日本学者就发现代偿期乙肝肝硬化患者使用干扰素治疗后肝癌的发病率明显低于未使用干扰素组。但是，这些发现并没有在引起我国感染病学界的足够重视。可以预测，即使乙肝已经发展至肝硬化，即使干扰素抗乙肝病毒效果可能不佳，干扰素在逆转或阻止纤维化、防止癌变等方面也可能有益。有必要就此开展高级别循证医学证据的临床研究。

5.关于α干扰素和γ干扰素联合使用的问题。关于两种类型干扰素联合使用有可能提高疗效的观点有以下两个支持证据：第一，干扰素有两类受体，α和β干扰素等与细胞膜上的Ⅰ型干扰素受体结合，γ干扰素与Ⅱ型受体结合，配体与受体和结合是一种钥锁关系，另外，配体与受体结合还有饱和的特性。因此α和γ干扰素联合使用可以进一步提高“有效”使用剂量；第二，等量干扰素蛋白质作用于细胞后，γ干扰素的抗病毒作用比α干扰素低一个对数级，但免疫调节作用却要高100～1000倍！可见γ干扰素具有更强的免疫调节作用，理论上，两者合用可以发挥更强的清除病毒的效应。同样需要加强研究，得到循证医学证据的支持。

6．干扰素制剂与抗病毒疗效。笔者曾经两次对数种国产干扰素制剂进行体外抗病毒活性测定（未发表资料），结果发现竟然有两种品牌干扰素制剂的活性为零！而作为对照的另一种干扰素活性略大于标识量。临床实践中的确发现不同厂家生产的干扰素疗效不一，仅仅用不同亚型干扰素抗病毒效果不一来解释是不够的。这不是一个学术问题，但需要临床医生予以重视。

干扰素可谓“老药”，但是不可否认临床工作者仍然有必要加强对干扰素的若干基础理论问题的学习和理解。