ATCC菌种保藏与使用
菌种保藏和使用技术
在方法的附录中对菌种的规定同2005年版 在新增的“药品微生物实验室规范指导原则”中对菌 种有了较为明确的规定
允许使用标准菌株和商业派生菌株 标准菌株应按保藏机构提供的说明进行复活 标准储备菌株应进行纯度和特性确认 标准储备菌株建议采用低温冷冻干燥、液氮贮存或超低温冷冻 保藏的方法 标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株 冷冻菌株解冻后不得重新冷冻和再次使用 工作菌株不可替代标准菌株，商业派生菌株仅可用作工作菌株
菌种的保藏
保存的容器为无菌冻存管，保藏温度为-70℃。
在冷冻前，应贴上菌种标签。标签内容应包括 菌名、菌号、传代日期和有效期。 所有冻存管应立即置低温冰箱中，迅速冷冻。 该方法保藏菌种的有效期规定为6个月 。
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菌种的使用和销毁
本所保藏的菌种主要供本所检验工作使用并可对外提 供给有关涉药单位。本所提供的菌种为第二代低温冷 冻菌种。 本所检验工作所需菌种，领用人应向菌种管理人员领 取，并在《菌种领用记录》上记录菌名、数量、领用 人等信息。 外单位向我所购买菌种，应凭单位介绍信，并注明菌 名、菌号、数量，必要时可预约购买。 本所保藏的菌种，一般应每年更换原种（每年打开一 套冷冻干燥菌种传代制备第1代原种保存）。 过期菌种应及时销毁，销毁时应经121℃ 20分钟的生物 灭活处理。
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通过制备工作菌种进行菌种保藏的方法
优点
操作简便 成本低 比较容易掌握
缺点
保存期比较短 反复传代有引起变异的可能
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从我所采购的第2代超低温冷冻标准储备菌种
工作菌种 第3代
工作菌种 第3代
ATCC15834发根农杆菌使用说明
（必要时，可适当延长培养时间）。
菌 株 传 代 ：
将得到的菌株的新鲜培养物转接到适宜的固体培养基及液体培养基中（尽量
增大接种量：如用无菌吸管吸取≥50μl 新鲜培养物至固体培养基，边移动边缓
慢释放），适宜温度下培养，用以菌株的保藏、传代及制备工作菌株。
面蘸取少量涂板或进行液体培养即可。也可以完全融解后使用，但随着冻融次数
的增加，细菌的活力会逐渐下降。
2，为保证菌种纯正，避免其它细菌污染，尽量先划平板，然后再挑单克隆
菌落进行后续操作。
冷 冻 管 开 封 ：
用浸过 75%酒精的脱脂棉严格消毒冷冻管盖。
ATCC15834 发根农杆菌
编号
名称
北京华越洋生物 NRR01170 ATCC15834 发根农杆菌
基 本 信 息 ：
名称：ATCC15834 发根农杆菌
规格：300ul 甘油菌
储 存 温 度 ： -‐80℃
简 介 ：
注 意 事 项 ：
1、菌种活化前，将冷冻管保存在低温、清洁、干燥的环境中，长时间室温下放
置会导致菌种衰退；
2、冷冻管开封、冻干粉复溶、菌株恢复培养等操作应在无菌条件下进行；
3、一些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，部分需连续两次继代培养才能
正常生长；
4、苛养菌的培养需采用含特定营养成分的培养基，敬请正确选择，不清楚时来
菌 株 复 溶 ：
无菌环境中旋开装有复溶液的滴瓶盖，吸取 1ml 左右复溶液，加入到冷冻
管中。轻轻振荡，使冻干菌株溶解呈悬浮状。
菌株复壮：
用无菌吸管吸取菌悬液，转移到复溶液滴瓶中。做好标识，在适宜温度下培
养。细菌在 30-‐35℃培养箱中培养 24-‐48h，真菌在 23-
atcc标准菌株说明书
atcc标准菌株说明书
1、ATCC菌种批号说明:菌名称简称的拼音首字母+转种日期-代数-编号。
2、菌株每转种一次即增加一代，实验用应控制在五代以内。
3、购买菌株后，立即进行转种，不宜长期冷藏保存。
4、转种方式:
普通菌斜面:用接种环挑取斜面上的菌落，转种至适宜的液体培养基中，按药典规定的时间培养后，将液体培养物分装至无菌冻存管中，每支 1.5~2.0ml，冰箱冷冻(-20°℃)保存。
每次实验取一支转种后使用。
如:生孢梭菌:将小管中液体培养物接入硫乙醇酸盐液体培养基中，ATCC菌种按药典规定的时间培养后，将液体培养物分装至无菌冻存管中，每支1.5~2.0ml，冰箱冷冻(-20℃)保存。
每次实验取一支转种后使用。
黑曲霉:用接种环蘸取小管中孢子悬液，并涂布至改良马丁琼脂斜面上，培养1周后，按药典方法将孢子洗下，孢子悬液冰箱冷藏(4℃)保存。
实验时可直接取该悬液稀释至合适的级别后使用。
5、转种的液体培养基体积推荐为100ml，可分装约40~50支无菌冻存管，平时使用时应定期进行菌株的鉴定，若菌落形态不典型或特征反应不明显，说明该ATCC菌种已不适宜继续使用，应销毁后购买新菌株。
atcc菌种保藏与使用
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❖方法8
▪ 缓冲活性炭酵母提取物琼脂——35℃，正常 环境，3-5天。
❖方法9
▪ V琼脂或巧克力琼脂——35℃，5%~10% ，CO2环境，48小时。
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❖方法10
▪ 菌种水解可选用无菌脑心浸出液肉汤，胰蛋白 胨大豆肉汤，或0.85%生理盐水。无菌水水 解可能会导致活力下降或不复苏。在KWIKSTIK包装中自带的培养基使得菌种很好的复 苏。
▪ 2、以下列出可供选择的琼脂培养基和相应的 生长条件，供各实验室培养菌种时参考。
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❖ 方法1
▪ 胰蛋白胨大豆琼脂，非选择性羊血琼脂，标准计数平 板，或营养琼脂——35℃,正常环境，24-48小时。
❖ 方法2
▪ 非选择性羊血琼脂——35℃，正常环境，24~48小 时。在培养链球菌属和隐秘杆菌属时，CO2环境可提 高其生长。推荐使用5%CO2环境来培养肺炎链球菌 和其他甲型溶血性链球菌。
颜色识别便利并没有意味产品功能的任何改变。
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安全预防
❖ 1．当操控危害的培养物需使用一个生物安全柜 。
❖ 2．当抛弃使用或部分使用冻存管注意生物危害 预防。
❖ 3．当保存Microbank™在液氮里。以下需注 意：
▪ a.保证保存管盖正常旋紧：过于绷紧可扭曲帽里面硅 树脂橡胶密封件引起泄漏。
▪ b.保证保存管在盖之前螺纹与盖是完全干燥的：液滴 在液氮将损害封口。
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各类菌种推荐培养方法
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ATCC菌种保藏方法
ATCC菌种保藏方法微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡，因而常常造成菌种的衰退，并有可能使优良菌种丢失。
菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。
菌种保藏的方法有哪些呢?传代保存法有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。
传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。
传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。
培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。
若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。
一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。
传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉;②菌株的遗传性状容易发生变异;③反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低;④需要定期转种，工作量大;⑤杂菌的污染机会较多。
液体石蜡覆盖保存法该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。
此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。
其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物(如产孢能力低的丝状菌)的保存，而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行菌种保藏。
悬液保存法即使微生物混悬于适当溶液中进行保存的方法。
常用的有：① 蒸馏水保存法：适用于霉菌、酵母菌及绝大部分放线菌，将其菌体悬浮于蒸馏水中即可在室温下保存数年。
本法应注意避免水分的蒸发。
菌株的保存使用_及销毁
菌株的保存使用及销毁1、新引进的菌种经形态、染色、培养性状、生化特性等的鉴别确定后作记录，并进行保存。
2、自主分离筛选的菌株经试验确定为优良菌株，并进行形态、染色、培养性状、生化特性、毒性等的鉴别确定（必要时进行分子鉴定）后作记录，并进行保存。
3、应用菌株采用斜面低温保存法。
将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌株生长充分以后，转移至 4～8℃冰箱中保存。
此法仅用于应用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。
保存时间根据菌种种类而不同，细菌：1个月；酵母菌：2个月；霉菌及芽胞：3个月。
4、半储存菌株以甘油冷冻管保存法或液体石腊封存的半固体琼脂为主。
甘油浓度为10%～20%，保存温度为-20～-30℃，每隔1～2年转种一代。
此种方法主要适用于需氧细菌和酵母菌的保藏5长期保存的储存菌株以冷冻干燥保藏为主，特殊要求的菌种可用其它方法进行保存，保存期可长达几年至几十年。
6菌种的传代不可超过6次。
视菌种的特性及使用情况，一般储存菌株每5年传代一次，每隔1～2年从储存菌株转接至半储存菌株，半储存菌株每1～2年传代一次，每1～3个月从半储存菌株转接接至应用菌株。
7、菌种的确认：用无菌接种环取上述培养物接种到营养琼脂培养基（细菌）或玫瑰红钠培养基（真菌和酵母菌）平板上，或相应的宜于该菌生长的鉴别培养基平板上，然后在 30～35℃下培养3天（细菌）；20～25℃下培养 5 天（真菌和酵母菌）。
培养后，首先观察其是否具有典型的菌落形态，然后挑取生长旺盛的单一的纯菌落，划线于平皿培养基，每种菌划 4 个平皿，以便收集较多的生长旺盛的典型单菌落，进行保存和鉴定。
鉴定时作革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及形态特征。
必要时再做生化实验以进一步鉴定该菌种。
若在该平板上发现有其它菌落生长，则说明操作有污染或菌种不纯，应将此被污染了的培养物灭活处理，并寻找原因。
应根据其原因采取措施重新分离挑选纯菌落。
实验室菌种的使用和管理
xxx食品检测中心作业指导书1。
目的规范实验室菌种的收集、使用、保管程序；确保实验室的安全。
2.范围本管理细则适用于实验室菌种的使用和管理。
3。
职责3.1菌种保管员：按照本指导书做好菌种的收集、转种、使用、保存和发放以及销毁工作. 3。
2科室负责人:负责监督菌种的使用及管理。
4.管理细则本实验室保存的菌种仅包括一部分致病性较弱的三类细菌、一部分无致病能力的普通细菌和常见真菌。
不包括病毒、螺旋体、衣原体、立克次体;保存的菌种主要用于各类培养基、检测试剂的性能测试和质量控制。
4.1在本实验室保管的菌种名4。
1。
1保留工作菌种:大肠杆菌A TCC25922、鼠伤寒沙门氏菌50013、福氏志贺氏菌2a ATCC12022、副溶血性弧菌200904—1、金黄色葡萄球菌A TCC25923、表皮葡萄球菌ATCC12228溶血性链球菌23310、铜绿假单胞菌10211、普通变形杆菌，克雷伯氏杆菌，小肠结肠炎耶森氏菌ATCC 23715 、单核增生李斯特菌ATCC19111、枯草芽胞杆菌ATCC6633b 、蜡状芽胞杆菌A TCC11778、白色念珠菌A TCC10231、酿酒酵母ATCC9763、黑曲霉菌、展青霉菌、黄曲霉菌。
4。
1.2常规检测,科研分离得到的有保留价值的三类/四类菌种根据需要可继续保留；如果在食品中分离到二类/一类菌种,及时送上级单位进一步鉴定，并按规定立即销毁。
本实验室不保存一类、二类菌种。
4.2 菌种的保管4.2.1实验室菌种保存于专用的菌种室。
4.2。
2菌种保管员及科室负责人双人双锁负责保管菌种.4.2.3使用菌种需提出申请、经科室负责人批准后，向菌种保管员领用。
4。
2。
4菌种应按规定的时间定期转种,一般每转种3代做一次鉴定,如发现污染或变异应及时处理。
4。
2。
5保管人员工作变动时应作好交接工作。
4。
3 菌种的使用和保存4。
3.1菌种的类别4.3.1。
1实验室内的标准菌种根据用途不同，分为储存菌种、传代用菌种和工作用菌种。
标准菌株使用标准操作规程
标准菌株使用标准操作规程1 检验目的对实验室的标准菌株进行合理的保存，并规范合理的使用流程，保证菌株的性能稳定可靠。
2 范围微生物实验室保存的标准菌株。
3 职责微生物组工作人员正确执行本操作规程。
4 术语和定义4.1标准菌株其特征进行了分类和描述，有明确的来源。
ATCC（American Type Culture Collection）美国标准菌株收藏中心。
4.2标准储备菌株标准菌株经过一代转接后获得的同种菌株。
4.3 工作菌株标准储备菌株传代后得到的同种菌株。
4.4 标准培养物标准菌株、标准储备菌株、工作菌株的统称。
4.5质控菌株ATCC最佳，但当无法获得时可以使用ATCC演化的菌株或我国国家菌种库储存的标准菌株。
特殊情况，例如定性试验可用已知的菌种作为质控菌株。
室间质评的菌株即可。
5 保存程序5.1标准菌株5.1.1商业购买的ATCC标准菌株干粉，-80℃低温保存，可以2年以上。
安瓿真空包装的，-80℃可长期稳定保存。
将标准菌株进行编号和登记。
5.1.2复苏用1ml无菌的小牛血清或营养肉汤溶解。
根据菌种的生长特点，接种到新鲜培养基上选择适宜的培养条件培养18-24h。
酵母菌要求3天，形成孢子的微生物宜保存孢子。
5.2标准储备菌株5.2.1由复苏后的ATCC标准菌株制备。
复苏后的标准菌株要检查其纯度，必要时进行生化试验检查。
刮取培养物上的菌体，用足量的菌悬浮于防冻培养基中。
防冻液可以是无菌脱纤维羊血、10%甘油肉汤。
储存足够量的标准储备菌株，可用1-2年。
一年52周需要52支以上。
5.2.2甘油肉汤保存法成分有蛋白胨、牛肉浸出粉、氯化钠、甘油、纯化木。
相当于20%的甘油。
挑取5环菌落加入到1ml甘油肉汤中混匀。
苛养菌可以适当增加菌量。
-80℃保存。
除链球菌和嗜血杆菌以外细菌均可使用。
保存期限1-5年。
5.2.3全血保存法成分为脱纤维羊血。
挑取5环菌落加入到1ml甘油肉汤中混匀。
苛养菌可以适当增加菌量。
菌种的保藏方法
• 一般可保藏一年或更长。
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低温保藏法(-20℃)
• 将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞接到 试管内，然后贮藏于温度范围在-5～-20℃的普通 冰箱(-20℃)中。或者，将菌种培养在小的试管或 培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡 胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。
• 在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是： 1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞； 2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞； 3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜； 4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超
低温冰箱中保藏。
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• 如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10％ 甘油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰 箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／min。若干细 菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活 力不受影响。
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穿刺保藏法
• 操作：将菌种穿刺接种于半固体培养基上，然后覆盖2－3mm的 液体石蜡，放入冰箱4℃保藏。一方面可防止因培养基水分蒸发 而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。
• 此法实用而效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不 死，酵母菌可保藏1—2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右。 特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢 子的担子菌等的保藏更为有效。此法的优点是制作简单，不需 特殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所 占位置较大，同时也不便携带。
• 当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质 粒的细胞群体的极有用的生长选择压。而且在运用基因工 程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染 色体复制的协调。
Thermo ATCC粪肠球菌标准菌株使用说明书(译)
ATCC粪肠球菌质控菌株使用说明书（英译中）使用本品可以直接使用，一次性接种环里包含稳定的活性微生物，一次性接种环可以应用于培养基、诊断试剂盒及试剂的性能验证、细菌盲种及方法学验证。
描述每个包装内含5个接种环，每个接种环独立包装。
保存保存于2-8度。
随用随取，保质期内，接种环内微生物特性稳定。
打开在包装标签指示处，剪开。
变质保持干燥，潮湿后停止使用。
操作每个接种环上的标本均为明胶干燥而成，须在保温保湿的环境下复溶。
直接在选择性培养基上接种可能会导致生长缓慢，若需接种在选择性培养基上，需先在非选择性培养基上培养，如血琼脂平板，等有可见菌落形成后再转种。
以下两种方法可以用于接种培养，根据不同的微生物选择正确的方法。
直接划线接种该方法适用于无特殊营养要求的微生物培养。
1.把平板温浴到35-37度；2.拿掉接种环上的保护套；3.把接种环插入或平放于培养基表面，使接种环表面充分湿润，保持10-15S使之充分吸收水分。
4.使用最常用的方法划线接种，每个接种环可以划5块板。
5.将平板放置于最佳的空气和温度环境进行培养。
间接（肉汤）培养法该方法适用于对培养基有特殊营养要求的细菌。
1.拿掉接种环保护套。
2.使用无菌剪刀剪下接种环，放置于含有0.5-1.0ml液体培养基的瓶子中，液体培养基包括以下成分：a.胰蛋白胨大豆琼脂或新鲜无菌的硫代硫酸盐用于细菌培养；b.灭菌生理盐水用于真菌培养。
3.将瓶子放于35-37度使接种环上的标本膜充分溶解，轻轻摇动瓶子使细菌分散开来。
4.使用无菌吸头，在培养基上滴加几滴标本，划线接种。
5.将接种好的培养基放置于最佳的气体和温度环境中培养。
合适条件下，大多数细菌均能在24-48h内培养出来，少数细菌会有明显的生长滞后，需追加培养24h。
注释：接种环上的微生物为ATCC原代培养物。
参考文献........接种环商标解释权归 Remel Inc.,Remel Inc.属于 Themo Fisher 科技公司的子公司。
菌株的保藏机构名词解释
菌株的保藏机构名词解释在生物学领域中，菌株保藏机构扮演着非常重要的角色。
它们是研究者们进行微生物研究、保持和交流菌株的机构。
本文将解释菌株保藏机构的概念、作用和分类，并介绍一些国内外知名的保藏机构。
一、菌株保藏机构的概念与作用菌株保藏机构是专门负责收集、保存和管理微生物菌株的机构。
它们的主要任务包括保藏和管理菌株资源、提供菌株样品的质量控制、促进国际间的菌株交流与合作等。
这些机构不仅有效保护了珍贵的微生物资源，也为微生物学研究提供了便利。
菌株保藏机构的建立和运作需要遵循严谨规范的机构管理制度和规章制度。
一般来说，它们要定期检测和鉴定菌株的纯度和活力，并采取适当的保存方式，如低温冷冻或液氮冷冻。
这些措施确保了保存菌株的长期稳定性和可利用性，对于长期研究、物种鉴定、药物研发等方面有着重要作用。
二、菌株保藏机构的分类菌株保藏机构可按照所属机构类型、服务对象和保藏方式等多种标准进行分类。
根据所属机构类型的不同，菌株保藏机构可以分为学术机构、政府机构和企业机构等。
学术机构主要为研究者、学术界和科研机构提供服务，政府机构则服务于政府部门，而企业机构通常专注于商业化服务。
根据服务对象的不同，菌株保藏机构可以分为国际机构、国家机构和地区机构等。
国际机构在国际间开展菌株保藏服务和交流，国家机构服务于国内的研究者和机构，地区机构则主要为特定地区的科研机构和企业提供服务。
根据保藏方式的不同，菌株保藏机构可以分为活菌保藏机构和冷冻保存机构。
活菌保藏机构主要保存活菌株，并提供活菌样品的配送服务。
冷冻保存机构则主要保存冷冻保存样品，例如通过低温冷冻或液氮冷冻等方式进行菌株保存。
三、国内外知名的菌株保藏机构1. 中国菌种保藏研究中心（China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC）CGMCC成立于1986年，是中国最早成立的菌种保藏机构之一。
它是国家级的综合性菌种保藏机构，致力于微生物菌株的收集、鉴定、保存和提供多种服务，包括分离培养、提供纯菌株、技术咨询和科研支持等。
ATCC菌株使用说明
采用适合的生物危害处理法 丢弃 KWIK-STIKTM
用一无菌接种环在先前接种区 挤压并旋转拭子， 接种于初级培 养平板，接种圈的直径约 25mm 域划线 10-20 次，促使其分离出 单菌落
立即培养接种好 的初级培养平板081
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MBL 技术资料
TIB.081
推荐生长条件
念珠菌属 噬二氧化碳菌属 纤维微细菌 金黄杆菌属 柠檬酸杆菌属 枝孢霉属 梭菌属
方法 5 方法 3 方法 1 方法 1 方法 1 方法 5 方法 4
Actinobacillus sp. Actinomyces sp. Aerococcus sp. Aeromonas sp.
放线杆菌属 放线菌属 气球菌属 气单胞菌属
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2.
方法 1 标准计数平 � 胰蛋白胨大豆琼脂，非选择性羊血琼脂， 板，或营养琼脂-----35℃，正常环境，24-48 小时。 方法 2 � 非选择性羊血琼脂----- 35℃，正常环境，24-48 小时 。 方法 3 � 巧克力琼脂（含血红蛋白和NAD）-----35℃，5％－ 10％ CO2环境，24-48小时。 方法 4 � 厌氧血琼脂-----35℃，厌氧环境，48-72 小时； � 部分专性厌氧菌可能需要 5－7 天，才能充 分 生 长 ； � 对于梭菌，以下新鲜配制的平板也可选用：营养琼 脂， 胰蛋白胨大豆琼脂和标准平板计数琼脂(标准方 法琼脂)；只是需额外培养 24 小时。 方法 5 � 沙保氏葡萄糖 Emmons 琼脂-----25℃，正常环境，2-7 天； � 沙保氏葡萄糖琼脂-----25℃，正常环境，2-7 天； � 非选择性羊血琼脂也可选用； � 以下培养基也可选用：营养琼脂，胰蛋白胨大豆琼 脂，马铃薯葡萄糖琼脂和标准平板计数琼脂，只是 需额外培养 24 小时。 方法 6 � 巧克力琼脂（含血红蛋白和 NAD）-----35℃，微需 氧环境，48-72 小时。 方法 7 � Lowenstein Jensen 琼 脂 或 Middlebrook 琼 脂 ----35℃，5％－10％ CO2 环境或正常环境，7 天。
实验室菌种的保藏方法
实验室菌种的保藏方法一、甘油悬液保藏法此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。
保藏温度若采用-20℃，保藏期约为0.5～1年，而采用-70℃，保藏期可达10年。
将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经121℃蒸汽灭菌20min的甘油混合，并使甘油的终浓度在10％～15％，再分装于小离心管中，置低温冰箱中保藏。
基因工程菌常采用本法保藏。
二、冷冻真空干燥保藏法冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。
它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。
并在真空条件下立即融封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。
常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。
由于此法同时具备低温、干燥、缺氧的菌种保藏条件，因此保藏期长，一般达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。
除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外，其他大多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用这种保藏方法。
但该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。
保藏菌种需用时，可在无菌环境下开启安瓿管，将无菌的培养基注入安瓿管中，固体菌块溶解后，摇匀复水，然后将其接种于适宜该菌种生长的斜面上适温培养即可。
三、液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。
它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（-196℃）下保藏的方法。
其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。
美国ATCC菌种保藏中心采用该法时，把菌悬液或带菌丝的琼脂块经控制致冷速度，以每分钟下降1℃/min的速度从0℃直降到-35℃，然后保藏在-150℃～-196℃液氮冷箱中。
菌种传代与保藏
菌种传代与保藏
菌种保藏的原则
根据微生物生理、生化特点，人工创造条件，主要是
低温、干燥、缺氧三者，使微生物的代谢处于不活泼、 生长繁殖受抑制的休眠状态，以达到保持纯种优良性 状的目的。
菌种传代与保藏
长期保藏法： -80℃低温保藏法 真空冷冻干燥法 液氮超低温保藏法 沙土管保藏法
菌种传代与保藏
菌种传代与保藏
标准菌株主要来源 美国菌种保藏中心（ATCC） American Type Culture Collection Center 中国普通微生物菌株保藏中心（CGMCC） China General Microbiological Culture
Collection Center 工业微生物菌种保藏管理中心（CICC） China Center for Industrial Culture Collection 中国医学微生物菌种保藏中心（CMCC） China Center for Medical Culture Collection
5.6.3.4 实验室应有程序和措施以保证标准菌种的安 全，防止污染、丢失或损坏，确保其完整性（具体措 施）。
谢谢！
菌种都应注明 ：名称、标准号、接种日期、传代数、 操作者； 菌种使用记录，流转记录。 销毁记录
菌种传代与保藏
菌种保藏管理要求相关标准： 《病原微生物实验室生物安全管理条例》 GB 19489—2008 实验室生物安全通用要求 GB/T 27405-2008 实验室质量控制规范 食品微生物检测 CNAS CL05 实验室生物安全认可准则 CNAS-CL09 实验室认可准则在微生物检测实验室的应用说
短期保藏法： 传代培养保藏法 液体石蜡保藏法
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LYFO DISK 操作流程
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KwikKwik-Stik & Lyfo Disk 推荐生长条件
如何选择最适合的菌种生长条件
1.最初的生长最好是在非选择性琼脂培养基上。 1.最初的生长最好是在非选择性琼脂培养基上。 最初的生长最好是在非选择性琼脂培养基上 除非特殊情况或特别推荐， 除非特殊情况或特别推荐，最初的生长一般不 考虑液体培养基。 考虑液体培养基。这是由于在液体培养基中获 得冻干菌株的纯种比较困难，污染所带来的杂 得冻干菌株的纯种比较困难， 菌可能会过度生长，影响得到目标菌株的纯种。 菌可能会过度生长，影响得到目标菌株的纯种。 2、以下列出可供选择的琼脂培养基和相应的 生长条件，供各实验室培养菌种时参考。 生长条件，供各实验室培养菌种时参考。
方法12 方法12
马铃薯葡萄糖琼脂——55℃ 正常环境，48小 马铃薯葡萄糖琼脂——55℃,正常环境，48小 时。
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简介与说明： 简介与说明：
微生物的长期保存是一个挑战，生物需要低温贮存并 微生物的长期保存是一个挑战， 尽量提供最少干扰的可能性。然而， 尽量提供最少干扰的可能性。然而，Microbank™ 提供了一种保存液来应对对这个问题。 提供了一种保存液来应对对这个问题。
用途： 用途：
标记颜色的25 标记颜色的25 个小珠被包装容纳在包含保存剂的保 存管里，小珠被冲洗和吸附细菌在上面， 存管里，小珠被冲洗和吸附细菌在上面，之后保存管 在贮存期内保持在-70° 当需要培养， 在贮存期内保持在-70°C，当需要培养，单个小珠 很简单的移出保存管，并直接划线在微生物培养基上。 很简单的移出保存管，并直接划线在微生物培养基上。
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方法1 方法1
胰蛋白胨大豆琼脂，非选择性羊血琼脂，标准计数平 胰蛋白胨大豆琼脂，非选择性羊血琼脂， 或营养琼脂——35℃ 正常环境，24-48小时 小时。 板，或营养琼脂——35℃,正常环境，24-48小时。
方法2 方法2
非选择性羊血琼脂——35℃ 正常环境，24~48小 非选择性羊血琼脂——35℃，正常环境，24~48小 在培养链球菌属和隐秘杆菌属时，CO2环境可提 时。在培养链球菌属和隐秘杆菌属时，CO2环境可提 高其生长。推荐使用5%CO2环境来培养肺炎链球菌 高其生长。推荐使用5%CO2环境来培养肺炎链球菌 和其他甲型溶血性链球菌。 和其他甲型溶血性链球菌。
方法3 方法3
巧克力琼脂——35℃ 5%~10%的CO2环境 巧克力琼脂——35℃，5%~10%的CO2环境， 环境， 24-48小时。 24-48小时 小时。
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方法4 方法4
厌氧血琼脂——35℃ 厌氧环境，48-72小时； 厌氧血琼脂——35℃，厌氧环境，48-72小时； 小时 部分专性厌氧菌可能需要5~7天 才能充分生长； 部分专性厌氧菌可能需要5~7天，才能充分生长； 对于梭菌，以下新鲜配制的平板也可选用：营养琼脂， 对于梭菌，以下新鲜配制的平板也可选用：营养琼脂， 胰蛋白胨大豆琼脂和标准平板计数琼脂( 胰蛋白胨大豆琼脂和标准平板计数琼脂(标准方法琼 只是需额外培养24小时 小时。 脂)；只是需额外培养24小时。
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方法10 方法10
菌种水解可选用无菌脑心浸出液肉汤，胰蛋白 菌种水解可选用无菌脑心浸出液肉汤， 胨大豆肉汤， 0.85%生理盐水 生理盐水。 胨大豆肉汤，或0.85%生理盐水。无菌水水 解可能会导致活力下降或不复苏。 KWIK解可能会导致活力下降或不复苏。在KWIKSTIK包装中自带的培养基使得菌种很好的复 STIK包装中自带的培养基使得菌种很好的复 苏。 在胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)上生长 上生长——35℃ 在胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)上生长——35℃， 正常环境，24-48小时 小时。 SP.也可在 正常环境，24-48小时。Vibro SP.也可在 Marine琼脂上生长 Marine琼脂上生长
方法5 方法5
沙保氏葡萄糖 Emmons琼脂——25℃，正常 环 境 ， Emmons琼脂 琼脂——25℃ 2~7天 2~7天； 非选择性羊血琼脂也可选用 ； 以下培养基也可选用：营养琼脂，胰蛋白胨大豆琼脂， 以下培养基也可选用：营养琼脂，胰蛋白胨大豆琼脂， 马铃薯 葡萄糖琼脂和标准平板计数琼脂 ，只是需额 外培养24小时 小时。 外培养24小时。
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方法8 方法8
缓冲活性炭酵母提取物琼脂——35℃ 缓冲活性炭酵母提取物琼脂——35℃，正常 环境， 环境，3-5天。
方法9 方法9
V琼脂或巧克力琼脂——35℃，5%~10%， 琼脂或巧克力琼脂——35℃ 5%~10%， CO2环境 48小时 CO2环境，48小时。 环境， 小时。
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各类菌种推荐培养方法
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方法6 方法6
巧克力琼脂——35℃ 微需氧环境，48-72小时 巧克力琼脂——35℃，微需氧环境，48-72小时。 小时。
方法7 方法7
Lowenstein Jensen琼脂或Middlebrook琼脂— Jensen琼脂或 琼脂或Middlebrook琼脂 琼脂— —35℃，5%~10%CO2环境或正常环境，7天。 35℃ 5%~10%CO2环境或正常环境 环境或正常环境， M. fortuitum subsp. fortuitum, M. peregrium 和M. smcgmatis也可以选用胰蛋白 smcgmatis也可以选用胰蛋白 胨大豆琼脂(TSA)和 Jensen琼脂或 胨大豆琼脂(TSA)和Lowenstein Jensen琼脂或 Middlebrook琼脂一样 只是需额外培养一些时间。 Middlebrook琼脂一样，只是需额外培养一些时间。 琼脂一样，
储存不正确; 储存不正确; 有过度暴露在湿热环境中的迹象; 有过度暴露在湿热环境中的迹象; 己过有效期。
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Microorganisms公司产品 Microorganisms公司产品
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操作步骤 A．准备
1．使用一个准备的标签，管上条码，每管接种一个 使用一个准备的标签，管上条码， 生物。（也可以看步骤6 。（也可以看步骤 生物。（也可以看步骤6）。 2．在无菌的条件下打开小管的盖。 在无菌的条件下打开小管的盖。 3．将纯培养的小菌落（18-24h 培养）挑取3-4 个 将纯培养的小菌落（18培养）挑取3 麦氏管缓冲液接种到液体保存剂中。 麦氏管缓冲液接种到液体保存剂中。 4．盖好瓶盖并颠倒4-5 次以吸附微生物，不要旋涡。 盖好瓶盖并颠倒4 次以吸附微生物，不要旋涡。 5、此时微生物将被吸附到小珠，这缓冲液需倒掉使 此时微生物将被吸附到小珠， 接种小珠尽可能无液体，盖上瓶盖。 接种小珠尽可能无液体，盖上瓶盖。 6、在瓶上提供的培养条码做下记录或其它的记录。 在瓶上提供的培养条码做下记录或其它的记录。 7、贮存接种的冻存管在-70℃为了最好长期效果。 贮存接种的冻存管在-70℃为了最好长期效果。
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储存与有效期 Storage and expiration
在原装密封瓶或含干燥剂的袋中的 KWIKKWIK-STIKTM应存放在2℃~8℃。 应存放在2 ~8℃ 冻干的微生物制剂在有效期内将保持其规 格和性能，有效期在设备标签上标明。 格和性能，有效期在设备标签上标明。 若出现以下情况则不能使用： 若出现以下情况则不能使用：
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微生物实验室需有相关实验装备，且有可接收、 处理、储存、丢弃生物危害材料的设备。 使用这类设备的微生物实验室工作人员必须在 生物危害材料的操作过程，维护，储存，丢弃 等方面接受过培训，具备一定经验，能熟练示 范。 相关机构和法规对生物危害材料的处理作了规 定。各实验室需了解并遵守该生物危害 材料 处理规定。
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方法11 方法11
先接种于MRS肉汤中 先接种于MRS肉汤中——35℃，正常环境， 肉汤中——35℃ 正常环境， 48小时; 48小时 小时; 然后接入含羊血的哥伦比亚CNA培养基中 CNA培养基中— 然后接入含羊血的哥伦比亚CNA培养基中— —35℃，5-10%CO2环境，48小时。 35℃ 10%CO2环境 48小时 环境， 小时。
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ATCC标准菌种 ATCC标准菌种 复苏与使用指南
“KWIK“KWIK-STIK Microorganisms” 产品的使用说明
防范与限制 Precaution and Limitation 这类产品仅适用于体外实验。 这些设备以及后来在培养基上生长出的微生物属 生物危害材料 这些设备含具有活性的微生物，在一定的环境下 可能致病。需使用适当的技术避免任何微生物的 暴露和接触。
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