2.2土壤植酸酶测定
植酸酶
1.分析意义
植酸酶参与土壤含磷化合物的主要部分——植素及其衍生物的脱磷酸化作用。水解作用产物是植物的磷源。
2.测定原理
土壤植酸酶催化肌醇六磷酸化合物，水解成肌醇和六分子的磷酸。测定植酸酶常以植酸钠为基质，以酶解所产生的无机磷量表示酶活性。
3.试剂配制
（1）植酸钠溶液：植酸钠由植素制备。取50g纯植素，溶于2%盐酸中，加浓三氯化铁溶液至微黄色，使之以铁盐的形式沉淀，将析出的植酸铁白色沉淀移在大瓷漏斗上减压抽滤，并用2%盐酸（约4L）洗涤漏斗，以除去植素的衍生物。将沉淀悬浮于水中并用氢氧化钠水解。滤去析出的氢氧化铁沉淀。滤液中参与的氢氧化钠用盐酸中和。然后，用过量的（CH3COOH)2Cu溶液处理，使植酸盐以铜盐的形式沉淀出来。滤出沉淀，仔细用热水洗涤，悬浮于水，并通入硫化氢（H2S）使之分解。滤去析出的CuS，滤液中过量的H2S，通过加热蒸发除去（12h）。所得的植酸溶液，用NaOH处理至pH8.0。最后测定制剂中肌醇与磷酸的比值，以检查植酸钠的纯度，理论上的比值为0.968。
测出植酸钠溶液中磷含量后，用HCl滴定该溶液至pH 5.0，然后用水稀释至1ml含0.25mg P2O5。
（2）甲苯。
（3）钼酸铵溶液：25g钼酸铵加热溶于200ml蒸馏水中。另取1L容量瓶加500ml水，再慢慢加入280ml浓H2SO4，再将钼酸铵溶液加入，随加随摇匀，定容至1L，贮于棕色瓶中。
（4）（NH4)2SO4-H2SO4溶液：取3g（NH4)2SO4加20ml 0.1N H2SO4，溶于1L蒸馏水中。
（5）氯化亚锡溶液：取2.5g SnCl2·2H2O溶于100ml 10%HCl中。
（6）磷的标准溶液：准确称取0.4392g KH2PO4，溶于1L水中即标准液。再稀释10倍得1ml含0.01g磷的工作液。
标准曲线的绘制：分别取1、3、5、7、9、11ml磷工作液移于50ml容量瓶中，加30ml 蒸馏水和2ml钼酸铵液，摇匀加入3滴氯化亚锡液，显色后稀释至刻度，摇匀并在分光光度计上于650nm处比色测定。以光密度为纵坐标，磷的浓度为横坐标，绘制标准曲线。
4.操作步骤
称5g土壤置于100ml三角瓶中，加1ml甲苯，15min后再加10ml植酸钠溶液，于37℃恒温箱中放置24h。
培养结束后，加50ml（NH4)2SO4-H2SO4溶液在振荡机上震荡提取50min。过滤后吸取10ml滤液，置于50ml容量瓶中。按绘制标准曲线的显色方法比色测定。
由标准曲线查出含量（P2O5 mg）表示植酸酶活性。
土壤中性蛋白酶检测试剂盒说明书
货号: QS2909 规格：50管/24样 土壤中性蛋白酶检测试剂盒说明书 可见分光光度法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： 土壤蛋白酶参与土壤中存在的氨基酸、蛋白质以及其他含蛋白质氮的有机化合物的转化，其水解产物是高等植物的氮源之一。S-NPT在中性环境下催化蛋白质水解，与土壤有机质含量、氮素及其他土壤性质有关。 测定原理： 中性条件下，S-NPT可将酪蛋白水解产生酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝；在680nm有特征吸收峰。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1ml玻璃比色皿、蒸馏水 试剂组成和配置： 试剂一：液体60mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入10ml蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂4℃保存； 试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入100uL试剂七使粉剂润湿，然后加入20ml试剂一，转入烧杯中沸水浴磁力搅拌溶解后待用；用不完的试剂4℃保存； 试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入50ml蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂4℃保存； 试剂五：液体10mL×1瓶，4℃保存； 试剂六：液体1.5mL×1支，0.05mg/ml标准酪氨酸溶液，4℃避光保存； 试剂七：液体1.5mL×1支，4℃保存； 测定操作： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至680nm，蒸馏水调零。 2、试剂二、三和四40℃水浴10min。 第1页，共2页
注意：标准管只需测一次。每个测定管设一个对照管。 S-NPT活性计算： 单位定义：每天每g土样中产生1mg酪氨酸为一个 S-NPT活力单位。 S-NPT(mg/d/g)=C标准×(A测定管-A对照管)÷A标准管×V反总÷W÷T=48×(A测定管-A对照管)÷A标准管 C标准管：标准管浓度，0.05mg/mL；V反总：反应体系总体积，0.4mL；T：反应时间，30min=1/48d；W：样本质量，0.02g。 第2页，共2页
实验一 土壤渗透性的测定
实验一土壤渗透性的测定 目的要求 径流对土壤的侵蚀能力主要取决于地表径流量，而透水性强的土壤往往在很大程度上减少地表径流量。土壤透水性强弱常用渗透率（或渗透系数）表示。当渗透量达到一个恒定值时的入渗量即为稳渗系数。通过本次实验，掌握测定土壤渗透性的基本原理和操作方法。 基本原理 由图可以看出，在降雨初期一段时间（几分钟）内，土壤渗透速率较高，降雨量全部渗入土壤，此时土壤的渗透速率和降水速率等值，没有地表径流产生。随着降雨时间延长、土壤含水量增高，渗透速率逐渐降低，当渗透速率小于降水速率时，地表产生径流。 仪器设备 环刀(200cm3,h5.2,Φ7.0cm)，量筒(100及50ml)，烧杯(100ml)，漏斗、漏斗架、秒表等。 方法步骤 一、在室外用环刀取原状土，带回实验室内，将环刀上、下盖取下，下端换上有网孔且垫有滤纸的底盖并将该端浸入水中，同时注意水面不要超过环刀上沿。一般砂土浸4～6h，壤土浸8～12h，粘土浸24h。 二、到预定时间将环刀取出，在上端套上一个空环刀，接口处先用胶布封好，再用熔蜡粘合，严防从接口处漏水，然后将结合的环刀放在漏斗上，架上漏斗架，漏斗下面承接有烧杯。 三、往上面的空环刀中加水，水层5cm，加水后从漏斗滴下第一滴水时开始计时，以后每隔1，2，3，5，10，……t i……t n min更换漏斗下的烧杯(间隔时间的长短，视渗透快慢而定，注意要保持一定压力梯度)分别量出渗入量Q1，Q2，Q3，Q5……Q n。每更换一次烧杯要将上面环刀中水面加至原来高度，同时记录水温(℃)。 四、试验一般时间约1h，渗水开始稳定，否则需继续观察到单位时间内渗出水量相等时为止。
木瓜蛋白酶活力测定方法
木瓜蛋白酶活力测定方法 分别精密量取酪蛋白溶液5ml，置3支具塞试管中，置40℃水浴中保温10分钟，各精密加入供试品溶液2ml，摇匀，置40℃水浴中，开始记时，准确反应1小时，立即精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，置40℃水浴中放置30~40分钟，使沉淀的蛋白质完全凝固，滤过，滤液作为供试品溶液。精密量取酪蛋白溶液5ml置另一具试管，于40℃水浴中保温1小时，精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，精密加入供试品溶液2ml，置40℃水浴中放置30~40分钟，滤过，滤液作为空白溶液。照分光光度法（中国药典2000年版二部附录IV A），以0.1mol/L 盐酸溶液为空白，在275nm的波长处测定空白溶液、供试品溶液和对照品溶液的吸收度，按下式计算： 效价（单位/mg）=A/As＊Cs＊12/2＊稀释倍数/W 式中A为供试品溶液的吸收度减去空白溶液的吸收度： As为酪氨酸对照品溶液的吸收度： Cs为酪氨酸对照品溶液的浓度， ug/ml W为供试品重量，mg; 在上述条件下，释放1ug的酪氨酸的酶量为一个活力单位。 试剂酪蛋白溶液：取酪蛋白1g，加0.05mol/L磷酸氢二钠溶液50ml,置沸水浴中煮30分钟，时时搅拌，冷至室温，加0.05mol/L枸椽酸溶液调节PH至6.0±0.1，并迅速搅拌，防止酪蛋白沉淀，用水稀释至100ml（临用新配）。酶稀释液：取无水磷酸氢二钠3.55g，加水400ml溶解，加乙二胺四醋酸二钠1.1g和盐酸半胱氨酸2.74g，振摇溶解，用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节PH6.5±0.1，用水稀释至500ml,混匀（临用新配）三氯醋酸溶液:取三氯醋酸17.99g，加醋酸钠29.94g和冰醋酸18.9ml，加适量水溶解后，加水使成1000ml，摇匀。 酶活力测定对照品溶液的制备:精密称取已105℃干燥至恒重的酪氨酸对照品适量，用0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml中约含40ug的溶液。供试品溶液的制备:取本品适量（约相当于木瓜酶活力120万单位），精密称定，加酶稀释液振摇，制成每1ml中含200~300单位的溶液，摇匀。 淀粉酶活力测定 实验技术 2008-05-27 18:01:29 阅读213 评论0字号：大中小 一、目的 淀粉是葡萄糖以α-1,4糖苷键及α-1，6 糖苷键连结的高分子多糖，是人类和动物的重要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、 纺织工业的基本原料。 淀粉酶是加水分解淀粉的酶的总称，淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的依 据，也是生物体利用淀粉进行代谢的初级反应。小麦成熟期如遇阴雨天气，有的品种会发生
植酸酶活性测定方法的研究进展
中国饲料2010年第20期 植酸酶广泛存在于动物、植物和微生物中，能将植酸分解为肌醇和无机磷的一类磷酸单脂水解酶。文章介绍了植酸酶活性的测定方法，除了以前的传统方法外，近10多年植酸酶活性检测出现了许多新的方法，如近红外光谱法、琼脂平板法、酶联免疫吸附法、生物传感器法、高效液相色谱法等，这些新方法为植酸酶活性测定开辟了新的检测途径。 1植酸酶活性测定方法的发展及意义 1.1植酸酶活性测定方法的发展植酸酶发现至今已经有100余年，植酸酶的研究已经取得了丰硕的成果。回顾植酸酶活性的测定方法：1925年Fiske-SubbaRow法，即钼黄法，因由Fiske和SubbaRow两人发现，所以早期钼黄法也叫Fiske-SubbaRow法；1943年Holman等发现了硫酸亚铁-钼蓝法，曾在国外许多国家发展为植酸酶测定的标准方法，至今还在许多研究中采用（Fu等，2008；Huang等，2008）；1981年Heinonen和Lahti 建立了丙酮-磷钼酸铵法。植酸酶活性的测定方法除了这些传统的方法外，近10多年来随着科学技术和检测手段的提高，植酸酶活性分析检测及标准化方面出现了许多新的方法，并颁布了新的标准，如近红外光谱法（NIR）、琼脂平板法、酶联免疫吸附法（ELISA）、生物传感器法、反相高效液相色谱法（RP-HPLC）等。 1.2植酸酶活性测定意义植酸酶没有特定光吸收波和鉴定试剂，所以植酸酶的分析和活性测定比较困难（Lasztity等，1990）。动、植物植酸酶的提取、分离纯化，微生物植酸酶菌株的筛选，基因工程植酸酶表达产物等研究中都需要测定植酸酶活性。随着植酸酶在饲料中的广泛应用，饲料管理部门、饲料质检机构、科研部门以及生产企业均面临植酸酶定量测定的工作。目前存在着植酸酶酶活单位混乱、检测手段落后，测定结果误差大等一些问题，所以规范植酸酶酶活性定义和检测方法势在必行。 植酸酶活性的定义方法主要有以下几种：（1）酶活定义为每分钟从一定浓度的植酸钠溶液中释放1μmol的无机磷为一个酶活单位。（2）酶活定义为每分钟从一定浓度的植酸钠溶液中释放1 nmol的无机磷为一个酶活单位。（3）酶活定义为每秒钟从一定浓度的植酸钠溶液中释放1nmol 的无机磷为一个酶活单位。（4）酶活定义为每小时从一定浓度的植酸钠溶液中释放1mg的无机磷为一个酶活单位。这四种定义中第一种的酶活单位最大，国外采用此种单位较多，我们称之为国际单位；第二种酶活单位是第一种的1000倍；第三种为第一种酶活单位的17倍；第四种与第一种酶活单位大小相近。 目前，植酸酶活性单位大多用FTU（fytase u-nit）表示。植酸酶样品在植酸钠浓度为5.0mmol/L、温度37℃、pH值5.50的条件下，每分钟从植酸钠中释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。1994年该标准被AOAC（美国公定 植酸酶活性测定方法的研究进展 陕西理工学院陈琛 [摘要]本文综述了植酸酶的分析测定方法，包括传统的分光光度法及近年来新发展起来的近红外光谱法、琼脂平板法、酶联免疫吸附法、生物传感器法、反相高效液相色谱法等。 [关键词]植酸酶；测定方法；活性 [中图分类号]S816.17[文献标识码]A[文章编号]1004-3314（2010）20-0016-03 [Abstract]This article gave a review on determination methods of phytase activity.These methods include traditional spectrophotometry，near infrared spectroscopy，enzyme-linked immunosorbent assay，agar plate assay，biosensor method re-versed-phase high performance liquid chromatography. [Key words]phytase；method for determining enzyme activity；activity 16
蛋白酶产生菌的分离汇总讲解
蛋白酶产生菌的分离、活化选育、发酵及酶活力的测定 许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其它微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈做初筛。也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其它蛋白酶产生菌。本实验主要包括：蛋白酶产生菌的分离纯化、产酶微生物菌种的选育、产酶微生物的发酵与酶活力的测定、蛋白酶产生菌的生长及生长曲线、培养基优化。 通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离蛋白酶产生菌的方法，菌种的纯化技术、高产菌的选育技术；了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线；学会培养基优化的方法；了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理；掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法。 1 实验材料 1.1 实验样品 校园内土壤样品 1.2实验仪器与材料 牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液番红；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、血球计数板、试管、三角烧瓶、烧杯、量筒、，玻棒、电子天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸（ pH 5．5—9．0）、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、培养皿、胶头滴管、分光光度计（应符合GB9721的规定）等。 2实验方法与步骤 2.1 培养基的配制方法 1.称量 按培养基配方比例依次准确地称药品放入烧杯中。 2.溶化 在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。 3.调pH 4.分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。 5．包扎 塞好棉花的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆扎，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
土壤饱和导水率测定——环刀法
土壤饱和导水率测定——环刀法 1．测定意义： 土壤饱和导水率（土壤渗透率）：单位水势梯度下水分通过垂直于水流方向的单位截面积饱和土壤水的流速。土壤处水饱和状态时，便需用饱和导水率计算其通量。饱和导水率也是土壤最大可能导水率，常以它作为参比量，比较不同湿度条件下土壤的导水性能。 土壤渗透性是土壤重要的特性之一，它与大气降水和灌溉水几乎完全进入土壤，并在其中贮存起来，而在渗透性不好的情况下，水分就沿土表流走，造成侵蚀。饱和导水率（渗透系数）与土壤孔隙数量、土壤质地、结构、盐分含量、含水量和温度等有关。 2.测定原理 土壤饱和导水率系在单位水压梯度下，通过垂直于水流方向的单位土壤截面积的水流速度，又称土壤渗透系数。本法可在田间进行测定，但易受下层土体性质的影响。在饱和水分的土壤中，土壤饱和导水率（渗透系数）根据达西（H. Darcy）定律： K=Q×L (1) S×t×h 公式中： K——饱和导水率（渗透系数），cm/s； Q——流量，渗透过一定截面积S（cm2）的水量，mL； L——饱和土层厚度，渗透经过的距离，cm； S——环刀横截面积，cm2； t——渗透过水量Q时所需的时间，s； h——水层厚度，水头（水位差），cm。 饱和导水率（渗透系数）K的量纲为cm/s或mm/min或cm/h或m/d。从达西定律可以看到，通过某一土层的水量，与其截面积、时间和水层厚度（水头）呈正比，与渗透经过的距离（饱和土层厚度）呈反比，所以饱和导水率（渗透系数）
是土壤所特有的常数。 3 .仪器 环刀（容积100cm3），量筒（100mL、10ml），烧杯（100mL），漏斗，秒表，温度计。 4. 操作步骤 4.1 在室外用环刀取原状土样，带回室内浸入水中。一般砂土浸4h~6h，壤土浸8 h~12h，粘土浸24h。浸水时要保持水面与环刀上口平齐，勿使水淹到环刀上口的土面。 4.2 在预定时间将环刀取出，除去盖子，在上面套上一个空环刀，接口处先用胶布封好，再用熔蜡粘合，严防从接口处漏水。然后将接合的环刀放到漏斗上，漏斗下面用100mL烧杯承接。 4.3 向上面的空环刀中加水，水面比环刀口低1mm，水层厚5cm。 4.4 加水后，自漏斗下面滴下第一滴水时用秒表计时，每隔1、2、3、5、10……tnmin更换漏斗下的烧杯（间隔时间的长短，视渗透快慢而定），并分别用100mL或10mL量筒计量渗出水量Q1、Q2、Q3……Qn。每更换一次烧杯，要将上面环刀水面加至原来高度，并用温度计记录水温。 4.5 试验一般持续时间约1h才开始稳定。如果仍不稳定，应继续延长时间直到单位时间内渗出水量相等时为止。 5．计算结果 5.1渗出水总量按式（2）计算： Q=(Q1+Q2+Q3+?+Qn)×10 (2) S 式中： Q——渗出水总量，mm； Q1、Q2、Q3……Qn——每次渗出水量，mL，即cm3； S——渗透筒的横截面积，cm2； 10——由cm换算成mm所乘倍数。
胰蛋白酶活性测定
实验一胰蛋白酶活性测定 实验目的：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。 实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）。 胰蛋白酶所催化的上述反应中，产物BA对253 nm 的光吸收远大于BAEE，因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零，然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量，并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标。 酶活单位定义：在底物BAEE浓度1m mol/L，光程1 cm，波长253nm，温度25 0C，测量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001（A/min=0.001）为1个BAEE酶活单位。 胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义： 胰蛋白酶含量一般E1%表达。这个值的含义是：浓度为1% 酶蛋白，在1cm光径下，对紫外280nm 的消光值。不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。E1% 值越高，表明酶制剂中酶蛋白含量越高。 由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时，按照厂家对产品的E1% 的测定值配制溶液。 在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采用SIGMA 公司生产的产品,生产公司对展品的描述是对280nm紫外吸收值15.3，配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。 器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器。试剂：标准胰蛋白酶，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯，HCI, Tris。 1．胰蛋白酶活性测定： 1）配制E1%的胰蛋白酶溶液
植酸酶活力的测定方法及应注意问题(精)
科技信息 植酸酶是催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸的一类酶的总称 [1]。植酸酶是一种胞外酶 [2], 广泛存在于自然界中, 植物、动物、微生物均可产生植酸酶。植酸酶的活性因来源不同而有差异。 植酸酶能将肌醇六磷酸 (植酸分解成为肌醇和磷酸。植酸酶可以专一性地水解植酸中的磷酯键, 使磷酸游离出来, 植酸酶将植酸分子上的 磷酸基团逐个切下, 形成中间产物肌醇五磷酸、肌醇四磷酸、肌醇三磷酸、肌醇二磷酸、肌醇一磷酸、终产物为肌醇和磷酸 [3] 。植酸酶的作用机理见图 1。 图 1植酸酶的作用机理 1. 植酸酶酶活力测定的意义酶活力也称酶活性, 是指酶催化一定化学反应的能力, 用在一定条件下, 酶所催化某一反应的速率表示。酶活性是研究酶的特性, 分离纯化以及酶制剂生产和应用时的一项不可缺少的指标。 酶活力单位是以酶活力为根据而定义的。国际生化协会酶委员会规定, 1min 内将1μmol 的底物转化为产物的酶量定为 1个单位,称为标准单位, 同时规定了酶作用的条件。因标准单位在实际应用时不够方便, 故在生产上往往根据不同的酶, 制定各自不同的酶活力单位。在测定酶活力时, 对反应温度、 pH 、底物浓度、作用时间都有统一规定, 以便同类产品互相比较。但是酶活力单位并不能直接反映酶的绝对数量, 只不过是一种相对比较的依据 [4]。 植酸酶活性的定义为:在最适宜条件下, 每分钟从一定浓度的植酸钠溶液中释放1μmol 的无机磷所需要的酶量为一个酶活力单位。确定植酸酶的酶活, 可以提高实验的标准性和效率。
2. 植酸酶活力测定的原理及方法 酶活力测定的原理都是利用酶水解植酸钠形成无机磷,然后测定无机磷的释放量。 植酸酶活性的测定方法较多 , 但至今尚没有被世界普遍公认的植酸酶的定量分析方法。方法包括:钒 -钼酸铵法、硫酸亚铁 -钼蓝法、 Vc-钼蓝法、丙酮 -磷钼酸铵法、微板法和微量比色法等 [5]。可根据实验需要选择不同的方法。 2.1钒 -钼酸铵法 该方法是利用植酸酶可以水解植酸磷释放出无机磷的原理。通过加入酸性钼-钒试剂使水解反应停止 , 同时与水解释放出来的无机磷产生颜色反应 , 形成黄色的钒钼磷络合物 , 在 415nm 波长下测定磷的含量。以标准植酸酶为参照物 , 间接计算被测样品中植酸酶的含量。本法于 1994年列入 AOAC, 我国也已将此法的测定结果作为审批商品植酸酶注册许可证和验收进口产品的法定商检依据。 2.2硫酸亚铁 -钼蓝法 该方法利用植酸酶可以水解植酸磷释放无机磷的原理 , 通过加入三盐酸使水解反应停止 , 然后加入钼酸铵及 FeSO 4·7H 20的混合液使溶液显色 , 在 720nm 波长下测定其吸收值 , 以标准酶为参照物 , 间接计算被测样品中植酸酶的含量。 2.3Vc-钼蓝法 该方法是利用植酸酶可以水解植酸磷释放无机磷的原理 , 通过加入三氯乙酸使反应停止 , 然后加入钼酸铵与 Vc 的混合液 , 使溶液显色 , 在 820nm 波长下测定吸光度 , 再以标准磷溶液的吸光度及磷溶液浓度对应的酶活单位建立直线回归方程 , 最后以待测样品吸光度代入方程 , 计算出酶活性。 2.4丙酮 -磷钼酸铵法
土壤蛋白酶测定
土壤蛋白酶测定（加勒斯江法） 1. 分析意义 蛋白酶参与土壤中存在的氨基酸、蛋白质以及其他含蛋白质氮的有机化合物的转化。它们的水解产物是高等植物的氮源之一。土壤蛋白酶在剖面中的分布与蔗糖酶相似，酶活性随剖面深度而减弱。并与土壤有机质含量、氮素及其他土壤性质有关。 2. 试验原理 蛋白酶能酶促蛋白物质水解成肽，肽进一步水解成氨基酸。 测定土壤蛋白酶常用的方法是比色法，根据蛋白酶酶促蛋白质产物－氨基酸与某些物质（如铜盐蓝色络合物或茚三酮等）生成带颜色络合物。依溶液颜色深浅程度与氨基酸含量的关系，求出氨基酸量，以表示蛋白酶活性。 3. 试验步骤 取2g过1mm筛的风干土置于50mL容量瓶中，加入10mL 1％用pH7.4磷酸盐缓冲溶液配制的白明胶溶液和0.5mL甲苯（作为抑菌剂抑制微生物活动）；在30℃恒温箱中培养24h；培养结束后，将瓶中内容物过滤；取5mL滤液置于试管中，加入0.5mL 0.1N硫酸和3mL 20％硫酸钠以沉淀蛋白质，然后滤入50mL容量瓶，并加入1mL 2％茚三酮溶液；将混合物仔细摇荡，并在煮沸的水浴中加热10min；将获得的着色溶液用蒸馏水稀释定容至刻度线；最后在560nm处进行比色。 用干热灭菌的土壤和不含土壤的基质（如石英砂）作对照，方法如前所述，以除掉土壤原有的氨基酸引起的误差。换算成甘氨酸的量，根据用甘氨酸标液制取的标准曲线查知。 4. 试剂配制 a. 1%白明胶溶液（用pH7.4的磷酸盐缓冲液配制）； b. 甲苯； c. 磷酸盐缓冲液（pH7.4）； d. 0.1N H2SO4; e. 20％Na2SO4； f. 2％茚三酮溶液：将2g茚三酮溶于100mL丙酮，然后将95mL该溶液与1mL CH3COOH 和4mL水混合制成工作液（该工作液不稳定，只能在使用前配制）； g. 甘氨酸标准液：浓度为1mL含100μg甘氨酸的水溶液：0.1g甘氨酸溶解于1L蒸馏 水中。再将该标液稀释10倍得10μg甘氨酸?1mL-1溶液的甘氨酸工作液。
土壤—饱和导水率(渗透系数)的测定—渗透筒法pdf
FHZDZTR0020 土壤 饱和导水率（渗透系数）的测定 渗透筒法 F-HZ-DZ-TR-0020 土壤—饱和导水率（渗透系数）的测定—渗透筒法 1 范围 本方法适用于田间土壤饱和导水率（渗透系数）的测定。 2 原理 土壤饱和导水率系在单位水压梯度下，通过垂直于水流方向的单位土壤截面积的水流速度，又称土壤渗透系数。本法可在田间进行测定，但易受下层土体性质的影响。在饱和水分的土壤中，土壤的饱和导水率（渗透系数）是根据达西（H. Darcy ）定律： K =h t S L Q ×××……（1） 式（1）中： K ——饱和导水率（渗透系数），cm/s ； Q ——流量，渗透过一定截面积S （cm 2）的水量，mL ； L ——饱和土层厚度，渗透经过的距离，cm ； S ——渗透筒的横截面积，cm 2； t ——渗透过水量Q 时所需的时间，s ； h ——水层厚度，水头（水位差），cm 。 饱和导水率（渗透系数）与土壤孔隙数量、土壤质地、结构、盐分含量、含水量和温度等有关。饱和导水率（渗透系数）K 的量纲为cm/s 或mm/min 或cm/h 或m/d 。从达西定律可以看到，通过某一土层的水量，与其截面积、时间和水层厚度（水头）呈正比，与渗透经过的距离（饱和土层厚度）呈反比，所以饱和导水率（渗透系数）是土壤所特有的常数。 图1 渗透筒Q =K ×S ×t ×h /L 3 仪器 3.1 渗透筒（图1）。 3.2 量筒，500mL 。 3.3 烧杯，400mL 。 3.4 漏斗。 3.5 秒表。 3.6 温度计。 4 操作步骤 4.1 测定深度：根据土壤发生层次（A 、B 、C ）进行测定，每一层次要重复 测定5次。 A 层测定主要用作设计防止土壤侵蚀的措施及制定灌溉制度。 B 层测定用作设计防止土壤侵蚀的措施及预测该层土壤水分可能停滞的 情况，鉴定该层的坚实度和碱化度，并可鉴定该层是否适于作临时灌溉和固 定灌溉渠槽。 C 层测定结果可以提供土壤保水情况及鉴定是否可以作为大型灌溉渠 道、渠槽的资料。 4.2 在选定的试验地上，用渗透筒采取原状土，取土深度为10cm ，将垫有滤 纸的底筛网盖好，带回室内待测定。 4.3 将渗透筒浸入水中，注意水面不要超过土柱。一般砂土浸4h~6h ，壤土浸8h~12h ，粘土浸24h 。 4.4 在预定时间将渗透筒取出，挂在适当位置，待重力水滴完后装上漏斗，漏斗下接一烧杯。
蛋白酶活力的测定
实验三蛋白酶活力的测定 一、目的 掌握用分光光度计法测定蛋白酶活力的原理与操作技术。 二、原理 蛋白酶水解酪蛋白，其产物酪氨酸能在碱性条件下使福林——酚试剂还原，生成鉬蓝与钨蓝，以比色法测定。 三、试剂及仪器 1．福林—酚试剂 称取50g钨酸钠(Na2WO4?2H2O)，12.5g钼酸钠(Na2MoO4?2H2O)，置入1000mL原底烧瓶中，加350mL水，25mL85%磷酸，50mL浓盐酸，文火微沸回流10h，取下回流冷凝器，加50g硫酸锂(Li2SO4)和25mL水，混匀后，加溴水脱色，直至溶液呈金黄色，再微沸15min，驱除残余的溴，冷却，用4号耐酸玻璃过滤器抽滤，滤液用水稀释至500mL。 使用时用2倍体积的水稀释。 2．0.4mol/L碳酸钠溶液：称取42.4g碳酸钠，用水溶解并定容至1000mL。 3．0.4mol/L三氯乙酸溶液：称取65.5g三氯乙酸，用水溶解并定容至1000mL。 4．2%酪蛋白溶液 称取2.00g酪蛋白(又名干酪素)，加约40mL水和2~3滴浓氨水，于沸水浴中加热溶解，冷却后，用pH7.2磷酸缓冲溶液稀释定容至100mL，贮存于冰箱中。 5．pH7.2磷酸缓冲液 0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：称取31.2g磷酸二氢钠(NaH2PO4?2H2O)，用水溶解稀释至1000mL； 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液：称取71.6g磷酸氢二钠(Na2HPO4?12H2O)，用水溶解稀释至1000mL； pH7.2磷酸缓冲溶液：取28mL 0.2mol/L磷酸二氢钠溶液和72mL 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，用水稀释至1000mL。 6．标准酪氨酸溶液： 准确称取0.1g DL-酪氨酸，加少量0.2mol/L盐酸溶液(取1.7mL浓盐酸，用水稀释至100mL)，加热溶解，用水定容至1000mL，每毫升含DL-酪氨酸100微克。 7．仪器：分光光度计、试管 四、操作步骤 1．标准曲线绘制 在上述各管中各取1mL，分别加入5mL 0.4mol/L碳酸钠溶液，1mL福林—酚试剂，于400C水浴显色20min，在680nm波长下测吸光度，绘制标准曲线，在标准曲线上求得吸光度
2.2土壤植酸酶测定
植酸酶 1.分析意义 植酸酶参与土壤含磷化合物的主要部分——植素及其衍生物的脱磷酸化作用。水解作用产物是植物的磷源。 2.测定原理 土壤植酸酶催化肌醇六磷酸化合物，水解成肌醇和六分子的磷酸。测定植酸酶常以植酸钠为基质，以酶解所产生的无机磷量表示酶活性。 3.试剂配制 （1）植酸钠溶液：植酸钠由植素制备。取50g纯植素，溶于2%盐酸中，加浓三氯化铁溶液至微黄色，使之以铁盐的形式沉淀，将析出的植酸铁白色沉淀移在大瓷漏斗上减压抽滤，并用2%盐酸（约4L）洗涤漏斗，以除去植素的衍生物。将沉淀悬浮于水中并用氢氧化钠水解。滤去析出的氢氧化铁沉淀。滤液中参与的氢氧化钠用盐酸中和。然后，用过量的（CH3COOH)2Cu溶液处理，使植酸盐以铜盐的形式沉淀出来。滤出沉淀，仔细用热水洗涤，悬浮于水，并通入硫化氢（H2S）使之分解。滤去析出的CuS，滤液中过量的H2S，通过加热蒸发除去（12h）。所得的植酸溶液，用NaOH处理至pH8.0。最后测定制剂中肌醇与磷酸的比值，以检查植酸钠的纯度，理论上的比值为0.968。 测出植酸钠溶液中磷含量后，用HCl滴定该溶液至pH 5.0，然后用水稀释至1ml含0.25mg P2O5。 （2）甲苯。 （3）钼酸铵溶液：25g钼酸铵加热溶于200ml蒸馏水中。另取1L容量瓶加500ml水，再慢慢加入280ml浓H2SO4，再将钼酸铵溶液加入，随加随摇匀，定容至1L，贮于棕色瓶中。 （4）（NH4)2SO4-H2SO4溶液：取3g（NH4)2SO4加20ml 0.1N H2SO4，溶于1L蒸馏水中。 （5）氯化亚锡溶液：取2.5g SnCl2·2H2O溶于100ml 10%HCl中。 （6）磷的标准溶液：准确称取0.4392g KH2PO4，溶于1L水中即标准液。再稀释10倍得1ml含0.01g磷的工作液。 标准曲线的绘制：分别取1、3、5、7、9、11ml磷工作液移于50ml容量瓶中，加30ml 蒸馏水和2ml钼酸铵液，摇匀加入3滴氯化亚锡液，显色后稀释至刻度，摇匀并在分光光度计上于650nm处比色测定。以光密度为纵坐标，磷的浓度为横坐标，绘制标准曲线。 4.操作步骤 称5g土壤置于100ml三角瓶中，加1ml甲苯，15min后再加10ml植酸钠溶液，于37℃恒温箱中放置24h。 培养结束后，加50ml（NH4)2SO4-H2SO4溶液在振荡机上震荡提取50min。过滤后吸取10ml滤液，置于50ml容量瓶中。按绘制标准曲线的显色方法比色测定。 由标准曲线查出含量（P2O5 mg）表示植酸酶活性。
植酸酶
郑扬云
?植酸(肌醇六磷酸)具有强大的络合力，通常与钙、镁、锌、钾等矿 物质元素结合，形成不溶性盐类。 植酸(盐)广泛存在于农作物及农副 产品中，很多谷物、油料作物中的 植酸含量高达1％一3％，其中钙、镁、锌、钾等元素以植酸盐的形式 存在。因此植酸是一种抗营养因 子．大大降低了微量矿物质的营养 有效性。植酸的这种性质会导致人 和动物钙、镁、锌、钾等元素的不 平衡性。因此必须在动物的饲料中 掭加钙钾等以补充矿物质，这大大 提高了饲料成本。同时饲料中天然 磷的含量约为40％一70％，且以 植酸磷的形式存在，而猪、禽的饲 料中大量的植酸磷因不能被利用而 从粪便中排出，造成环境枵染(磷富集化污染)。
?植酸酶是催化植酸及其盐类水解为肌醇和磷酸的一 类酶的总称。将植酸酶添加 到动物性饲料中释放植酸中 的磷分。不但能提高食物及 饲料对磷的吸收利用率，还 可降解植酸蛋白质络合物， 减少植酸盐对傲量元素的螯 合，提高动物对植物蛋白的 利用率及其植物饲料的营养 价值。同时也减少动物排泄 物中有机磷的含量，减少对 大自然的污染。
一、植酸酶的作用机理 ?植酸酶能将肌醇六磷酸(植酸)分解成为肌醇和磷酸。植酸酶将植酸分子上的磷酸基团逐个切下，形成中间产物IP5，IP4，IP3，IP,.终产物为肌醇和磷酸。不同来源植酸酶作用机理有所不同。微生物产生的3一植酸酶作用于植酸时，首先从植酸的第3碳位点开始水解酯键而释放出无机磷，然后再依次释放出其他碳位点的磷，最终酯解整个植酸分子，此酶需要2价镁离子(Mg2+)参与催化过程。来源于植物的6-植酸酶，它首先在植酸的第6碳位点开始催化而释放出无机磷。1g植酸完全分解理论上可释放出无机磷281．6mg。植酸酶只能将植酸分解为肌醇磷酸酯，不能彻底分解成肌醇和磷酸，要彻底分解肌醇磷酸酯，需酸性磷酸酶的帮助，酸性磷酸酶可以将单磷酸酯、二磷酸酯彻底分解成肌醇和磷酸。大多数微生物来源的植酸酶的作用机理如下。 ?植酸→1,2,4,5-,6-五磷酸肌醇+D-1,2,3,4,5-五磷酸肌醇→1,,2,5,6-四磷酸肌醇→1,2,5-三磷酸肌醇或1,2,6-三磷酸肌醇→1,2-二磷酸肌醇→2-磷酸肌醇。
蛋白酶实验
实验（内容）题目：蛋白酶产生菌的筛选及培养的优化 院系生命科学技术学院 专业生物技术 年级2015级生物技术1班专升本
蛋白酶产生菌的选育及发酵培养条件的优化 一、实验目的 1、学习从土壤中分离蛋白酶产生菌。 2、握分离纯化的方法，分离获得并纯化蛋白酶产生菌。 3、握正交优化的方法和步骤。 二、实验原理 许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。 三、实验器材 1、材料：土壤样品 2、试剂：牛肉膏蛋白胨培养基及平板、奶粉培养基及平板、45mL 无
菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、 3、仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。 四、实验步骤 （一）配制所需培养基 1、牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，琼脂 1.5～2.0g，水 100ml，pH 7.2 2、奶粉培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，琼脂 2.0g，水 100ml，pH 7.0～7.2 脱脂奶粉 3g， 3、牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，水 100ml，pH 7.2 4、发酵培养基：葡萄糖6.0g,硝酸钠4.0g，磷酸二氢钾0.03g,碳酸钠0.1g,磷酸二氢钠0.4g加水100ml （二）分离 1、采集土壤样品，用无菌制备1:10土壤悬液。 2、取1:10土壤悬液5 mL，注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75～80℃水浴中热处理10min以杀死非芽孢细菌。 3、取加热处理过的土壤悬液100～200μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养平板，后将平板倒置，于30～32℃下培养24～48h. 4、对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。
蛋白酶活力测定方法
酸性蛋白酶产品概述: 蛋白质由氨基酸组成，是自然界中发现的最复杂的有机化合物之一。由盐酸和蛋白酶分解成易被高等动物的肠道和微生物有机体的细胞膜吸收的氨基酸。包括人类在内的每种动物，必须要有足够的蛋白质来维持自身生长，来生成每个细胞所必需的氨基酸，一些特种蛋白质还是某些特殊细胞、腺体分泌物、酶和激素的功能性组成元素。蛋白酶是指一些有催化功能的酶，能够水解（断裂）蛋白质，因此也被称为蛋白水解酶。蛋白水解酶在许多的生理和病理过程中发挥着重要作用，在食品和乳品加工业也有着广泛应用。工作机理 蛋白水解酶制剂本产品能在酸性条件下水解蛋白质食品中的缩氨酸键，释放氨基酸或者多肽。在酒精、葡萄酒、果汁、啤酒、黄油和酱油生产中，添加酸性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。酵母在发酵阶段的生长可以通过悬浮蛋白质转化的氨基酸来加以促进，从而加速发酵并提高产量。本产品是一种酸性蛋白酶制剂，在酸性条件下具有较高活性，由酸性蛋白酶高产菌株——曲霉菌深层发酵而成。它广泛应用于饲料、纺织、废水处理和果汁提纯方面。 酸性蛋白酶（Acid protease ）是指蛋白酶具有较低的最适pH，而不是指酸性基团存在于酶的活性部位，酸性蛋白酶的最适PH从2左右（胃蛋白酶）到4左右。从酶的活力-PH曲线分析，在酶的活性部位中含有一个或更多的羟基。这一类蛋白酶中研究最彻底的是胃蛋白酶。（酸性蛋白酶537容易失活）
简介：酸性蛋白酶是由隆科特黑曲霉优良菌种经发酵精制提炼而成，它能在低PH条件下，有效水解蛋白质，广泛应用于酒精、白酒、啤酒、酿造、食品加工、饲料添加、皮革加工等行业。 1、产品规格：，规格有5万u/g～10万u/g 液体型为黑褐色液体，规格有50000u/ml～10000u/ml. 2、酶活力定义：一个酶活力单位是1g酶粉或1ml酶液在40℃，PH3.0条件下，1分钟水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位（u/g或u/ml） 特性1、温度范围为：最适温度范围为40℃-50℃2、PH为：最适PH范围为2.5～3.5 使用方法 1、白酒工业： 本品用以淀粉为原料的生产酒精及白酒行业，提高出酒率0.25%个酒分，提高发酵速度。 2、食品工业： 食品上用以淀粉改良，提高食品风味、改良品质，因能提高氨基酸含量 3、啤酒生产： 能有效阻断双乙酰生成，缩短啤酒成熟期。 4 饲料添加剂：提高饲料利用率。 5、毛皮软化： 提高上色率，手感丰满，增加毛皮光泽。
土壤酶活性测定方法
土壤酶活性测定方法 一、蔗糖酶: 3，5-二硝基水杨酸比色法 1. 试剂配制 （1）2N氢氧化钠200mL：称取16g 氢氧化钠，用蒸馏水溶解，定溶于200mL容量瓶中。 （2）3，5-二硝基水杨酸溶液1000mL：称5g二硝基水杨酸，溶于200mL2N氢氧化钠和500mL蒸馏水中，再加300g酒石酸钾钠，用蒸馏水稀释至1000mL（不超 过7天）。 （3）1/15M 磷酸氢二钠1000mL：23.867g N a2HPO4·12H2O溶于1000mL蒸馏水中。 （4）1/15M 磷酸二氢钾1000mL：9.078g KH2PO4溶于1000mL蒸馏水中。 （5）pH5.5磷酸缓冲液100mL：5 mL磷酸氢二钠(1/15M)加95mL磷酸二氢钾(1/15M) （6）8%蔗糖1000mL：称取80g蔗糖，用水溶解，稀释至1000mL。 （7）甲苯。 （8）标准葡萄糖溶液（1mg/mL）1000mL：取少量葡萄糖在真空干燥箱中，于55℃条件下真空干燥至恒重。然后取1.00g葡萄糖溶于100ml蒸馏水中成标准葡萄 糖母液（10mg还原糖/ml）。取此母液10ml, 用蒸馏水定容至100mL即成标准 葡萄糖液（1mg/ml）； 2. 操作步骤 （1）标准曲线绘制：分别取标准葡萄糖液0.4mL，0.8 mL，1.2mL, 1.6mL, 2.0mL,2.8mL, 3.2mL于50 mL比色管中，另取一管做空白对照。用蒸馏水补足至10mL。加入3.0mL 3，5-二硝基水杨酸，沸水浴5min，随即在自来水流下冷却。最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。 比色后，以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。 （2）土壤蔗糖酶活性测定：称5.00g土样，置于50mL三角瓶中，注入15.0mL 8%蔗糖溶液，5.0mL pH5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。到时取出，6000rpm离心10min。取1.0mL上清液（新鲜土样所吸取的上清液体积为1.0mL；风干土及保存1个月的土样所吸取的上清液体积为0.5mL）于50mL比色管中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。 为消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖引起的误差。每一土样需做无基质对照。整个实验需作无土壤对照。 3．结果计算 蔗糖酶活性以24h后1g土壤葡萄糖的毫克数表示。 葡萄糖（mg）=(a-b)×c 式中 a---从标准曲线查得的样品（加了基质）对应的葡萄糖浓度，mg/mL； b---从标准曲线查得的样品对照组的葡萄糖浓度，mg/mL； c---换算成1g土的系数。 二、脲酶: 靛酚比色法 1. 试剂配制 （1）pH6.7柠檬酸盐缓冲液1L：取184g柠檬酸溶于300mL蒸馏水中，另取147.5g KOH溶于水，再将两种溶液合并，用1N NaOH将pH调至6.7，并用水稀至1L。 （2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，然后用乙醇稀释至100mL(A液)，保存在冰箱中。称取27g NaOH溶于100mL 水中（B液），保存在冰箱中。使用前，取A、B两液各20mL混合，并用蒸馏 水稀释至100mL备用。 （3）次氯酸钠溶液100mL：取10%的次氯酸钠溶液9mL，用水稀释定容于100mL 容量瓶中，即活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 （4）10%尿素溶液500mL：取50g尿素，用水稀释至500mL。 （5）甲苯。
环刀法测土壤渗透系数
提示：土壤导水率（soil water conductivity） 单位水势梯度下水分通过垂直于水流方向的单位截面积的饱和土壤水的流速。根据饱和流达西......壤处于水饱和状态时，便需用饱和导水率计算其通量。饱和导水率也是土壤最大可能的导水率，常以它作为参比量，比较不同湿度条件下土壤的导水性能。 土壤—饱和导水率（渗透系数）的测定—环刀法 1、范围：本方法适用于室内土壤饱和导水率（渗透系数）的测 定。 2、原理：用环刀取原状土样，浸水后，在单位水压梯度下，根 据达西定律，求得通过垂直于水流方向的单位土壤截面积的水流速度，称为土壤的饱和导水率或渗透系数。 3、仪器 3.1 环刀，容积100 cm3或200cm3。3.2 量筒，100mL、 10mL。3.3 烧杯，100mL。3.4 漏斗。3.5 秒表。3.6 温度计。 4、操作步骤 4.1 在室外用环刀取原状土样，带回室内浸入水中。一般砂土 浸4h~6h，壤土浸8 h~12h，粘土浸24h。浸水时要保持水面与 环刀上口平齐，勿使水淹到环刀上口的土面。 4.2 在预定时间将环刀取出，除去盖子，在上面套上一个空环 刀，接口处先用胶布封好，再用熔蜡粘合，严防从接口处漏水。 然后将接合的环刀放到漏斗上，漏斗下面用100mL烧杯承接。 4.3 向上面的空环刀中加水，水面比环刀口低1mm，水层厚 5cm。 4.4 加水后，自漏斗下面滴下第一滴水时用秒表计时，每隔1、
2、3、5、10……tnmin更换漏斗下的烧杯（间隔时间的长短，视 渗透快慢而定），并分别用100mL或10mL量筒计量渗出水量Q1、Q2、Q3……Qn。每更换一次烧杯，要将上面环刀水面加至原来高度，并用温度计记录水温。 4.5 试验一般持续时间约1h才开始稳定。如果仍不稳定，应继 续延长时间直到单位时间内渗出水量相等时为止。 5、结果计算 5.1 渗出水总量按式（1）计算： 式（1）中：Q——渗出水总量，mm；Q1、Q2、Q3……Qn ——每次渗出水量，mL，即cm3；S——环刀横截面积，cm2；10——由cm换算成mm所乘倍数。 渗透速度按式（2）计算： 式（2）中：V——渗透速度，mm/min； Qn——n次渗出水量，mL，即cm3；tn——每次渗透所间隔时间，min。 饱和导水率（渗透系数）按式（3）计算： 式（3）中：Kt——温度为t（℃）时的饱和导水率（渗透系数），mm/min；Qn——n次渗出水量，mL，即cm3；tn——每次渗透所间隔时间，min；S——环刀的横截面积，cm2；h——水层厚度，cm；L——土层厚度，cm；V——渗透速度，mm/min。 为了使不同温度下所测得的Kt值便于比较，应换算成10℃时的饱和导水率（渗透系数），按式（4）计算：
分光光度法测定蛋白酶酶活知识讲解
分光光度法测定蛋白 酶酶活
分光光度法测定蛋白酶酶活 1适用范围 本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活的测定。 2测定原理 蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素（酪蛋白）底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生产钼蓝和钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品的酶活力。 酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。 3仪器和设备 3.1分析天平：精度为0.0001g。 3.2紫外分光光度计。 3.3恒温水浴锅：精度±0.2℃。 3.4PH计：精度为0.01PH单位。 4试剂和溶液 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。 4.1福林（Folin）试剂 市售分析纯福林试剂。 4.2福林使用溶液 一份福林试剂与两份水混合，摇匀。 4.3碳酸钠溶液（42.4g/L） 称取无水碳酸钠（Na 2CO 3 ）42.4g，用水溶解并定容至1000ml。 4.4三氯乙酸c（CCl 3 COOH）=0.4mol/L 称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。 4.5氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L 称取氢氧化钠片剂20.0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至1000ml，摇匀。
4.6盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L 1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。 0.1 mol/L HCL：取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。 4.7缓冲溶液 4.7.1磷酸缓冲液（pH＝7.5，适用于中性蛋白酶） 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4?12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4?12H2O） 0.5g，加水溶解并定容至1000mL。 4.7.2乳酸缓冲液（pH＝3.0，适用于酸性蛋白酶） 甲液：称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液：称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液：取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。 4.810g/L酪素溶液 称取酪素（固定厂家生产，不同厂家产品对实验结果有影响）1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴）湿润后，加入适量的缓冲溶液（测中性蛋白酶加磷酸缓冲液，测酸性蛋白酶加乳酸缓冲液）约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的ｐH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。 4.9L－酪氨酸标准溶液（100μg/mL） 称取预先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用 1mol/L盐酸60 mL溶解后再用蒸馏水定容至100 mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。 吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L－酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存或立即使用。 5分析步骤 5.1标准曲线的绘制 5.1.1L—酪氨酸标准溶液：按表1配置。L—酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测 定。