2.2土壤植酸酶测定

植酸酶

1.分析意义

植酸酶参与土壤含磷化合物的主要部分——植素及其衍生物的脱磷酸化作用。水解作用产物是植物的磷源。

2.测定原理

土壤植酸酶催化肌醇六磷酸化合物，水解成肌醇和六分子的磷酸。测定植酸酶常以植酸钠为基质，以酶解所产生的无机磷量表示酶活性。

3.试剂配制

（1）植酸钠溶液：植酸钠由植素制备。取50g纯植素，溶于2%盐酸中，加浓三氯化铁溶液至微黄色，使之以铁盐的形式沉淀，将析出的植酸铁白色沉淀移在大瓷漏斗上减压抽滤，并用2%盐酸（约4L）洗涤漏斗，以除去植素的衍生物。将沉淀悬浮于水中并用氢氧化钠水解。滤去析出的氢氧化铁沉淀。滤液中参与的氢氧化钠用盐酸中和。然后，用过量的（CH3COOH)2Cu溶液处理，使植酸盐以铜盐的形式沉淀出来。滤出沉淀，仔细用热水洗涤，悬浮于水，并通入硫化氢（H2S）使之分解。滤去析出的CuS，滤液中过量的H2S，通过加热蒸发除去（12h）。所得的植酸溶液，用NaOH处理至pH8.0。最后测定制剂中肌醇与磷酸的比值，以检查植酸钠的纯度，理论上的比值为0.968。

测出植酸钠溶液中磷含量后，用HCl滴定该溶液至pH 5.0，然后用水稀释至1ml含0.25mg P2O5。

（2）甲苯。

（3）钼酸铵溶液：25g钼酸铵加热溶于200ml蒸馏水中。另取1L容量瓶加500ml水，再慢慢加入280ml浓H2SO4，再将钼酸铵溶液加入，随加随摇匀，定容至1L，贮于棕色瓶中。

（4）（NH4)2SO4-H2SO4溶液：取3g（NH4)2SO4加20ml 0.1N H2SO4，溶于1L蒸馏水中。

（5）氯化亚锡溶液：取2.5g SnCl2·2H2O溶于100ml 10%HCl中。

（6）磷的标准溶液：准确称取0.4392g KH2PO4，溶于1L水中即标准液。再稀释10倍得1ml含0.01g磷的工作液。

标准曲线的绘制：分别取1、3、5、7、9、11ml磷工作液移于50ml容量瓶中，加30ml 蒸馏水和2ml钼酸铵液，摇匀加入3滴氯化亚锡液，显色后稀释至刻度，摇匀并在分光光度计上于650nm处比色测定。以光密度为纵坐标，磷的浓度为横坐标，绘制标准曲线。

4.操作步骤

称5g土壤置于100ml三角瓶中，加1ml甲苯，15min后再加10ml植酸钠溶液，于37℃恒温箱中放置24h。

培养结束后，加50ml（NH4)2SO4-H2SO4溶液在振荡机上震荡提取50min。过滤后吸取10ml滤液，置于50ml容量瓶中。按绘制标准曲线的显色方法比色测定。

由标准曲线查出含量（P2O5 mg）表示植酸酶活性。