2.2土壤植酸酶测定
植酸酶酶活测定
四.实验步骤： 实验步骤：
1. 标准曲线的制作
(1)按下表的比例稀释成不同磷浓度溶液 (1)按下表的比例稀释成不同磷浓度溶液
标准符 标准 号 磷液 /ml 蒸馏 水/ml 相当于 无机磷 /ug 显色液 /ml OD660nm
1 2 3 4 5 6
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0
0.9ml（TCA） 0.9ml（植酸 （ ） （ 钠） 3ml √ 3ml √
水浴显色20min 水浴显色
20分钟后， 20分钟后，四只 分钟后 试管中现象
用分光光度 计测OD值 计测 值
实验得到四只试管中的样液的OD值 值 实验得到四只试管中的样液的
A0(参照 = 0 A1= 0.547 参照) 参照 A2= 0.490 A3= 0.523
实验用品： 三.实验用品： 实验用品
• 试剂 乙酸缓冲液、植酸钠溶液、10%三 试剂：乙酸缓冲液、植酸钠溶液、 乙酸缓冲液 三 氯醋酸溶液、 钼酸铵溶液、 氯醋酸溶液、2.5%钼酸铵溶液、10%Vc 钼酸铵溶液 溶液、 硫酸溶液、 溶液、17%硫酸溶液、磷酸二氢钾、显色 硫酸溶液 磷酸二氢钾、 液配制： ） 液配制：（6）︰（水）︰（4）︰（5）=1︰2︰1︰1 ） ） ︰ ︰ ︰ • 仪器：恒温水浴锅、分光光度计、离心机、 仪器：恒温水浴锅、分光光度计、离心机、 烧杯、容量瓶、 烧杯、容量瓶、移液管
摇瓶
3000r/min离心 min 离心15
（2） 酶活测定 ）
反应顺序
1. 加酶液 2. 加植酸钠 加植酸钠/TCA溶液 溶液 3. 加乙酸缓冲液 4. 混合均匀 5. 37℃水解 ℃
样品
0.3ml 0.9ml（植酸钠） （植酸钠） 0.9ml √
植酸酶活力的测定方法及应注意问题(精)
科技信息植酸酶是催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸的一类酶的总称 [1]。
植酸酶是一种胞外酶 [2], 广泛存在于自然界中, 植物、动物、微生物均可产生植酸酶。
植酸酶的活性因来源不同而有差异。
植酸酶能将肌醇六磷酸 (植酸分解成为肌醇和磷酸。
植酸酶可以专一性地水解植酸中的磷酯键, 使磷酸游离出来, 植酸酶将植酸分子上的磷酸基团逐个切下, 形成中间产物肌醇五磷酸、肌醇四磷酸、肌醇三磷酸、肌醇二磷酸、肌醇一磷酸、终产物为肌醇和磷酸 [3]。
植酸酶的作用机理见图 1。
图 1植酸酶的作用机理1. 植酸酶酶活力测定的意义酶活力也称酶活性, 是指酶催化一定化学反应的能力, 用在一定条件下, 酶所催化某一反应的速率表示。
酶活性是研究酶的特性, 分离纯化以及酶制剂生产和应用时的一项不可缺少的指标。
酶活力单位是以酶活力为根据而定义的。
国际生化协会酶委员会规定, 1min 内将1μmol 的底物转化为产物的酶量定为 1个单位,称为标准单位, 同时规定了酶作用的条件。
因标准单位在实际应用时不够方便, 故在生产上往往根据不同的酶, 制定各自不同的酶活力单位。
在测定酶活力时, 对反应温度、 pH 、底物浓度、作用时间都有统一规定, 以便同类产品互相比较。
但是酶活力单位并不能直接反映酶的绝对数量, 只不过是一种相对比较的依据 [4]。
植酸酶活性的定义为:在最适宜条件下, 每分钟从一定浓度的植酸钠溶液中释放1μmol 的无机磷所需要的酶量为一个酶活力单位。
确定植酸酶的酶活, 可以提高实验的标准性和效率。
2. 植酸酶活力测定的原理及方法酶活力测定的原理都是利用酶水解植酸钠形成无机磷,然后测定无机磷的释放量。
植酸酶活性的测定方法较多 , 但至今尚没有被世界普遍公认的植酸酶的定量分析方法。
方法包括:钒 -钼酸铵法、硫酸亚铁 -钼蓝法、 Vc-钼蓝法、丙酮 -磷钼酸铵法、微板法和微量比色法等 [5]。
可根据实验需要选择不同的方法。
2.1钒 -钼酸铵法该方法是利用植酸酶可以水解植酸磷释放出无机磷的原理。
饲用植酸酶活性测定关键控制点
饲用植酸酶活性测定关键控制点于洪莲【期刊名称】《《饲料博览》》【年(卷),期】2019(000)008【总页数】4页(P38-40,44)【关键词】饲用植酸酶; 酶活性; 测定方法【作者】于洪莲【作者单位】广东溢多利生物科技股份有限公司广东珠海 519060【正文语种】中文【中图分类】S816.7随着畜牧业的发展和饲料生产水平的提高，植酸酶作为一种绿色环保型添加剂广泛应用于单胃动物饲料中，其通过催化将饲料原料中丰富的植酸及植酸盐分解为能被动物利用的无机磷和肌醇，可有效提高植物性饲料中磷、矿物质元素和蛋白质的可利用率，提高动物生产性能，因此植酸酶在饲料生产中可定量取代或减少无机磷的添加量，在降低畜禽养殖成本的同时还减少了动物粪便中磷的排放量，减轻磷对环境污染。
植酸酶的研究对解决环境污染和满足营养需求方面有着重要意义。
饲用酶制剂活性分析与检测在饲料工业中具有重要的作用，酶制剂生产企业通过检测产品酶活力来监控产品稳定性，保证酶制剂产品品质，饲料生产企业需要通过检测饲料产品中酶制剂的含量来验证其添加效果（即饲料中酶的活力保存率），以保障饲料品质，因此酶活力的测定是控制酶制剂产品质量的关键环节，也是使用效果的基本保障。
如何准确检测植酸酶含量是许多饲用酶制剂工作者普遍关心的问题。
本文以国标检测方法为依据，综述了植酸酶活力测定方法及检测中关键控制点，以期为植酸酶的检测提供可行性参考。
1 植酸酶活性测定的方法及原理1.1 测定方法《饲用植酸酶活性的测定分光光度法》是现行有效的饲用植酸酶活性测定的国标方法，即GB/T 18634-2009。
本文以国标检测方法为依据。
1.2 测定原理依据国标检测方法，其原理为：植酸酶在一定温度和pH条件下，将底物植酸水解，生成正磷酸和肌醇衍生物。
在酸性溶液中，能与钒钼酸铵生成黄色的复合物，可于波长415 nm下进行比色测定[1]。
1.3 植酸酶活性单位酶活性单位定义为：样品在37 ℃、pH 5.5 的条件下，每分钟从浓度为5.0 mmol·L-1植酸钠溶液中释放出1 μmol 无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U 表示[1]。
植酸酶测定
植酸酶活性测定植酸(Phyticacid).其化学名称为六磷酸肌醇，由1分子肌醇和6分于鳞酸结合而成，分子式是C6H18O24P6,通式为C6H6[OPO(OH)2]6,分子660.8。
植酸及植酸盐中的磷即为植酸磷，植酸广泛存在于谷物籽实和油料作物种子。
植酸酶(phytases)能将磷酸残基从植酸上水解下来，因此破坏了植酸对矿物元素强烈的亲和力，所以说植酸酶能增加矿物元素的营养效价，而且由于释放出的Ca2÷可参加交联或其他反应中去，从而改变了植物性食品的质地。
植酸酶一般只适于在单胃动物中使用。
反刍动物由于瘤胃微生物能合成植酸酶，因此在饲料中一般不需要使用植酸酶。
植物体中的植酸一般不以游离形式存在，而是与钙、镁、钠、钾等结合形成复合盐，植酸盐在多数植物中以植酸钙镁复盐的形式存在，但大麦中主要是植酸钾镁复盐，小麦中主要是植酸铁。
饲料中的无机磷可直接为肠道所吸收，而有机磷则需要先经酶的作用水解为无机磷，然后方能为肠道吸收。
单胃动物消化道中无分解植酸的植酸酶，故对植酸磷的利用率很低。
植酸的抗营养作用不仅表现在植酸磷的低利用率上，还通过整合或络合作用影响其它矿物元素如铁、锌、铜、钙以及蛋白质的可消化性，并抑制淀粉酶、胰蛋白酶、胄蛋白酶的活性。
测定原理植酸酶可以水解植酸钠释放出无机磷，通过加入锐铝酸核显色/终止液使水解反应停止，同时与水解释放出的无机磷产生颜色反应，形成黄色的帆铝磷络合物(NHQ PO4NH4VO3-16M O O3;,在415nm波长下测定磷的含量，以标准磷溶液为参照，计算酶活。
植酸酶的含量以酶活性单位表示。
1植酸酶单位定义为:在37℃、pH5.5的条件下，1分钟内从0.005ImOIL的植酸钠溶液中释放出1微摩尔(UmoD无机磷所需要的植酸酶量。
操作步骤样品准备样品粉碎过后过60目筛。
称取2.0g左右粉碎样品，放入4个IOomL烧杯中(每种样品4个重复)。
加入50 mL浓度为0.25 mL、PH为5.50、在冰箱中冷却的乙酸缓冲液并用磁力搅拌器搅动60分钟，使酶蛋白充分溶出，制成一个悬浮液。
植酸酶活性的测定——钼蓝法(精)
植酸酶活性的测定——钼蓝法1 原理针对预混料复杂的物料体系，用不同的缓冲液对其进行抽提，最大限度的减少饲料中无机磷，微量元素，多维及其他成分对植酸酶测定的影响，用钼蓝法对抽提液中植酸酶活性进行定量。
植酸酶在一定温度和pH条件下，水解底物植酸钠生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性环境中与钼酸铵显色剂反应生成蓝色的（Mo2O3•MoO3）复合物，在波长700nm下比色测定。
酶活力单位定义：在37℃、pH5.0条件下，每分钟从5.0mM植酸钠溶液中释放出1微摩尔的无机磷定义为1个酶活力单位（U）2 试剂本规定中所用试剂，在没有注明其它要求时，均指分析纯试剂；所用溶剂和水无注明时，均指蒸馏水。
清洗实验用容器不要用含磷清洗剂。
2.1 乙酸缓冲液A（0.25mol/L）：称取14.355g无水乙酸钠，加入0.5gTriton X-100和0.5g牛血清白蛋白，900ml水溶解，冰乙酸调pH值至5.00±0.01，水定容至1000ml。
2.2乙酸缓冲液B（0.25mol/L）：称取14.355g无水乙酸钠，加入1.0g吐温-20和30gEDTA，900ml水溶解，冰乙酸调pH值至5.00±0.01，水定容至1000ml。
2.3 植酸钠溶液（6.25mmol/L）：称取577.4mg肌醇六磷酸钠，加入574.2mg无水乙酸钠，90ml水溶解，冰乙酸调pH值至5.00±0.01，水定容至100ml，现用现配（实际反应液中的最终浓度为5.0mmol/L）。
2.4 终止液：5%三氯乙酸（5%TCA）。
2.5 1.5％钼酸铵（试剂A）：7.5g钼酸铵溶于400ml水中，慢慢加入22ml浓硫酸，水定容到500ml，冰箱储存，有效期1个月。
2.6 2.7％硫酸亚铁（试剂B）：冰箱储存，有效期1个月。
2.7 显色剂：移取4份试剂A（2.5），1份试剂B（2.6）混合后使用，现用现配。
2.8 磷酸二氢钾：称量前于烘箱中烘至恒重，用乙酸缓冲液（2.2）配制50mmol/L标准液，再用50mmol/L 配制成4.0mmol/L磷酸二氢钾，溶剂为乙酸缓冲液（2.2），冰箱储存。
饲料中植酸酶活性测定方法探讨
饲料中植酸酶活性测定方法探讨摘要:参照国标测定植酸酶活性的方法,研究了钼黄法和钼蓝法的稳定性及植酸酶活性测定时反应体系中缓冲液、pH值以及Cu、Zn、Mn金属离子对酶活性的影响。
结果表明:钼黄法与改进后的钼蓝法稳定性没有明显差异,但钼蓝法更适合微量磷的测定;柠檬酸盐缓冲液作为植酸酶酶解反应的缓冲体系时显色的稳定性较差;反应温度、pH及Cu、Zn金属离子对酶活性影响较大,测定植酸酶活性时需要严格控制反应条件,屏蔽金属离子的干扰。
关键词:饲料;植酸酶;活性;测定目前,植酸酶制剂在畜禽饲料生产中已得到广泛应用,但饲料中植酸酶活性的测定方法还存在一些争议。
2002年,国家颁布了饲用植酸酶活性的测定方法标准(GB/T 18634)2002),该标准注明其适用于饲料添加剂用的植酸酶产品,也适用于添加有植酸酶的配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料,但配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料成分显然更为复杂,其适用性受到质疑[1]。
因此,关于饲料中植酸酶活性测定方法问题有待进一步研究。
1 试验材料与方法1.1 主要仪器与设备电热恒温水浴锅(室温-100e,控温精度?1e)、离心机(最高转速6 000 r/min)、721型分光光度计、分析天平、pH计、磁力搅拌器、0. 22Lm微孔滤膜。
1.2 试剂1.2.1 偏钒酸铵-钼酸铵-硝酸显色液方法见GB/T 18634)2002。
1.2.2 盐酸-乙酸钠缓冲液方法见GB/T 18634)2002乙酸缓冲液(I)的配制。
1.2.3 磷标准溶液将磷酸二氢钾于105e恒温箱中干燥2 h,在干燥器中保存;称取磷酸二氢钾0. 020 3 g,溶解于蒸馏水中定容至100 ml。
1.2.4 植酸酶溶液方法见GB/T 18634)2002。
1.2.5 植酸钠溶液方法见GB/T 18634)2002。
1.2.6 硫酸-钼酸铵溶液量取20 ml浓硫酸(98% )于100 ml蒸馏水中,称取1. 500 g钼酸铵微热溶解于50 ml蒸馏水中,按比例混合待用。
《2.1土壤酸性磷酸酶活性测定》
《2.1土壤酸性磷酸酶活性测定》土壤酸性磷酸酶活性测定土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。
在ph4-9的土壤中均有磷酸酶。
积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。
研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及ph也有关。
磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向的强度的指标。
磷酸苯二钠比色法1.试剂配制（1）0.5%磷酸苯二钠（用缓冲液配制）。
（2）ph5醋酸盐缓冲液。
a.醋酸盐缓冲液（ph=5.0）a：0.2mol/l醋酸溶液（11.5ml，稀释至1000ml）b：0.2mol/l醋酸钠溶液（16.4gc2h3o2na或27.2gc2h3o2na·3h2o 定容至1000ml）14.8mla+35.2mlb混合即得（3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂。
取0.125g2，6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。
保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。
（4）酚的标准溶液：酚原液——取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1l，贮于棕色瓶中。
酚工作液——取10ml酚原液稀释至1l（每毫升含0.01mg酚）。
（5）甲苯。
（6）0.3%硫酸铝溶液。
标准曲线绘制。
取1、3、5、7、9、11、13ml酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。
以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标（mg）绘成标准曲线。
2.操作步骤称5g风干土置于200ml三角瓶中，加2.5ml甲苯，轻摇15min 后，加入20ml0.5%磷酸苯二钠（用醋酸盐缓冲液配制），仔细摇匀后放入恒温箱，在37℃下培养24h后于培养液中加100ml0.3%硫酸铝溶液并过滤。
吸取3ml滤液于50ml容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。
用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，在分光光度计上于660nm处比色。
3.结果计算磷酸酶活性，以24h后1g土壤中释出的酚的毫克数表示。
植酸酶活性的测定——钼蓝法(精)
植酸酶活性的测定——钼蓝法1 原理针对预混料复杂的物料体系，用不同的缓冲液对其进行抽提，最大限度的减少饲料中无机磷，微量元素，多维及其他成分对植酸酶测定的影响，用钼蓝法对抽提液中植酸酶活性进行定量。
植酸酶在一定温度和pH条件下，水解底物植酸钠生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性环境中与钼酸铵显色剂反应生成蓝色的（Mo2O3•MoO3）复合物，在波长700nm下比色测定。
酶活力单位定义：在37℃、pH5.0条件下，每分钟从5.0mM植酸钠溶液中释放出1微摩尔的无机磷定义为1个酶活力单位（U）2 试剂本规定中所用试剂，在没有注明其它要求时，均指分析纯试剂；所用溶剂和水无注明时，均指蒸馏水。
清洗实验用容器不要用含磷清洗剂。
2.1 乙酸缓冲液A（0.25mol/L）：称取14.355g无水乙酸钠，加入0.5gTriton X-100和0.5g牛血清白蛋白，900ml水溶解，冰乙酸调pH值至5.00±0.01，水定容至1000ml。
2.2乙酸缓冲液B（0.25mol/L）：称取14.355g无水乙酸钠，加入1.0g吐温-20和30gEDTA，900ml水溶解，冰乙酸调pH值至5.00±0.01，水定容至1000ml。
2.3 植酸钠溶液（6.25mmol/L）：称取577.4mg肌醇六磷酸钠，加入574.2mg无水乙酸钠，90ml水溶解，冰乙酸调pH值至5.00±0.01，水定容至100ml，现用现配（实际反应液中的最终浓度为5.0mmol/L）。
2.4 终止液：5%三氯乙酸（5%TCA）。
2.5 1.5％钼酸铵（试剂A）：7.5g钼酸铵溶于400ml水中，慢慢加入22ml浓硫酸，水定容到500ml，冰箱储存，有效期1个月。
2.6 2.7％硫酸亚铁（试剂B）：冰箱储存，有效期1个月。
2.7 显色剂：移取4份试剂A（2.5），1份试剂B（2.6）混合后使用，现用现配。
2.8 磷酸二氢钾：称量前于烘箱中烘至恒重，用乙酸缓冲液（2.2）配制50mmol/L标准液，再用50mmol/L 配制成4.0mmol/L磷酸二氢钾，溶剂为乙酸缓冲液（2.2），冰箱储存。
固态发酵饲用植酸酶酶活的快速测定法
固态发酵饲用植酸酶酶活的快速测定法
1. 引言
固态发酵饲用植酸酶酶活是非标准化和相互依存性的特性，广泛用于饲料行业，其功能受外界因素的影响，其不稳定性容易导致各种质量问题。
为了解决这一问题，本文提出一种快速、准确的固态发酵饲料植酸酶酶活测定方法。
2.材料与方法
2.1 试剂与仪器：蔗糖、脱水乳酸钠、无机盐混合物，热沉淀仪、加速器和水分热分析仪。
2.2 取样：采样样品的量必须在25-50g之间，通常在30g左右，应严格按程序要求获取样品。
2.3 准备实验室温度：将实验室温度调节到22-25℃，保持室内的温度稳定，保证测定的结果的可靠性和准确性。
2.4 酶活测定：将取样的样品置于热沉淀仪中，加入蔗糖和脱水乳酸钠，根据酶学原理，用加速器调节温度，在37℃~ 45℃温度下保持稳定温度进行搅拌20min，完成后改变用水温度冷却，把热水温度改变到4℃，再进行搅拌5min，然后用蒸馏水冲洗样品，取最后收集的液体放入无水盐混合物中，再用水分热分析仪测得样品的水分，由此算出酶活的数值。
3.结果
在经过上述步骤后，样品的固态发酵饲料植酸酶酶活结果为：82.4U/g，符合要求。
4.结论
通过本文提出的固态发酵饲料植酸酶酶活快速测定方法，操作简单，结果准确，可以有效解决固态发酵饲料行业中植酸酶酶活测定的问题。
国标绝对法测定植酸酶产品活性的关键控制点
国标绝对法测定植酸酶产品活性的关键控制点畜禽饲料中添加使用微生物发酵生产的植酸酶可提高植物性饲料中植酸及其盐的利用率, 减少日粮中磷酸氢钙等磷源的添加量, 降低饲料成本, 目前已经被广泛使用。
为了确保实际生产中植酸酶使用效果, 如何准确测定植酸酶产品的酶活性是养殖场、饲料企业和酶制剂生产、经销商所共同关注的问题。
目前, 国内植酸酶产品酶活性测定大多采用国家标准 GB/T 18643—2002《饲料用植酸酶活性的测定分光光度法》。
该方法标准中, 包括两种方法: 绝对法和相对法。
该测定方法的分析步骤不是很复杂, 所涉及的仪器设备饲料企业的实验室也都有配备, 但要获得准确和重复性好的分析结果也不容易, 需要加强对检测原理和步骤的理解。
该方法是基于样品在植酸钠浓度为 5.0 mmol/l、温度37 ℃、pH 值 5.50 条件下, 每分种从植酸钠中释放 1 μmol 无机磷,即为 1 个植酸酶活性(以 U 表示)的定义基础上测定的。
鉴于绝对法应用比较普遍, 现将我们在开展植酸酶产品活性测定过程中一些经验体会总结如下, 供同行们参考。
1 溶液配制植酸酶活性测定直接所用到的溶液主要有 3 种,即乙酸缓冲溶液、植酸钠底物溶液和显色终止液。
1.1 乙酸缓冲溶液国标方法中, 绝对法测定植酸酶产品酶活性所使用的乙酸缓冲溶液浓度为:c(CH3COONa·H2O)=0.25 mol/l。
缓冲溶液是确保整个酶反应体系的 pH 值在规定范围内的关键因素, 必须准确配制。
1.1.1 配制方法称取 34.02 g 三水乙酸钠,0.1 g 吐温 20 于 1 000 ml容量瓶中, 加入 900 ml 水溶解, 用乙酸调节 pH 值至!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!《饲料工业》·2008 年第 29 卷第 14 期检测技术475.50±0.01, 室温下贮存 2 个月有效。
植酸酶的测定
一、测定原理
钼黄法(偏钒酸铵法)原理:植酸酶在一定温度和pH值条件下,水解底物植酸钠,生成正磷酸和肌醇衍生物,在酸性环境中,用钒钼酸铵处理生成黄色复合物,在415nm波长下进行比色分析。
二、反应条件的探讨
1、反应体系的温度及加热时间的探讨
由上图可知，在温度为45摄氏度左右时，植酸酶的活性达到最大，所以在酶促反应时应使温度稳定在45℃左右，植酸酶的作用效率才最大。
标准稀释比例
标准溶液序号
稀释量
浓度/(μmol/ml)
1
0.5→16
1.5625
2
0.5→8
3.1250
3
0.5→4
6.2500
4
0.5→2
12.5000
5
0应顺序进行操作，标准空白加入。2ml乙酸缓冲液。在反应过程中，从加入底物溶液开始，向每只试管中加入试剂的时间间隔要一致，在恒温水浴45℃水解30min。
9、混合
√
√
总体积
10ml
10ml
注：①终止及显色液：移取两份硝酸溶液（1+2水溶液），一份偏巩酸氨溶液混合后使用，现用现配。
②乙酸缓冲液,c=0.25mol/L:称取20.52g无水乙酸钠于1000ml烧杯中，加入900ml水搅拌溶解至刻度。
4、样品测定反应后的溶液在室温下静置10min，如出现浑浊需在离心机上离心去沉淀，上清以磷酸标准曲线空白调零，在分光光度计415波长处测定试样空白（A0）和是试样溶液（A）吸光值，A-A0为实测吸光度值。用直线回归方程计算植酸酶的活性。
2、反应溶液pH的探讨
由上图可知，在PH为5左右时，植酸酶的活性达到最大，所以植酸酶缓冲液提供的的PH环境应在5左右
3、不同的离子及离子浓度对植酸酶活性的影响
土壤中磷酸酶的测定
土壤中磷酸酶的测定1.引言1.1 概述磷酸酶是一类广泛存在于生物体内的酶，其在土壤中的存在和活性对于土壤生态系统的健康和可持续发展具有重要意义。
磷酸酶能够催化磷酸盐的水解反应，将无机磷转化为有机磷，使其能够被植物吸收利用。
因此，磷酸酶在土壤中起着极为关键的作用，对于磷的循环和土壤中磷的有效性具有重要影响。
土壤中的磷酸酶含量和活性可以作为评估土壤肥力和污染程度的重要指标之一。
磷酸酶的活性与土壤微生物的种类和数量密切相关，因此，通过检测土壤中磷酸酶的含量和活性，可以了解土壤的微生物群落结构和功能。
同时，磷酸酶检测还可以为土壤养分管理和农业生产提供重要参考依据。
本文将详细介绍磷酸酶的作用、检测方法以及磷酸酶检测的意义和应用前景。
通过深入了解磷酸酶在土壤中的作用和检测方法，我们可以更好地认识土壤生态系统的功能和特性，为土壤健康管理和农业可持续发展提供科学依据。
1.2文章结构1.2 文章结构本文将按照如下结构展开对土壤中磷酸酶的测定进行探讨：1. 磷酸酶的作用：首先，我们将介绍磷酸酶在土壤中的重要作用以及其在植物生长和磷循环中的关键性。
通过深入了解磷酸酶的作用机制，我们能够更好地理解为什么需要对其进行测定。
2. 磷酸酶的检测方法：接下来，我们将介绍不同的磷酸酶测定方法，包括传统的色谱法、酶联免疫吸附法（ELISA）、荧光法和分子生物学技术等。
我们将详细讨论每种方法的原理、优缺点及适用范围，并给出相应的实验步骤和操作注意事项。
3. 磷酸酶检测的意义：在此部分，我们将对磷酸酶检测的意义进行深入分析和讨论。
我们将提出磷酸酶检测在土壤质量评估、环境保护、农业生产和肥料管理等方面的重要性，并探讨其对土壤健康和可持续农业发展的影响。
4. 磷酸酶检测的应用前景：最后，我们将展望磷酸酶检测在未来的应用前景。
我们将探讨其在农业领域、环境科学和生物技术等方面的潜在应用，并对新技术和方法的发展方向进行展望。
通过以上的文章结构，我们将全面而系统地介绍土壤中磷酸酶的测定方法和应用价值，旨在提供对土壤质量和农业可持续发展有益的参考和指导。
两种测定植酸酶酶活的方法比较及发酵条件研究
两种测定植酸酶酶活的方法比较及发酵条件研究XU Dan-dan;ZHAO Han-dan;WANG Xiu-ran;GUAN Shu-yan【摘要】从富含有机质的环境中采集土样,通过植酸钙平板透明圈法初筛得到产植酸酶菌株,进而用钒-钼酸铵法和丙酮-磷钼酸铵法2种方法测定植酸酶酶活力,并进行比较.结果表明,钒-钼酸铵法为准确、可用的方法,通过正交试验确定了最适产酶发酵条件为pH 5,可溶性淀粉用量1.25 g/100 mL,酵母粉用量1.80 g/100 mL,植酸钙用量1.0 g/100 mL.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2019(058)012【总页数】4页(P134-137)【关键词】植酸酶;酶活;测定;钒-钼酸铵法;丙酮-磷钼酸铵法【作者】XU Dan-dan;ZHAO Han-dan;WANG Xiu-ran;GUAN Shu-yan【作者单位】;;;【正文语种】中文【中图分类】Q93-332植酸（肌醇六磷酸）及植酸盐广泛存在于植物体中，是植物磷的主要贮存形式，占植物中总磷的60%～80%［1］。
但植酸磷难以被单胃动物吸收利用，随粪便排出体外会造成水体和土壤的严重磷污染［2］。
同时，植酸及其盐还是一种抗营养因子，能与多种金属离子螯合并能与蛋白质等形成难溶的复合物，影响动物对矿质元素和蛋白质的吸收利用［3，4］。
植酸酶能将植酸及其盐类降解为肌醇和磷酸（或磷酸盐），作为饲料添加剂可以提高植酸磷的利用率，提高植物性饲料的营养价值，减少畜禽粪便中磷的排放，减轻环境污染［5－7］。
传统的产植酸酶菌株的筛选方法为透明圈法，该方法利用微生物在植酸酶筛选培养基上降解植酸钙，在菌落周围生成透明圈来初步判断微生物是否产植酸酶，但有些产酸菌株也能降解植酸钙产生透明圈，故平板透明圈法缺乏特异性和绝对性，必须再对产透明圈的菌株进行液体发酵培养，测定发酵液的植酸酶活性，才能判断出该菌株是否能够产植酸酶。
植酸霉霉的测定09024201
空白对照A 空白对照 0.3mL培样液A
空白对照B 空白对照 0.3mL培液B
2.加植酸钠/TCA 3.加乙酸缓冲液 4.混合均匀 5.37摄氏度水解 6.加TCA/植酸钠 7.加显色液 8.混匀37度水浴 9.比色测DO值
0.9mLTCA 0.9mL √
0.9mLTCA 0.9mL √
水浴30分钟 0.9mLT CA 3mL 0.9mLT CA 3mL 0.9mLT CA 3mL 0.9mLT CA 3mL 0.9mL植酸钠 3mL 0.9mL植酸钠 3mL
这 是 乙 酸 缓 冲 液
三、实验仪器
恒温水浴锅、分光光度计、离心机、电 子称、烧杯、容量瓶、移液管。
四、实验步骤
1.标准曲线的制作 （1）按下表的比例稀释成不同磷浓度溶液。
标准序号 1 2 3 4 5 6
标准磷/mL 标准磷 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水/mL 蒸馏水 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0
(2)酶活力的计算法 酶活力=(F x m)/(30 x 31 x V) 所以计算的：A培养液中酶活力=(1 x52.56)/(30 x 31 x 3)= 0.0188(U/mL) B培养液中酶活力=(1 x53.24)/(30 x 31 x 3)= 0.0191(U/mL)
注释：F—试样液反应前的总稀释倍数。 m —根据标准磷曲线方程计算所得无 机磷的质量。 30 —反应时间，分钟。 31 —无机磷摩尔质量。 V —实际取酶液样品体积。
二、实验试剂
1.乙酸缓冲液c为0.25mol/L：称取34.02g三 水乙酸钠1000mL容量瓶中，加约2.8mL浓盐 酸调节pH至5.0～5.5，并用蒸馏水定容至 1000mL 2.植酸钠溶液c为3.0mol/L：称取0.1981g肌 醇六磷酸与100mL容量瓶，用乙酸缓冲液 （1）溶解并定容至刻度。 3.10%TCA:10gTCA溶于100mL蒸馏水。
重要土壤酶的测定
重要土壤酶的测定1、磷酸酶测定试剂配制：1. 甲苯（CR）2. pH7柠檬酸盐缓冲液：（中性土壤）A：0.1M柠檬酸溶液：称21.01克柠檬酸溶于1000毫升蒸馏水中。
B：0.2M磷酸氢二钠溶液：Na2HPO4?7H2O53.63克或Na2HPO4?12H2O71.7克稀释至1000毫升。
取A溶液64毫升，B溶液436毫升稀释至1000毫升。
3. pH9.8氨性氯化氨溶液：称取20克氯化氨溶于100毫升浓氨水中，储存在橡皮塞瓶中，保存于冰箱。
4. 0.5%磷酸苯二钠（Na2C6H5PO4·2H2O）底物溶液：称5克磷酸苯二钠溶于1000毫升缓冲液。
5. 2%4-氨基安替匹林：称取2克4-氨基安替匹林，先用少量水溶解，最后稀释至100毫升，浑浊时用滤纸过滤后使用。
（一周内有效）6. 8%铁氢化钾溶液：称8克铁氰化钾溶于少量水，定容至100毫升，储存在棕色瓶中。
（一周内有效）7. 酚的标准溶液：A、原液配制：0.5克重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至500毫升，储存于棕色瓶中，浓度即为1000 ppm。
B、工作液配制：取2.5毫升原液稀释至250毫升，即浓度为10ppm，储存于棕色瓶中。
分别取工作液1、3、5、7、9、11、13、15毫升于50毫升容量瓶或50毫升比色管中，50毫升溶液的浓度分别为0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6、3.0ppm试剂与测定相同。
分析步骤：称过20目的风干土2克于50毫升磨口三角瓶中，加5~10滴甲苯，盖好瓶塞，15分钟后加0.5%磷酸苯二钠溶液20毫升（对照直接加20毫升缓冲液），摇匀并置37℃恒温培养24小时，培养结束后立即过滤。
吸滤液1~5毫升于50毫升容量瓶（或比色管）中，加入0.25毫升氨性氯化氨，0.5毫升2%4-氨基安替匹林和0.5毫升8%铁氰化钾溶液，边加边摇匀，15分钟后定容，在波长510毫微米处比色。
（用1厘米比色杯，显色后1.5小时内稳定）每一土样设置用水代替基质的对照，还需减去无土基质。
2.2土壤植酸酶测定
植酸酶1.分析意义植酸酶参与土壤含磷化合物的主要部分——植素及其衍生物的脱磷酸化作用。
水解作用产物是植物的磷源。
2.测定原理土壤植酸酶催化肌醇六磷酸化合物，水解成肌醇和六分子的磷酸。
测定植酸酶常以植酸钠为基质，以酶解所产生的无机磷量表示酶活性。
3.试剂配制（1）植酸钠溶液：植酸钠由植素制备。
取50g纯植素，溶于2%盐酸中，加浓三氯化铁溶液至微黄色，使之以铁盐的形式沉淀，将析出的植酸铁白色沉淀移在大瓷漏斗上减压抽滤，并用2%盐酸（约4L）洗涤漏斗，以除去植素的衍生物。
将沉淀悬浮于水中并用氢氧化钠水解。
滤去析出的氢氧化铁沉淀。
滤液中参与的氢氧化钠用盐酸中和。
然后，用过量的（CH3COOH)2Cu溶液处理，使植酸盐以铜盐的形式沉淀出来。
滤出沉淀，仔细用热水洗涤，悬浮于水，并通入硫化氢（H2S）使之分解。
滤去析出的CuS，滤液中过量的H2S，通过加热蒸发除去（12h）。
所得的植酸溶液，用NaOH处理至pH8.0。
最后测定制剂中肌醇与磷酸的比值，以检查植酸钠的纯度，理论上的比值为0.968。
测出植酸钠溶液中磷含量后，用HCl滴定该溶液至pH 5.0，然后用水稀释至1ml含0.25mg P2O5。
（2）甲苯。
（3）钼酸铵溶液：25g钼酸铵加热溶于200ml蒸馏水中。
另取1L容量瓶加500ml水，再慢慢加入280ml浓H2SO4，再将钼酸铵溶液加入，随加随摇匀，定容至1L，贮于棕色瓶中。
（4）（NH4)2SO4-H2SO4溶液：取3g（NH4)2SO4加20ml 0.1N H2SO4，溶于1L蒸馏水中。
（5）氯化亚锡溶液：取2.5g SnCl2·2H2O溶于100ml 10%HCl中。
（6）磷的标准溶液：准确称取0.4392g KH2PO4，溶于1L水中即标准液。
再稀释10倍得1ml含0.01g磷的工作液。
标准曲线的绘制：分别取1、3、5、7、9、11ml磷工作液移于50ml容量瓶中，加30ml 蒸馏水和2ml钼酸铵液，摇匀加入3滴氯化亚锡液，显色后稀释至刻度，摇匀并在分光光度计上于650nm处比色测定。
土壤植酸酶检测
土壤植酸酶检测
土壤植酸酶（Soil phytases）是可催化肌醇六磷酸化合物水解成肌醇和磷酸的酶，能提高磷利用率，解除植酸对一些钙、锌、铁、铜等矿物元素的抗营养效应，参与土壤含磷化合物的主要部分—植素及其衍生物的脱磷酸化作用。
植酸酶测定常以植酸钠为基质，以酶解所产生的无机磷量表示酶活性。
土壤植酸酶活性的检测方法有近红外光谱法、琼脂平板法、酶联免疫吸附法、生物传感器法、高效液相色谱法等。
迪信泰检测平台采用生化法，可高效、精准的检测土壤植酸酶活性变化。
此外，我们还提供其他土壤酶类检测服务，以满足您的不同需求。
生化法测定土壤植酸酶样本要求：
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。
周期：2~3周
项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）
2. 相关参数（中英文）
3. 图片
4. 原始数据
5. 土壤植酸酶活性信息。
最新相关土壤酶测定方法(综合)
土壤蛋白酶活性测定(茚三酮比色法)实验试剂：1、pH7.6的0.05mol/L的tris—HCL缓冲液(三羟甲基氨基甲烷—盐酸缓冲液):50ml0.2mol/L的三羟甲基氨基甲烷与27.5ml0.2mol/L的盐酸混合,稀释成200ml。
2、2%酪酸钠溶液:称取2g 酪酸钠,加入10ml0.1mol/L的NaOH溶液,沸水浴处理5min,待膨化后加入pH7.6的tris—HCl缓冲液约80ml,继续沸水浴处理,直至完全溶解,用同样的缓冲液定容至100ml。
3、Tris—HCl—CaCl2混合溶液:用pH7.6的0.05mol/Ltris—HCl缓冲液配制的0.01mol/L的CaCl2溶液。
4、0.6mol/L乙酸铅溶液。
5、草酸钠—乙酸混合溶液:每1000ml0.26mol/L的草酸钠溶液含有240.7ml0.2mol/L的乙酸。
6、茚三酮—乙醇—抗坏血酸混合试剂:称取2g茚三酮,0.02g 抗坏血酸,溶于100ml无水乙醇。
7、0.2%KIO3溶液。
8、pH5.8乙酸—乙酸钠缓冲液:94 ml0.2mol/L乙酸钠与6ml0.2mol/L乙酸混合。
9、0.01%甘氨酸标准溶液:1g甘氨酸溶于1000ml水,再稀释10倍。
10、甲苯。
以上试剂均为分析纯。
实验仪器:基本仪器如试管、烧杯等、离心机、分光光度计、刻度试管、水浴锅、电子天平、移液管实验步骤1、标准曲线的绘制①分别吸取50 、100、150、200、250、300μl0.01%甘氨酸标准溶液,置于10 ml刻度试管中(浓度分别相当于NH2 0.107、0.213、0.320、0.426、0.533、0.639μg/ml),加入2mlpH5.8的乙酸—乙酸钠缓冲溶液②加入1.5ml 茚三酮—乙醇—抗坏血酸混合试剂,混合均匀,沸水浴加热16min③取出立即用自来水冷却15min,加入1ml0.2%KIO3并混合均匀,用蒸馏水定容至10ml,1h内在570nm处比色测定吸光值;以氨基氮(NH2)的浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标准曲线。
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植酸酶
1.分析意义
植酸酶参与土壤含磷化合物的主要部分——植素及其衍生物的脱磷酸化作用。
水解作用产物是植物的磷源。
2.测定原理
土壤植酸酶催化肌醇六磷酸化合物，水解成肌醇和六分子的磷酸。
测定植酸酶常以植酸钠为基质，以酶解所产生的无机磷量表示酶活性。
3.试剂配制
（1）植酸钠溶液：植酸钠由植素制备。
取50g纯植素，溶于2%盐酸中，加浓三氯化铁溶液至微黄色，使之以铁盐的形式沉淀，将析出的植酸铁白色沉淀移在大瓷漏斗上减压抽滤，并用2%盐酸（约4L）洗涤漏斗，以除去植素的衍生物。
将沉淀悬浮于水中并用氢氧化钠水解。
滤去析出的氢氧化铁沉淀。
滤液中参与的氢氧化钠用盐酸中和。
然后，用过量的（CH3COOH)2Cu溶液处理，使植酸盐以铜盐的形式沉淀出来。
滤出沉淀，仔细用热水洗涤，悬浮于水，并通入硫化氢（H2S）使之分解。
滤去析出的CuS，滤液中过量的H2S，通过加热蒸发除去（12h）。
所得的植酸溶液，用NaOH处理至pH8.0。
最后测定制剂中肌醇与磷酸的比值，以检查植酸钠的纯度，理论上的比值为0.968。
测出植酸钠溶液中磷含量后，用HCl滴定该溶液至pH 5.0，然后用水稀释至1ml含0.25mg P2O5。
（2）甲苯。
（3）钼酸铵溶液：25g钼酸铵加热溶于200ml蒸馏水中。
另取1L容量瓶加500ml水，再慢慢加入280ml浓H2SO4，再将钼酸铵溶液加入，随加随摇匀，定容至1L，贮于棕色瓶中。
（4）（NH4)2SO4-H2SO4溶液：取3g（NH4)2SO4加20ml 0.1N H2SO4，溶于1L蒸馏水中。
（5）氯化亚锡溶液：取2.5g SnCl2·2H2O溶于100ml 10%HCl中。
（6）磷的标准溶液：准确称取0.4392g KH2PO4，溶于1L水中即标准液。
再稀释10倍得1ml含0.01g磷的工作液。
标准曲线的绘制：分别取1、3、5、7、9、11ml磷工作液移于50ml容量瓶中，加30ml 蒸馏水和2ml钼酸铵液，摇匀加入3滴氯化亚锡液，显色后稀释至刻度，摇匀并在分光光度计上于650nm处比色测定。
以光密度为纵坐标，磷的浓度为横坐标，绘制标准曲线。
4.操作步骤
称5g土壤置于100ml三角瓶中，加1ml甲苯，15min后再加10ml植酸钠溶液，于37℃恒温箱中放置24h。
培养结束后，加50ml（NH4)2SO4-H2SO4溶液在振荡机上震荡提取50min。
过滤后吸取10ml滤液，置于50ml容量瓶中。
按绘制标准曲线的显色方法比色测定。
由标准曲线查出含量（P2O5 mg）表示植酸酶活性。