农杆菌介导的基因瞬时表达技术及其应用
农杆菌介导的马铃薯块茎GUS基因瞬时表达研究
马铃薯（ Ｓ ｏ ｌ ａ ｎ ｕ ｍ ｔ ｕ ｂ ｅ ｒ ｏ ￥ ｕ ｍ Ｌ ． ） 俗称“ 土豆” ， 是茄科茄属多年生草本块 茎植 物 ，原产于 安第斯
山 区 和 智 利 沿 海 山地 ， 是仅次 于水稻 、 玉米 、 小 麦 的 世 界 第 四大 重 要 粮 食 作 物 ， 具 有 分 布广 泛 、 高 产 稳定、 适应性 强 、 营养丰 富等特点 ， 是 一 种 兼 具 粮 食、 蔬菜、 饲 料 以及 工 业 原 料 等 具 有 多 种 用 途 的 经
ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｉ ｎ ｄ ｉ ｃ ａ ｔ ｅ ｄ ｔ ｈ ａ ｔ ｔ ｈ ｅ ｆ ｏ ｒ ｅ ｉ ｇ ｎ ｇ ｅ ｎ ｅ ｗａ ｓ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｐ ｌ ａ ｎ ｔ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｏ ｔ ｈ ｅ ｐ ｏ ｔ ａ ｔ ｏ ｔ ｕ ｂ ｅ ｒ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｓ ｕ ｃ ｃ ｅ ｓ ｓ ｆ ｕ ｌ ｌ ｙ ．Ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｉ ｍｐ ｒ ｅ ｇ ｎ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｗａ ｓ
区域更加均匀 ， 优 于注射法 。 关键词： 马铃薯 ； 块茎 ； 根癌 农杆 菌 ； 瞬时表 达 ； ＧＵ Ｓ
中图 分类号 ： ￥ ５ ３ ２ 文 献标识 码 ： Ａ Ｄ Ｏ Ｉ 编码： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ６ － ６ ５ ０ ０ ． ２ ０ １ ３ ． １ １ ． ０ ０ １
（ 山东省 轻工 农 副原 料研 究所 ， 山东 高密 ２ ６ １ ５ ０ ０ ）
摘 要： 采用根癌农杆 菌介导的瞬时表达方法 ， 以马铃薯块茎 为主要的研究材料 ， 分别采用 浸染法 和注射 法将外源基 因导人 马
铃薯块茎 细胞 中， 然 后进 行 Ｇ Ｕ Ｓ组织化学染色 。 试验结果表 明 ， 导入马铃薯块茎细胞里 的外源基 因获得 了表达 ； 浸染法 的表 达
农杆菌介导的油菜子叶瞬时表达
农杆菌介导的油菜子叶瞬时表达谭小力;诸葛锐军;李冠英;卢长明;王政;张志燕【摘要】A method for transient expression based on Agrobacterium infiltration into cotyledons of Brassica napus L. cv Ningyou 16 was developed with the Green Florescent Protein (GFP) as a marker gene. GFP expression vector pB2GW7. 0-gfp was constructed and transferred into agrobacterium. The addition of P19 protein improved the transient expression level of GFP in cotyledon. Reverse transcription assay showed that GFP was expressed after 4-8 days of agrobacterium infiltration. Confocal microscopical analysis revealed that epidermal cells and guard cells could be transformed by agrobacterium-based transformation method. The entire process only took 20 days from sowing seed to protein analysis. Therefore, this new method is simple and rapid. It has a potential application in dissection genes expression and function in Brassica napus.%实验以甘蓝型油菜宁油16为材料,绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,建立了农杆菌介导的油菜子叶瞬时表达系统.我们构建了GFP表达载体pB2GW7.0-gfp,并成功转化农杆菌.实验中通过添加P19来提高GFP在油菜子叶中的瞬时表达量.并提取了注射有P19和pB2GW7.0-gfp农杆菌混合液的油菜子叶RNA,经RT-PCR鉴定,发现在4 ～8 d GFP均能表达.激光共聚焦显微镜分析表明农杆菌介导的油菜子叶瞬时表达系统能够转化油菜子叶的表皮细胞和保卫细胞.甘蓝型油菜子叶瞬时表达方法简便、快速、可靠,从种子播种到获得荧光蛋白表达,全过程只需要20d.表明在研究油菜基因的表达和功能方面有潜在的应用前景.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2012(029)006【总页数】4页(P93-96)【关键词】甘蓝型油菜;子叶;农杆菌;瞬时表达【作者】谭小力;诸葛锐军;李冠英;卢长明;王政;张志燕【作者单位】江苏大学生命科学研究院,镇江212013;江苏大学生命科学研究院,镇江212013;江苏大学生命科学研究院,镇江212013;中国农业科学院油料作物研究所,武汉430062;江苏大学生命科学研究院,镇江212013;江苏大学生命科学研究院,镇江212013【正文语种】中文【中图分类】Q786油菜在世界各地广泛种植，在油料作物中其产量仅次于大豆与棕榈，位居第三。
农杆菌介导的桑树瞬时表达体系构建及miRn51与其靶基因的表达分析
Science of Sericulture蚕业科学收稿日期：2014－09－26接受日期：2014－12－10资助项目：国家高科技研究发展计划“863”项目（No．2013AA10060-5），商务部市场运行司茧丝绸产业公共服务体系建设项目（No．3）。
第一作者信息：张大燕（1987－），女，硕士研究生。
E-mail ：zhanglucyyan@163．com通信作者信息：何宁佳，教授，博士生导师。
E-mail ：hejia@swu．edu．cn*Corresponding author．E-mail ：hejia@swu．edu．cn2015，41（1）：0010－0017ISSN 0257－4799；CN 32－1115/SDOI ：10．13441/j．cnki．cykx．2015．01．004农杆菌介导的桑树瞬时表达体系构建及miＲn51与其靶基因的表达分析张大燕贾凌向仲怀何宁佳（家蚕基因组生物学国家重点实验室，西南大学蚕学与系统生物学研究所，重庆400716）摘要微小ＲNA （miＲNA ）是一类内源性非编码的单链小ＲNA ，对植物的生长发育起着重要调控作用。
建立高效的桑树瞬时表达体系是研究桑树miＲNA 及其靶基因功能的有效手段。
将川桑（Morus notabilis ）基因组中克隆的miＲn51前体序列连接到PLGNL 载体上，构建了PLGNL-35S-miＲn51重组质粒，通过农杆菌介导其在桑树叶片中瞬时表达。
采用GUS 组织化学染色、多酚氧化酶活性检测以及荧光定量PCＲ等方法，分析不同缓冲液、重组农杆菌注射菌液浓度、转化时间、桑树品种等试验条件对农杆菌介导的桑树叶片瞬时表达体系转化效率、miＲn51及靶基因表达水平的影响，当采用1号缓冲液和菌液D （600nm ）=0.6的重组农杆菌进行瞬时转化时，转化桑树叶片3d 后miＲn51的表达量最高，其靶基因MnPPO 2的表达水平受到明显抑制，不同桑树品种对瞬时表达体系的瞬时表达效率有一定影响。
植物瞬时表达系统的研究进展
植物瞬时表达系统的研究进展植物瞬时表达系统（plant transient expression system）是指利用植物细胞暂时转化技术，将外源基因转为至植物体内的高效表达系统。
与其他表达系统（如大肠杆菌、哺乳动物细胞等）相比，植物瞬时表达系统具有以下优势：快速性、低成本、无病原性、可大规模生产等。
近年来，植物瞬时表达系统已经成为植物基因工程领域的研究热点之一。
下面将从基本原理、转化技术、应用以及存在的问题等方面进行综述。
一、基本原理植物瞬时表达系统利用植物组织或细胞中的转化技术（如农杆菌介导转化、雨生病毒等），将外源基因导入植物细胞内。
然后，利用植物体内的植物病毒启动子将外源基因与病毒RNA一同表达，从而实现外源基因的高效表达。
该系统具有以下特点：1）能够同时表达多个外源基因；2）表达水平高且可调控；3）表达时间短暂，MEMS（minutes to hours）级别；4）可以用于植物体内和植物细胞水平的瞬时表达。
二、转化技术1.农杆菌介导转化农杆菌介导转化是当前应用最广泛的一种植物瞬时表达系统。
其基本原理是将外源基因插入至农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）植物病原性质粒中，将农杆菌与目标植物细胞接种在一起，通过寄生菌的病理学作用将外源基因成功转化至目标植物细胞中。
该技术具有操作简单、转化效率高等优点。
但是由于农杆菌介导转化仅对部分植物有效，而且对于一些重要物种仍然存在难以克服的技术难题。
2.雨生病毒技术雨生病毒技术是利用雨生病毒有效传播的能力，将外源基因转入植物细胞，然后利用植物体内的病毒启动子进行表达。
由于雨生病毒非常小，可以在分子水平广泛传播，故该技术具有操作简单、适用范围广等优点。
然而，该技术的载体转化量有限，不适用于大规模生产。
三、应用1.基因功能定位植物瞬时表达系统在基因功能定位方面开拓了新的思路。
通过转化不同的融合蛋白并观察它们在植物细胞内的定位，可以快速确认目标蛋白的亚细胞定位，从而为基因功能的深入研究提供良好的方向。
烟草瞬时表达实验原理
烟草瞬时表达实验原理利用农杆菌将外源基因导入到烟草叶片中进行表达，可以借此进行蛋白的亚细胞定位、蛋白互作（BiFC）和蛋白的纯化等实验操作。
在荧光蛋白(YFP、GFP、Luciferase 等)的两个β 片层之间的环结构上有许多特异性位点可以插入外源蛋白而不影响荧光蛋白的荧光活性。
BiFC 技术正是利用荧光蛋白家族的这一特性，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白融合表达。
如果两个目标蛋白因物理相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成有活性的荧光基团而发出荧光。
试剂：500 mM MES (pH5.6)、100 mM MgCl2、100 mM 乙酰丁香酮(acetosyringone, AS)、LB 培养基、50 mg/mL Kana (母液)、25 mg/mL Rif (母液)、100 mg/mL Amp (母液)。
仪器：一次性注射器、恒温摇床、分光光度计、普通离心机、激光共聚焦显微镜。
配方：500 mM MES (pH 5.6)：称取9.75 g无水MES，用去离子水溶解，经NaOH调pH至5.6，定容至100 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，于4 °C保存。
100 mM 乙酰丁香酮：称取0.196 g乙酰丁香酮，用5 mL DMSO (二甲基亚砜) 溶解，再用去离子水定容至 10 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。
50 mg/mL Kana (母液)：称取1 g的Kana粉末，用去离子水溶解并定容至20 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。
100 mg/mL Amp (母液)：称取2 g的Amp粉末，用去离子水溶解并定容至20 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，分装1 mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。
农杆菌介导的基因瞬时表达技术及其应用
农杆菌介导的基因瞬时表达技术及其应用
宋建;刘仲齐
【期刊名称】《天津农业科学》
【年(卷),期】2008(014)001
【摘要】主要介绍了农杆菌介导的基因瞬时表达方法的原理、技术、影响因素及其在外源基因表达分析、启动子分析、基因沉默及防卫反应等方面的应用.
【总页数】3页(P20-22)
【作者】宋建;刘仲齐
【作者单位】天津市农业生物技术研究中心,天津,300192;天津市农业生物技术研究中心,天津,300192
【正文语种】中文
【中图分类】Q789
【相关文献】
1.超声波辅助农杆菌介导转化大豆gus基因在不同外植体中的瞬时表达 [J], 杜鹃;赵峰;曹越平
2.农杆菌介导的外源基因在本氏烟中瞬时表达体系优化研究 [J], 陈思涵;钱靖;彭杰军;鲁宇文;郑红英;林林;燕飞;陈剑平
3.农杆菌介导的马铃薯块茎GUS基因瞬时表达研究 [J], 舒锐;刘少军;岳林旭;焦健;李燕
4.月季花瓣中农杆菌介导的基因瞬时表达体系的优化及其在RNAi中的应用 [J], 王磊;陈雯;刘娅;杨若韵;阴霞;马男;高俊平
5.农杆菌介导的INH基因瞬时表达系统的建立及表达分析 [J], 张月丽;杨艳丽;姜晶
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农杆菌渗入法介导的基因瞬时表达技术及应用
ｎｉｑｕｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｗｏｕｌｄ ｂｅ ｗｉｄｅｌｙ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓ ｅｘ— ｏｇｅｎｏｕｓ ｇｅｎｅｓ，ａｎａｌｙｚｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｓｉｌｅｎｃｅ ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ，ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ．Ａｎｄ ｉｔ ａｌｓｏ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｅｄ ｃｒｏｐｓ，ｅｔｃ．Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ
１贵州大学生命科学院，贵阳，５５００２５；２贵州省农业生物技术重点实验室，贵阳，５５０００６；３贵州省植物保护研究所，贵阳，５５０００６ ＋通讯作者，ｌｉｕｚｕｏｙｉ＠ｙａｂｏｏ．ｔｏｍ．ｃｎ
摘 要农杆菌渗入法是在植物中瞬时表达外源基因的一种方法，该方法通过在植物叶片上注射农杆菌，使 目的基因转入植物细胞中进行快速表达。本文综述了农杆菌渗入法的原理、技术流程、影响因素及其应用，其 应用主要涉及外源基因的表达、检测转基因的表达、启动子分析、转录后基因沉默、抑制子功能鉴定、细胞定位 以及基凶相可＝作用等方面。随着技术的进一步完善，我们相信该技术将成为转基因育种领域的重要的手段。 关键词 农杆菌渗入法，转基因，瞬时表达
大豆瞬时转化体系和遗传转化体系的建立与应用
大豆瞬时转化体系和遗传转化体系的建立与应用一、引言大豆（Glycine max）是我国的主要农作物之一，其种子含有丰富的优质蛋白质和油脂，被广泛用于食品加工、饲料生产和生物能源开发等领域。
然而，提高大豆的产量和抗逆性一直是大豆育种领域面临的挑战。
为了解决这一问题，科研人员不断努力，建立了大豆瞬时转化体系和遗传转化体系，并将其应用于大豆育种中，取得了显著的成果。
二、大豆瞬时转化体系的建立与应用1. 大豆瞬时转化体系的概念及原理大豆瞬时转化体系是指利用农杆菌介导法将外源基因导入大豆离体部分，经瞬时表达后再转移到植株体内的一种转化技术。
该技术的核心原理是通过利用农杆菌的T-DNA片段将目的基因导入大豆受体细胞，利用激素和植物生长物质的作用，实现外源基因在大豆植株体内的转化和表达。
大豆瞬时转化体系的建立为大豆遗传改良提供了重要的技术手段。
2. 大豆瞬时转化体系的应用进展利用大豆瞬时转化体系，科研人员已经成功地转化了多种外源基因，并将其导入大豆植株体内。
通过该技术，不仅可以实现外源基因在大豆植株体内的高效表达，还可以实现特定基因的靶向编辑和调控。
利用大豆瞬时转化体系成功导入了抗病基因、抗逆基因和营养改良基因等，为大豆的抗病、抗旱、抗寒和产量性状的改良提供了重要的技术支持。
三、大豆遗传转化体系的建立与应用1. 大豆遗传转化体系的概念及原理大豆遗传转化体系是指利用基因编辑技术，通过CRISPR/Cas9系统等工具对大豆基因组进行精准编辑和改造的一种转化技术。
该技术的核心原理是利用CRISPR/Cas9系统的靶向特异性，将Cas9蛋白和RNA 导向的DNA裂解酶导入大豆细胞内，通过靶向编辑特定基因，实现对大豆遗传特性的调控和改良。
2. 大豆遗传转化体系的应用进展近年来，大豆遗传转化体系的应用进展迅速，科研人员已经成功地利用CRISPR/Cas9系统对大豆的多种性状进行精准编辑和改良。
通过该技术，不仅可以实现对大豆产量、品质和抗逆性状的调控，还可以实现对大豆次生代谢途径和生长发育过程的精准编辑。
一种农杆菌介导的草莓叶片瞬时基因表达方法及其应用[发明专利]
![一种农杆菌介导的草莓叶片瞬时基因表达方法及其应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/5f7b115cfd0a79563d1e72a5.png)
专利名称：一种农杆菌介导的草莓叶片瞬时基因表达方法及其应用
专利类型：发明专利
发明人：冯嘉玥,崔孟媛,未魏
申请号：CN201810412048.1
申请日：20180428
公开号：CN108690850A
公开日：
20181023
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明中公开了一种农杆菌介导的快速高效草莓叶片瞬时基因表达方法及其应用。
发明人采用真空侵染法建立一种农杆菌介导的草莓叶片瞬时基因表达方法并进行优化，选择草莓叶片为侵染材料，以黄色荧光蛋白YFP为报告基因对草莓品种、草莓叶片苗龄、叶片位置、真空侵染时间及生长培养基类型进行优化得到表达外源蛋白的最适条件。
本发明建立的草莓叶片瞬时转化方法具有快速高效等优点，可以用来进行外源蛋白表达、基因亚细胞定位、启动子活性检测以及抗性基因功能验证等应用。
申请人：西北农林科技大学
地址：712100 陕西省咸阳市杨凌示范区邰城路3号
国籍：CN
代理机构：北京汇知杰知识产权代理事务所(普通合伙)
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植物瞬时表达系统的研究进展
植物瞬时表达系统的研究进展植物瞬时表达系统是一种用于合成和表达外源蛋白的方法，其具有高效、快速和经济的特点。
近年来，随着生物技术的发展，该领域取得了许多重要的研究进展。
本文将介绍植物瞬时表达系统的原理、优势和应用，并总结近年来的研究进展，展望其在农业生产、医药生物技术和工业生产等领域的应用前景。
一、植物瞬时表达系统的原理和优势植物瞬时表达系统是一种利用植物叶片或其他组织快速表达外源蛋白的技术。
其原理是通过植物病毒或农杆菌介导的转染，将外源基因导入植物细胞中，利用植物细胞的生物合成系统合成外源蛋白。
相比传统的植物转基因技术，植物瞬时表达系统具有以下优势：1. 高效快速：植物瞬时表达系统能够在较短的时间内表达大量外源蛋白，通常只需数天至数周的时间，远远快于传统的植物转基因技术。
2. 经济低成本：植物瞬时表达系统无需大量耗费时间和金钱的农业生产，通过简单的组织培养和转染技术即可实现外源蛋白的大规模表达，具有较低的生产成本。
3. 安全环保：相比于转基因作物，植物瞬时表达系统不会对环境和生态系统产生长期影响，安全性较高。
4. 可定制性：植物瞬时表达系统能够实现外源蛋白的快速定制和大规模生产，适用于不同的应用场景。
二、植物瞬时表达系统在农业生产中的应用1. 植物病毒疫苗：利用植物瞬时表达系统，可以快速合成和生产植物病毒疫苗，用于防治各种植物病毒病害，提高农作物产量和质量。
2. 抗虫、抗病基因的快速筛选：利用植物瞬时表达系统，可以快速表达和筛选出对虫害和病害具有抗性的基因，用于育种改良。
3. 其他农业生产相关的功能性蛋白的生产：例如抗氧化蛋白、生长调节蛋白等，可以提高作物抗逆性和增强产量。
除了农业生产领域，植物瞬时表达系统还在医药生物技术领域具有重要的应用价值：1. 疫苗和抗体的生产：利用植物瞬时表达系统，可以快速合成和生产各种疫苗和抗体，如乙肝疫苗、流感疫苗等，具有较低的生产成本和较高的生物安全性。
2. 药物的生产和筛选：通过植物瞬时表达系统，可以快速合成和筛选各种药物，如抗癌药物、免疫调节药物等，为医药研发提供新的途径。
一种适用于多种植物的农杆菌介导基因瞬时表达的方法
随着科学技术的不断发展，人类对植物基因研究的需求也日益增加。
而农杆菌介导的基因瞬时表达方法则成为了植物基因研究领域的热门话题之一。
本文将围绕这一主题展开讨论。
一、农杆菌介导的基因瞬时表达方法简介农杆菌介导的基因瞬时表达方法是一种将外源基因导入植物细胞中并在短时间内表达的技术。
其原理是利用土壤中常见的植物致病菌——农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）来传递外源基因，使其经由农杆菌转座子插入到植物细胞的基因组中，从而实现目的基因的表达。
二、农杆菌介导的基因瞬时表达方法的优势1. 高效性：农杆菌介导的基因瞬时表达方法能够在短时间内使目的基因得到高效表达，为研究人员提供了更快捷、高效的研究手段。
2. 适用范围广：农杆菌介导的基因瞬时表达方法不仅适用于单一植物种类，还适用于多种植物，包括但不限于拟南芥、烟草、水稻等。
3. 可操作性强：相比于稳定转化方法，农杆菌介导的基因瞬时表达方法不需要等待植株成熟，而是直接在植物叶片上进行操作，省时省力。
三、农杆菌介导的基因瞬时表达方法的研究现状目前，科研人员对农杆菌介导的基因瞬时表达方法进行了大量探索与研究，不断优化该技术并拓展其应用范围。
通过改变农杆菌株系、转染条件、辅助基因等因素，有效提高了基因转化效率，并使其更适用于不同植物。
四、农杆菌介导的基因瞬时表达方法的应用前景随着生命科学领域的不断发展，对植物基因研究的需求逐渐增加，而农杆菌介导的基因瞬时表达方法正是满足这一需求的重要手段。
未来，该方法有望在植物遗传改良、抗病株培育、蛋白表达等方面发挥更为广泛的作用。
五、结语农杆菌介导的基因瞬时表达方法作为一种重要的植物基因研究技术，其独特的优势和潜在的应用前景吸引着越来越多的研究人员投入到相关领域的研究中。
随着技术的不断完善和发展，相信农杆菌介导的基因瞬时表达方法一定会为植物基因研究领域注入新的活力，为人类农业生产和生态环境的改善带来新的希望。
农杆菌介导的基因瞬时表达方法在植物基因研究领域中具有广阔的应用前景，其高效性和适用范围广的特点使其成为研究人员们研究植物基因功能和调控的重要工具。
植物瞬时表达系统的研究进展
植物瞬时表达系统的研究进展植物瞬时表达系统，又称为植物瞬时表达技术，是一种利用植物作为生物反应器表达外源蛋白的技术。
与传统的细胞培养、动物表达系统相比，植物瞬时表达系统具有快速、高效、低成本等优点，在农业、药物研发等领域具有广阔的应用前景。
本文将对植物瞬时表达系统的研究进展进行综述。
植物瞬时表达系统最早源于20世纪80年代，当时利用农杆菌通过转化植物的基因组将外源基因导入植物细胞中，实现了外源蛋白的表达。
但由于植物的遗传稳定性差，需要大量时间和资源进行筛选和培育，限制了植物表达系统的应用。
为了提高植物表达系统的效率和速度，研究者们采用了瞬时表达的方法。
瞬时表达是通过病毒载体或质粒直接导入植物细胞，利用植物细胞系统来表达外源蛋白。
相比于传统的稳定转化，瞬时表达可以在短时间内表达大量的外源蛋白，适用于高通量的蛋白表达需求。
目前，常用的植物瞬时表达系统包括病毒介导的瞬时表达和质粒介导的瞬时表达。
病毒介导的瞬时表达通过利用植物病毒作为载体将外源基因导入植物细胞中，实现外源蛋白的表达。
常用的病毒载体包括烟草花叶病毒、基因重组的病毒载体等。
质粒介导的瞬时表达则是通过直接将含有外源基因的质粒导入植物细胞中，利用质粒的DNA转录和翻译机制实现外源蛋白的表达。
研究者们对植物瞬时表达系统进行了不断的改进和优化。
一方面，通过选择合适的植物材料，如烟草、水稻、拟南芥等，可以提高瞬时表达的效率。
通过优化病毒载体和质粒的构建，可以提高外源蛋白的表达水平和稳定性。
还可以通过基因编辑技术，如CRISPR-Cas9系统，来实现精准的基因敲除或敲入，进一步拓展植物瞬时表达系统的应用领域。
目前，植物瞬时表达系统已经广泛应用于农业、药物研发、疫苗生产等领域。
在农业领域，植物瞬时表达系统可以用于快速的育种方法，用于改良农作物的抗性、耐旱性等性状。
在药物研发领域，植物瞬时表达系统可以用于大规模的重组蛋白的生产，如抗体、疫苗等，以满足市场的需求。
植物瞬时表达系统的研究进展
植物瞬时表达系统的研究进展植物瞬时表达系统（PICS）是一种新兴的生物技术工具，可将外源基因在植物中快速表达，并用于植物生物学研究、农业改良以及生物药物生产等领域。
自1998年以来，PICS 在许多植物物种中得到了广泛应用，并在研究进展方面取得了显著成果。
PICS技术的研究使得基因转化和基因表达在植物中的过程更加高效。
传统上，将外源基因转移到植物中需要耗费大量时间和资源，并且效果不稳定。
PICS系统利用农杆菌介导的基因传递和高效的表达载体，能够快速而准确地将外源基因导入植物细胞，并促进其高水平表达。
研究人员对PICS系统的改进不断提升了其表达效率和稳定性。
通过对农杆菌介导的转化方法和表达载体的优化，研究人员取得了显著的进展。
采用新型农杆菌菌株和表达载体的组合，可提高转化效率和表达水平。
通过基因组学和遗传策略的研究，人们还发现了一些调控外源基因表达的关键因子，如启动子和转录调控元件，有助于提高PICS系统的表达效率和稳定性。
PICS技术在农业改良方面也具有巨大的潜力。
通过将外源基因导入农作物中，研究人员可以改良农作物的抗病性、耐逆性和产量等性状，以提高农作物的生长发育和经济价值。
在水稻中导入耐盐基因，可以提高水稻对盐胁迫的适应能力，从而增加其产量和质量。
PICS还可以用于农作物的抗病性改良，通过导入产生抗病蛋白的基因，可以提高农作物对病原菌的免疫能力。
PICS技术在生物药物生产领域也具有广阔的应用前景。
通过将药物基因导入植物细胞中，并利用植物细胞的高效表达系统，可以生产出大量纯度高的重组药物。
相比传统的生产方法，植物表达系统具有成本低、生产周期短和生物安全性高等优势。
利用PICS技术生产的乳糖酶等酶类药物已经成功应用于临床。
植物瞬时表达系统的研究进展为基因转化和基因表达提供了高效、稳定的技术工具。
其在植物生物学研究、农业改良和生物药物生产领域的应用前景广阔，将为人们带来巨大的经济和社会效益。
植物农杆菌介导的外源基因转移技术及其应用
植物农杆菌介导的外源基因转移技术及其应用近年来，随着生物学和生物技术的不断发展，基因转移技术也得到了重要的突破。
植物农杆菌介导的外源基因转移技术（agrobacterium-mediated transformation）成为了一种非常常见的基因转移方法，被广泛应用于农业、植物生理学、生物技术等领域。
本文将详细介绍这一技术及其应用。
一、植物农杆菌介导的外源基因转移技术原理植物农杆菌是一种生活在土壤中的细菌，广泛存在于自然环境中。
该细菌有着自身特殊的基因转移系统，能够将其自身的T-DNA（转移DNA）序列转移到宿主植物的染色体中。
这一转移系统是由植物农杆菌在与宿主植物接触的过程中产生的，它通常被称为“水平基因转移”。
agrobacterium-mediated transformation技术就是通过利用植物农杆菌的这一转移系统，将人工构建的外源DNA序列转移到宿主植物的DNA中，实现基因转移的过程。
一般而言，该技术可以分为以下几个步骤：1.构建转化载体。
将外源DNA与植物农杆菌的转化载体pTi（T-DNA合成区）组装成转化载体，在该载体上加入适当的激活元件和标记元件，以便对转化结果进行筛选和鉴定。
2.感染宿主植物。
将构建好的转化载体稀释至适当的浓度后，在适当的营养条件下，静置一段时间使之与宿主植物接触，从而实现转移。
3.筛选转化率。
应用适当的筛选方法，对转化结果进行筛选，得到所需的转化率。
二、应用1.基因研究植物农杆菌介导的基因转移技术已被广泛应用于生物学领域中的基因研究。
该技术可以使研究人员将人工合成的DNA序列导入到宿主植物中，从而构建各种生物表型。
利用该技术，可以对特定的基因进行定向研究，解析其特性及功能。
2.品种改良与其他农业生产方法相比，植物农杆菌介导的基因转移技术拥有一些独特的优势。
例如，它可以方便地实现外源基因的稳定表达，并且可以避免其他基因编辑技术可能带来的副作用。
因此，该技术已被广泛应用于植物品种的改良中，使得研究人员可以进行一些关键基因的定向编辑，以实现农业产业的高效生产。
农杆菌及其瞬时转化技术
具体流程简介
• 首先获得目的基因序列，将目的基因插入到表达载体中， 如pBIl2l、pMOG800等，再转化到农杆菌细胞中。目前常 用于介导转化植物的农杆菌有LBA4404、EHAl05、Gv3101、 AGLl等菌株。
• 其次，将含表达载体的农杆菌转接于液体培养基培养至对 数生长期，离心收集菌体，加入浸润缓冲液，重悬至 OD600值约为0．1～1．5，室温静置2～3 h后用于浸润。
在稳定表达状态的基因转移中导入宿主细胞的dna整合到细胞染色体dna上以永久形式存在并可传给后代形成稳定的转化细胞将目的基因插入载体中转化到根癌农杆菌中后者经酚类化合物如乙酰丁香酮诱导处理在转录水平激活vir区基因真空渗透或注射使农杆菌与植株叶片细胞接触从而实现tdna转移进入植物细胞核
农杆菌及其介导的瞬时表达 技术
应用
• 外源基因的瞬时表达是十分理想的研究基因表达调控的实 验系统。具体可应用于以下几个方面:
• 第一、 外源基因表达分析 • 第二、启动子对基因表达调控的研究 • 第三、基因沉默研究中的应用 • 第四、宿主抗性( R) 基因与病原物无毒( Avr) 基因的相
互作农杆菌和发根农杆菌 • 根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子
叶植物或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。这 种病曾在法国、东欧和澳大利亚的葡萄等果树上大面积 发生。 • 发根农杆菌则诱导产生发状根，其特征是大量增生高度 分支的根系。
农杆菌介导法的基本步骤
农杆菌瞬时表达技术的原理
• 将目的基因插入载体中，转化到根癌农杆菌中，后者 经酚类化合物(如乙酰丁香酮)诱导处理，在转录水平 激活Vir区基因，真空渗透或注射使农杆菌与植株叶片 细胞接触，从而实现T-DNA转移进入植物细胞核。大 部分T- DNA 并未整合入植物基因组而是暂时存在于 核内并在植物细胞转录、翻译成分的协助下瞬时表达 T- DNA 基因, 通常在数小时后即可检测到外源基因的 表达, 并在1～2 d 内达到最高值。而少量整合进植物 染色体的T-DNA在瞬时表达中不起作用或极为微弱。
农杆菌和基因枪介导的瞬时表达方法研究综述
农杆菌和基因枪介导的瞬时表达方法研究综述
鲜彬;徐翔铭;吴清华;任超翔;陈江;裴瑾
【期刊名称】《中药与临床》
【年(卷),期】2022(13)5
【摘要】随着对经济作物、药用植物等遗传信息研究的深入,如何验证基因功能成为了研究重点和难点。
瞬时表达技术是近几十年来发展出的新方法,相较于通过转基因技术验证基因功能而言,瞬时表达技术能更加快速且准确验证基因功能。
其中农杆菌和基因枪介导的瞬时表达方法有着独特的优势,在各种植物材料中均应用广泛。
本文总结农杆菌和基因枪介导的瞬时表达方法的机理、特点、影响因素和应用,为其他植物基因功能研究等提供思路。
【总页数】8页(P110-117)
【作者】鲜彬;徐翔铭;吴清华;任超翔;陈江;裴瑾
【作者单位】成都中医药大学药学院;中药资源系统研究与开发利用重点实验室【正文语种】中文
【中图分类】R-1
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烟草瞬时转化
本氏烟草(N。
benthamian）瞬时表达及相关实验方法:一、农杆菌介导的烟草瞬时转化：A、实验步骤：1、根据实验需要，将所要表达的基因克隆到含有不同标签的双元载体中，并转化农杆菌。
2、将新活化的农杆菌单克隆接种到含有相应抗生素的YEP中，28℃,200rpm过夜.*估算时间，防止农杆菌液浓度超过1OD,否则会影响转化效率。
3、当菌液OD值介于0.6~1.0之间时,1000g，5min离心收集农杆菌。
4、用2ml Induction medium（without AS)轻柔重悬农杆菌，然后再次离心收集菌液。
5、重复步骤4。
6、所得沉淀用1ml Induction medium 重悬。
7、室温放置1～4小时8、测OD值，根据实验需要，配置侵染液(组合详见下文）。
9、用不加针头的注射器将侵染液注射进6～8周大的本氏烟草叶片中。
＊使用注射器时注意安全,防止针头扎到手，使用完的注射器要把针头套套上再扔，或者将针头放到注射器里面，避免伤害他人；注射时应戴乳胶手套并在每次注射完成后清洗手套，防止交叉污染。
B、试剂：Induction medium：MES—KOH PH 5。
7 10nMMgCl210mMAS 200uM推荐提前配制母液1M MES-KOH PH5.7 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍。
1M MgCl2 过滤灭菌，4℃保存，用时稀释100倍.0.2M AS 溶于DMSO 有机溶剂专用滤膜过滤灭菌，分装（避免反复冻融），—20℃。
用高压灭菌的超纯水稀释。
C、关于表达时间：烟草瞬时表达系统中蛋白的表达可以维持比较长的时间，一般注射24小时之后到一周之内都会有表达。
严格来讲需要摸索每个蛋白的最佳表达时段，但一般注射后48小时至72小时不同蛋白表达量都比较可观，不要错过。
D、关于侵染液浓度：推荐每个菌株的浓度在0.1~0.2之间.过高的农杆菌浓度会引起叶片萎蔫甚至枯萎。
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农杆菌介导的基因瞬时表达技术及其应用
作者：宋建刘仲齐
来源：《天津农业科学》2008年第01期
摘要：主要介绍了农杆菌介导的基因瞬时表达方法的原理、技术、影响因素及其在外源基因表达分析、启动子分析、基因沉默及防卫反应等方面的应用。
关键词：农杆菌；植物；基因瞬时表达
中图分类号：Q789文献标识码：A文章编号：1006—6500(2008)01—0020—03
把外源基因导入受体植物内，是研究基因功能和获得遗传修饰有机体的主要手段。
农杆菌介导法是目前最常用的遗传转化方法，当农杆菌感染植物受伤组织后，质粒上的目标基因可以进入植物细胞内并整合到植物染色体中，这种转化细胞经过诱导分化，再生成为转基因植株。
通常大多数植物的遗传转化和再生效率低下，费时且费用昂贵。
即使对于转化程序大大简化的植物，例如拟南芥，仍然需要花费数月的时间来产生适合分析的转基因植株。
农杆菌介导的瞬时表达提供了一种快速分析基因型功能的方法，该方法是Rossi等在1993年创建的。
他们将带有重组质粒的农杆菌，经诱导后通过抽真空渗透入植物叶片进而渗透入植物细胞，通过目的基因瞬时表达来检测植物中农杆菌介导的T-DNA转移的效率。
随后人们又采用针管注射活体植株叶片，来进行农杆菌介导的基因瞬时表达检测。
近几年该项技术不断完善、发展，已被广泛用于外源基因表达分析、无毒基因与抗性基因的相互作用、基因沉默、启动子分析等许多植物分子生物学领域。
1主要原理
农杆菌介导的瞬时表达是将目的基因插入共整合载体或双元载体，转化根癌农杆菌，后者经酚类化合物诱导处理后，通过真空渗透或针管注射入植物叶片组织中，农杆菌在叶片内与植物细胞紧密接触。
诱导处理在转录水平激活Vir区基因，真空渗透或注射使得农杆菌与植株叶片细胞接触，从而实现了T-DNA转移进入植物细胞核。
大部分T-DNA并未整合入植物基因组而是暂时存在于核内并在植物细胞转录、翻译成分的协助下瞬时表达T-DNA基因，通常在数小时后即可检测到外源基因的表达，并在1～2d内达到最高值。
而少量整合进植物染色体的
T-DNA在瞬时表达中不起作用或极为微弱。
2技术介绍
该技术主要包括载体的构建、农杆菌的培养及诱导、真空渗透或针管注射3个主要步骤：(1)将目的基因插入共整合载体或双元载体，如pBI121、pMOG800、pBIN91、pTJK136等；转化农杆菌，如LBA4404、EHA105、C5851等；(2)农杆菌的培养及诱导，将农杆菌培养液按1％(v/v)转接于含抗生素、2-(N-吗啉)-乙基磺酸(MES)和乙酰丁香酮(AS)的液体培养基中，振荡培养至对数生长期，离心收集菌体，重悬于MMA溶液(含MgCl2、MES、AS)中，并调整菌液浓度使其OD600=1.5左右，室温静置3h；(3)真空渗透或针管注射，真空渗透法一般是将离体叶片浸入菌液中，抽真空一定时间并迅速释放使得菌液渗入叶片内，把处理后的叶片放入盛有用无菌水或MS培养液浸湿的滤纸的培养皿中，培养一段时间后取样检测。
针管注射法是用无针头的针管，靠压力将菌液注入叶片的叶脉之间，除了Rossi等最初使用真空渗透处理幼苗、Kapila等用真空渗透处理叶片外，现多采用针管在完整植株上注射叶片，因为后者能更真实地反映叶片在植株上生长过程中基因的表达情况。
3影响因素
因为农杆菌介导的瞬时表达同时有两个生物体参加这一过程，影响农杆菌的侵染力和植物生理状况的因素都会影响转化的效率。
对于某一特定的植物种类，农杆菌的一些菌株比另外的菌株的侵染力更强。
同样，一些植物种类或基因型对于特定的农杆菌菌株具有更多或更少的感受性。
这些变化部分是由于微生物接近植物细胞的能力不同，或者是因为微生物或植物编码的T-DNA转化机制的不同造成的。
植株和叶片的生理状况在很大程度上影响到瞬时表达的转化效率，Yang等用针管注射GUS基因来检测其在烟草叶片中的瞬时表达活性时发现：完全展开的老叶片转化效率低；半展开的嫩叶在不同叶片之间，或同一叶片的不同区域的转化效率变化很大；6周龄植株的中部即将完全展开的叶片的转化效率相互之间变化小、可重复性强。
这可能是因为老叶片难于注射且细胞内转录活性降低；嫩叶的生理状况相互之间差别大、叶肉细胞间菌体渗透不匀，而即将完全展开的叶片生理状况相对稳定且易于注射。
微生物悬液的浓度对渗透也很重要。
悬液的OD6002值小于0.1导致弱的转基因表达；而OD600值高于1.0的悬液的渗透通常导致组织黄化或枯萎。
对莴苣的测试表明，渗透的悬液的OD600值在0.3和0.8之间。
曾有报道提及一些化学和生化因素在不同植物中提高了瞬时表达的效率，这些因素包括乙酰丁香酮、渗透过程中pH值的不同范围、L-半胱氨酸和重氮丝氨酸。
但这些因素对瞬时转化的影响作用并不是普遍发生的情况，它们可能只在特定的实验中起作用。
4应用
外源基因的瞬时表达是十分理想的研究基因表达调控的实验系统。
具体可应用于以下几个方面：
4.1外源基因表达分析
Joh等通过真空渗透法处理莴苣叶片，得到高水平瞬时表达的重组蛋白，虽然表达水平不稳定，但是为利用植物来大量生产重组蛋白提供了一个有希望的技术。
4.2启动子对基因表达调控的研究
Yang等通过农杆菌介导的瞬时表达对烟草启动子和转录因子进行了快速分析，通过注射烟草叶片成功地识别了烟草PR1a和myb1两个启动子中对水杨酸(SA)处理、烟草花叶病毒(TMV)感染有响应的顺式作用元件。
该实验的结果表明农杆菌介导的瞬时表达是一个简单而有效的体内分析植物启动子和转录因子的手段。
4.3基因沉默研究中的应用
基因沉默现象是导致转基因不能正常表达的一个重要因素。
其作用机理主要有：位置效应、转录水平的沉默和转录后水平的沉默。
病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silence，VIGS)是近年来发现的一种转录后基因沉默(post-transcription-al gene silencing。
PTGS)现象，它为功能基因组学研究提供了一个有力的工具。
Diego等利用农杆菌将基于烟草病毒的pTRV1、TRV2-tPDS复合物注射番茄果实，发现八氢番茄红素脱饱和酶(PDS)的mRNA水平需要达到一定阈值才能引发番茄红素的积累，证明了农杆菌介导的瞬时转化对于果实中的基因沉默是一种有效的传递系统。
4.4宿主抗性(R)基因与病原物无毒(Avr)基因的相互作用研究
现在一般认为抗性是植物品种所具有的抗性基因和与之对应的病原物的无毒基因结合时才得以表现。
过敏反应(Hypersensitive reaction，HR)是宿主的局部防卫反应，它是在非亲和性病原感染后在病原侵染部位产生的抗病反应，侵染部位细胞编程死亡。
Palanichelvam等通过瞬时转化在烟草叶片上表达CaMV W260株的VI基因，4～5d引起过敏反应，9～12d引起细胞死亡。
Van der Hoorn等通过Agrobacterium成功地在分别转有抗性基因Cf-9和Cf-4的烟草叶片中表达了来源于番茄叶霉菌的胞外蛋白基因Avr9和Avr4，并认为农杆菌介导的瞬时表达是研究Avr/Cf介导的识别反应的一个灵活又可靠的手段，更重要的是该方法可用来对比、量化Avr/Cf反应。
该实验第一次表明该方法可用来研究胞外识别反应。
5展望。