农杆菌介导的基因瞬时表达技术及其应用
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农杆菌介导的基因瞬时表达技术及其应用
作者:宋建刘仲齐
来源:《天津农业科学》2008年第01期
摘要:主要介绍了农杆菌介导的基因瞬时表达方法的原理、技术、影响因素及其在外源基因表达分析、启动子分析、基因沉默及防卫反应等方面的应用。
关键词:农杆菌;植物;基因瞬时表达
中图分类号:Q789文献标识码:A文章编号:1006—6500(2008)01—0020—03
把外源基因导入受体植物内,是研究基因功能和获得遗传修饰有机体的主要手段。农杆菌介导法是目前最常用的遗传转化方法,当农杆菌感染植物受伤组织后,质粒上的目标基因可以进入植物细胞内并整合到植物染色体中,这种转化细胞经过诱导分化,再生成为转基因植株。通常大多数植物的遗传转化和再生效率低下,费时且费用昂贵。即使对于转化程序大大简化的植物,例如拟南芥,仍然需要花费数月的时间来产生适合分析的转基因植株。农杆菌介导的瞬时表达提供了一种快速分析基因型功能的方法,该方法是Rossi等在1993年创建的。他们将带有重组质粒的农杆菌,经诱导后通过抽真空渗透入植物叶片进而渗透入植物细胞,通过目的基因瞬时表达来检测植物中农杆菌介导的T-DNA转移的效率。随后人们又采用针管注射活体植株叶片,来进行农杆菌介导的基因瞬时表达检测。近几年该项技术不断完善、发展,已被广泛用于外源基因表达分析、无毒基因与抗性基因的相互作用、基因沉默、启动子分析等许多植物分子生物学领域。
1主要原理
农杆菌介导的瞬时表达是将目的基因插入共整合载体或双元载体,转化根癌农杆菌,后者经酚类化合物诱导处理后,通过真空渗透或针管注射入植物叶片组织中,农杆菌在叶片内与植物细胞紧密接触。诱导处理在转录水平激活Vir区基因,真空渗透或注射使得农杆菌与植株叶片细胞接触,从而实现了T-DNA转移进入植物细胞核。大部分T-DNA并未整合入植物基因组而是暂时存在于核内并在植物细胞转录、翻译成分的协助下瞬时表达T-DNA基因,通常在数小时后即可检测到外源基因的表达,并在1~2d内达到最高值。而少量整合进植物染色体的
T-DNA在瞬时表达中不起作用或极为微弱。
2技术介绍
该技术主要包括载体的构建、农杆菌的培养及诱导、真空渗透或针管注射3个主要步骤:(1)将目的基因插入共整合载体或双元载体,如pBI121、pMOG800、pBIN91、pTJK136等;转化农杆菌,如LBA4404、EHA105、C5851等;(2)农杆菌的培养及诱导,将农杆菌培养液按1%(v/v)转接于含抗生素、2-(N-吗啉)-乙基磺酸(MES)和乙酰丁香酮(AS)的液体培养基中,振荡培养至对数生长期,离心收集菌体,重悬于MMA溶液(含MgCl2、MES、AS)中,并调整菌液浓度使其OD600=1.5左右,室温静置3h;(3)真空渗透或针管注射,真空渗透法一般是将离体叶片浸入菌液中,抽真空一定时间并迅速释放使得菌液渗入叶片内,把处理后的叶片放入盛有用无菌水或MS培养液浸湿的滤纸的培养皿中,培养一段时间后取样检测。针管注射法是用无针头的针管,靠压力将菌液注入叶片的叶脉之间,除了Rossi等最初使用真空渗透处理幼苗、Kapila等用真空渗透处理叶片外,现多采用针管在完整植株上注射叶片,因为后者能更真实地反映叶片在植株上生长过程中基因的表达情况。
3影响因素
因为农杆菌介导的瞬时表达同时有两个生物体参加这一过程,影响农杆菌的侵染力和植物生理状况的因素都会影响转化的效率。对于某一特定的植物种类,农杆菌的一些菌株比另外的菌株的侵染力更强。同样,一些植物种类或基因型对于特定的农杆菌菌株具有更多或更少的感受性。这些变化部分是由于微生物接近植物细胞的能力不同,或者是因为微生物或植物编码的T-DNA转化机制的不同造成的。
植株和叶片的生理状况在很大程度上影响到瞬时表达的转化效率,Yang等用针管注射GUS基因来检测其在烟草叶片中的瞬时表达活性时发现:完全展开的老叶片转化效率低;半展开的嫩叶在不同叶片之间,或同一叶片的不同区域的转化效率变化很大;6周龄植株的中部即将完全展开的叶片的转化效率相互之间变化小、可重复性强。这可能是因为老叶片难于注射且细胞内转录活性降低;嫩叶的生理状况相互之间差别大、叶肉细胞间菌体渗透不匀,而即将完全展开的叶片生理状况相对稳定且易于注射。
微生物悬液的浓度对渗透也很重要。悬液的OD6002值小于0.1导致弱的转基因表达;而OD600值高于1.0的悬液的渗透通常导致组织黄化或枯萎。对莴苣的测试表明,渗透的悬液的OD600值在0.3和0.8之间。
曾有报道提及一些化学和生化因素在不同植物中提高了瞬时表达的效率,这些因素包括乙酰丁香酮、渗透过程中pH值的不同范围、L-半胱氨酸和重氮丝氨酸。但这些因素对瞬时转化的影响作用并不是普遍发生的情况,它们可能只在特定的实验中起作用。
4应用
外源基因的瞬时表达是十分理想的研究基因表达调控的实验系统。具体可应用于以下几个方面:
4.1外源基因表达分析
Joh等通过真空渗透法处理莴苣叶片,得到高水平瞬时表达的重组蛋白,虽然表达水平不稳定,但是为利用植物来大量生产重组蛋白提供了一个有希望的技术。
4.2启动子对基因表达调控的研究
Yang等通过农杆菌介导的瞬时表达对烟草启动子和转录因子进行了快速分析,通过注射烟草叶片成功地识别了烟草PR1a和myb1两个启动子中对水杨酸(SA)处理、烟草花叶病毒(TMV)感染有响应的顺式作用元件。该实验的结果表明农杆菌介导的瞬时表达是一个简单而有效的体内分析植物启动子和转录因子的手段。
4.3基因沉默研究中的应用
基因沉默现象是导致转基因不能正常表达的一个重要因素。其作用机理主要有:位置效应、转录水平的沉默和转录后水平的沉默。病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silence,VIGS)是近年来发现的一种转录后基因沉默(post-transcription-al gene silencing。PTGS)现象,它为功能基因组学研究提供了一个有力的工具。
Diego等利用农杆菌将基于烟草病毒的pTRV1、TRV2-tPDS复合物注射番茄果实,发现八氢番茄红素脱饱和酶(PDS)的mRNA水平需要达到一定阈值才能引发番茄红素的积累,证明了农杆菌介导的瞬时转化对于果实中的基因沉默是一种有效的传递系统。