第5章 离子交换层析

微晶纤维-又称纤维素胶或 结晶纤维素
性状：白色或几乎白色 的细小粉末，无臭，无味， 可压成自身粘合的小片，并 可在水中迅速分散，不溶于 水、稀酸、稀碱溶液和大多 数有机溶剂。 制法：将纤维性植物材 料与无机酸捣成浆状，经处 理使之降解后漂洗、研磨、 脱水、烘干、粉碎制成。
目前常用的纤维素交换剂
交换剂 类型 （简写） 磷酸纤维素 中强酸型阳离 （ P-C ） 子交换剂 磺酸乙基纤维素 强酸型阳离子 （ SE-C ） 交换剂 功能基团 — PO 3 2— (CH 2 ) 2 SO 3 交换容量 （毫克当量/g） 0.7~7.4 0.2~0.3 0.5~1.0 0.5~1.0 0.1~1.0 0.3~1.0 0.3~0.5 适宜 pH Ph<4 极低 pH>4 pH>8.6 pH<8.6
①
阳离子交换剂：
阳离子交换剂的电荷基团带负电，反离子带正电，可与 溶液中的阳离子或带正电荷化合物进行交换反应。
依据电荷基团的强弱，可分为强酸型(带磺酸的基团，R －SO3H)、中强酸型（含磷酸基团或亚磷酸基团，R－PO3H2） 及弱酸型（带羧基和酚基的树脂， R－COOH或R－苯环－OH） 三种。 这些交换剂在交换时，氢离子为外来的阳离子所取代， 如下式所示： R－COOH＋Na+＝R－COONa＋＋H+
第一节 基本原理
离子交换剂
特性
在水中呈不溶解状态，能释放出反离子。同时它 与溶液中的其他离子或离子化合物相互结合，结合后 不改变本身和被结合离子或离子化合物的理化性质。
离子交换反应
离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应
主要是以离子交换方式进行。所进行的离子交换反应 是可逆的。假定以RA代表阳离子交换剂，在溶液中解 离出来的阳离子A+与溶液中的阳离子B+可发生可逆的 交换反应，反应式为：
RA + B+ →RB + A+ 该反应能以极快的速率达到平衡，平衡的移动遵 循质量作用定律。
示意图（离子交换过程）
电离基团（磺酸根） 可交换离子（钠离子） 交换离子
不交换离子
离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，
结合力的大小取决于离子交换剂的选择性。 离子交换剂的选择性可用其反应的平衡常数K表示： K＝[RB][A+]/[RA][B+] 如果反应溶液中[A+]等于[B+]，则K＝[RB]/[RA]。 若K>1，即[RB]>[RA]，表示离子交换剂对B+的结合 力大于A+ ； 若K=1，即[RB]＝[RA]，表示离子交换剂对A+ 和B+ 的结合力相同； 若K<1，即[RB]<[RA]，表示离子交换剂对B+的结合 力小于A+。 K值是反映离子交换剂对不同离子的结合力或选择 性参数，故称K值为离子交换剂对A+和B+的选择系数。
一、离子交换剂的类型
根据离子交换剂中基质的组成及性质，可将其分成两 大类：疏水性离子交换剂和亲水性离子交换剂。 (1)疏水性离子交换剂 是一种与水亲和力较小的人工合成树脂，最常见的是 由苯乙烯与交联剂二乙烯苯反应生成的聚合物，在此结构 中再以共价键引入不同的电荷基团。由于引入电荷基团的 性质不同，又可分为阳离子交换树脂、阴离子交换树脂及 螯合离子交换树脂。
影响离子交换选择性的因素
交换选择性影响亦大。

离子强度：越低越好；

在稀溶液中，强碱性树脂的各负电性基团的离子 结合力次序是：CH3COO–<F–<OH–<HCOO–<Cl–<Br– 有机溶剂：不利于吸附； <CrO42–<NO2–<I–<C2O42–< SO42–<柠檬酸根。 交联度、膨胀度、分子筛：交联度大，膨胀度小，筛分能力增大；交联 弱碱性阴离子交换树脂对各负电性基团结合力的 度小，膨胀度大，吸附量减少；<C1–<Br–=I–＝CH3COO–<MoO42–<PO43– 次序为：F– <AsO43–<NO3–<酒石酸根<柠檬酸根<CrO42–<SO42– 树脂与粒子间的辅助力：除静电力以外，还有氢键和范德华力等辅助力； <OH–。
③琼脂糖离子交换剂
主要以交联琼脂糖CL–6B为基质，引入电荷基团 而构成。 这种离子交换凝胶对pH及温度的变化均较稳定， 可在pH3～10和0～70℃范围内使用，改变离子强度或 pH时，床体积变化不大。 如DEAE–Sepharose CL–6B为阴离子交换剂；CM– Sepharose CL–6B为阳离子交换剂,它们的外形呈珠状， 网孔大，特别适用于相对分子质量大的蛋白质和核酸 等化合物的分离，即使加快流速，也不影响分辨率。
Fra Baidu bibliotek第五章
离子交换层析
离子交换层析是利用离子交换剂上的可交换离 子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同， 经过交换平衡达到分离的目的的一种柱层析法。 离子交换层析具有灵敏度高，重复性、选择性 好，分析速度快等优点，是当前最常用的层析法之 一。
1848年，Thompson 等人在研究土壤碱性物质交换过 程中发现离子交换现象。本世纪40年代，出现了具有稳定 交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。50年代，离子交换层 析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。目前离子交 换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的 应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的 分离纯化。
②阴离子交换剂
此类交换剂是在基质骨架上引入季胺[-N (CH3)3]、叔 胺[-N(CH3)2]、仲胺[-NHCH3]和伯胺[-NH2]基团后构成的。 依据胺基碱性的强弱，又可分为强碱性(含季胺基)、弱 碱性(含叔胺、仲胺基)及中强碱性(既含强碱性基团又含弱 碱性基团)三种阴离子交换剂。 它们与溶液中的离子进行交换时，反应式为：
离子交换机理






A+自溶液中扩散到树脂表面 A+从树脂表面进入树脂内部的 活性中心 A+与RB在活性中心上发生复分 解反应 解吸附离子B+自树脂内部扩散 至树脂表面 B+离子从树脂表面扩散到溶液 中 交换速度的控制步骤是扩散速 度，不同的分离体系可能由内 部扩散或外部扩散控制
影响交换速度的因素
两性离子如蛋白质、核苷酸、氨基酸等与离子交换剂的 结合力，主要决定于它们的理化性质和特定的条件下呈现 的离子状态。当pH<pI时，能被阳离子交换剂吸附，反之， 当pH>pI时，能被阴离子交换剂吸附。若在相同pI条件下， 且pI>pH时，pI越高，碱性越强，就越容易被阳离子交换剂 吸附。 离子交换层析就是利用离子交换剂的荷电基团，吸附溶 液中相反电荷的离子或离子化合物，被吸附的物质随后为 带同类型电荷的其他离子所臵换而被洗脱。由于各种离子 或离子化合物对交换剂的结合力不同，因而洗脱的速率有 快有慢，形成了层析层。
③螯合离子交换剂：
这类离子交换树脂具有吸附(或络合)一些金属离子而排 斥另一些离子的能力，可通过改变溶液的酸度提高其选择性。 由于它的高选择性，只需用很短的树脂柱就可以把欲测的金属 离子浓缩并洗脱下来。
疏水性离子交换剂含有大量的活性基团，交换容量大、流 速快、机械强度大，主要用于分离无机离子、有机酸、核苷酸 及氨基酸等小分子物质，也可用于从蛋白质溶液中除去表面活 性剂(如SDS)、去污剂(如TritonX—100)、尿素、两性电解质 等。


如Na+<Ca2+<Al3＋<Si4＋。如 原子价数相同，交换量则随 交换离子的原子序数的增加 ＋ ＋ ＋ 水合离子半径：半径越小，亲和力越大；而增大，如Li <Na <K <Pb＋。在稀溶液中适用。 离子化合价：高价离子易于被吸附； 1、竞争；2、增加蛋白 质的水合作用，降低吸 溶液pH：影响交换基团和交换离子的解离程度，不但影响交换容量；对 附和交换速度。

颗粒大小：愈小越快 交联度：交联度小，交换速度快 温度：越高越快,与扩散系数增加有关 离子化合价：化合价越高，扩散速度小 离子大小：越小越快


搅拌速度：在一定程度上，越大越快
溶液浓度：当交换速度为外扩散控制时，浓度越大，交换速 度越快
离子交换层析的基本原理
若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+发生交换 而结合在树脂上。若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物 质可与OH-发生交换而结合在树脂上。 物质在树脂上结合的牢固程度有差异，选用适当的洗脱液 可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。
例：
001×7
凝胶型苯乙烯系强酸阳离子交换树脂交联度为7%
D001
大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂
亲水性离子交换剂的命名

交换基团写在前面，然后写骨架，最后写原骨架的编号。 在编号前加C、A以区分阳离子和阴离子。

如：DEAE-Sephadex A-25
疏水性离子交换剂（树脂）的命名
（D）①②③×④
（D）——大孔型 无——凝胶型 ①分类代号 0—强酸 1—弱酸 3—弱碱 4—螯合 5—两性 6—氧化还原活 性基团 ②骨架名称 0—苯乙烯系 1—丙烯酸系 2—酚醛系 3—环氧系 4—乙烯吡 啶系 5—脲醛系 6—氯乙烯系 ③顺序代号 用以区别交换基团或交联剂的差异。 ④交联度（%）
羟甲基纤维素 弱酸型阳离子 — CH 2 COO （ CM-C ） 交换剂 三乙基氨基乙基纤 强碱型阴离子 — (CH 2 ) 2 N + (C 2 H 5 ) 3 维素（ TEAE-C ） 交换剂 二乙氨基乙基纤维 弱碱型阴离子 — (CH 2 ) 2 N + H (C 2 H 5 ) 2 素（ DEAE-C ） 交换剂 氨基乙基纤维素 中等碱型阴离 （ AE-C ） 子交换剂 Ecteda 纤维素 （ ECTE-C ） — (CH 2 ) 2 N + H 2
+ +
+
+ —
+ + + + + + +
+ +
+
— + —
1.平衡阶段:离子交 换剂与反离子结合 2.吸附阶段：样品 与反离子进行交换 3、4. 解吸附阶段： 梯度缓冲溶液先洗下 弱吸附物质，后洗下 强吸附物质 5.再生阶段：用原始 平衡液进行充分洗涤 ，既可重复使用
第二节
离子交换剂的分类及性质
②交联葡聚糖离子交换剂
交联葡聚糖离子交换剂是以交联葡聚糖G–25和G–50 为基质，通过化学方法引入电荷基团而制成的。 交换剂G–50型适用于相对分子质量为3×104～3×106 的物质的分离，交换剂G–25型能交换相对分子质量较小 (1×103～5×103)的蛋白质。 交联葡聚糖离子交换剂的性质与葡聚糖凝胶相似， 在强酸和强碱中不稳定，在pH＝7时可耐120℃的高热。它 既有离子交换作用，又有分子筛性质，可根据分子大小对 生物高分子物质进行分级分离，但不适用于分级分离相对 分子质量大于2×105的蛋白质。
中等碱型阴离 — (CH 2 ) 2 N + (C 2 H 4 OH) 3 子交换剂
离子交换纤维素适用于分离大分子多价电解质。 特点： 结构疏松，对生物高分子物质(如蛋白质和核酸 分子)有较大的穿透性； 表面积大，因而有较大的吸附容量； 基质是亲水性的，避免了疏水性反应对蛋白质 分离的干扰； 电荷密度较低，与蛋白质分子结合不牢固，在 温和洗脱条件下即可达到分离的目的，不会引起蛋白 质的变性。 但纤维素分子中只有一小部分羟基被取代，结 合在其分子上的解离基团数量不多，故交换容量小， 仅为交换树脂的1/10左右。

按骨架结构不同，离子交换树脂可分为： 凝胶型和大孔型。
苯乙烯或丙烯酸与交联剂 二乙烯苯聚合而成，透明， 没有毛细孔，吸水后形成 微细的孔隙，适合交换无 离子等小分子。 苯乙烯或丙烯酸与交联剂 二乙烯苯的异构体聚合， 经过特殊的物理处理，行 成大网孔，再导入交换基 团制成，不透明，既有微 孔又有大粗孔，吸附大分 子，耐污染。
(2) 亲水性离子交换剂
与水亲和性较大，有纤维素、交联葡聚糖、交联琼脂 糖等。 ①纤维素离子交换剂 又称离子交换纤维素，是以微晶纤维素为基质，引入 电荷基团构成的。分为强酸性、弱酸性、强碱性及弱碱性离 子交换剂。纤维素离子交换剂中，最广泛使用的是二乙胺基 乙基(DEAE一)纤维素和羧甲基(CM一)纤维素。 近年来Pharmacia公司用微晶纤维素经交联作用，制成 了类似凝胶的珠状弱碱性离子交换剂(DEAE—Sephacel)，结 构与DEAE一纤维素相同，对蛋白质、核酸、激素及其他生物 聚合物都有同等的分辨率。