人工诱发单倍体及其应用

供体亲本 AaBb
花粉
培养
（3）诱变育种中的作用 植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能 在当代及时获得突变个体，加倍后成为稳定的
纯系。利于筛选隐性突变体 提高诱变效率。
（4） 利于获得优良植株 如：芦笋全雄系的培育 （5）用作基础研究的各个领域
（三）花药和花粉培养中雄核发育的途径
• 1、A途径 小孢子第一次有丝分裂为不均等分裂， 形成营养细胞和生殖细胞
接种在平板上的水稻花药来自百度文库
部分花药产生愈伤组织
愈伤组织转接种到再生培养基
愈伤组织分化形成再生植株
第五节 单倍体植株的鉴定和二 倍化的方法
一、单倍体植株的鉴定
1. 间接鉴定：通过观察染色体倍性变化后而 表现出的容易识别的形态特征等而初步判 断的鉴定方法。 • ①植株形态特征的观察；
• ②叶片气孔保卫细胞的测定；
AB AB aB Ab ab AABB aABB AabB aAbB aB AaBB aaBB AabB aabB Ab AABb aABb AAbb aAbb ab AaBb aaBb Aabb aabb
（2）提高了目标基因型的选择效率 例：
二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中 选择基因为AAbb的纯合单株
二、 植物单倍体在植物遗传育种中的应用
应用： 1. 利用单倍体植物控制杂种分离，加快常规育种速度 ； 2. 排除显隐性基因的干扰，提高育种的选择效率； 3. 遗传分析； 4. 物种进化研究。
第二节 花药培养
一、 概述
概念
花药培养和花粉培养是获 是植物单倍体的有效方法之一
• 花药培养:把发育到一定阶段的花药接种在
人工培养基上,使其发育和分化成为植株的
过程.
单倍体植物与二倍体相比较，有三个明显的特点： 体细胞染色体数减半；
生长发育弱，体形小、各器官明显减小；
雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性 世代。
（二）花药或花粉培养在作物育种中的作用：
（1）缩短育种年限：常规育种需4-6年获得纯 系，而小孢子培养仅需1-2年。
2. 预处理：如低温冷藏 3. 材料灭菌 4. 花粉植株诱导
花药和花粉培养中的白花苗
白化苗的控制
花粉发育时期：花药培养中，白花苗的比例随接 种时花粉发育时期的延迟而提高。
培养基成分：高浓度的2,4-D会使花粉愈伤组织分 化出更多的白化苗 培养温度：当培养温度提高时，白花苗的数目也 随之增加。
养—植株再生
花药的剥取：
避免花药受到损伤，因为损伤常会刺激花药壁组
织的发育，形成二倍体的愈伤组织。
花药预处理
• 大量试验结果表明，花药培养前给予一 定的低温处理是十分必要的。
花药培养常用的基本培养基： N6：高硝态氮，低铵态氮，广泛用于禾本科植物 的花药培养 B5、MS、White、Nitch 等。 C17（王培等，1986）：适于小麦花药培养，提高 出愈率。
（1）A-V途径 由营养细胞重复分裂形成单倍体
（2）A-G途径
由生殖细胞重复分裂形成单倍体
（3）A-VG途径（E途径） 由营养细胞和生殖细 胞各自独立分裂，共同形成单倍体 （4）C途径 营养细胞和生殖细胞通过核融合， 形成多倍体植株
（三）花药和花粉培养中雄核发育的途径
2、B途径 小孢子第一次有丝分裂为均等分 裂，形成大小相近的两个细胞。然后由这 两细胞连续分裂形成单倍体植株，或者核 融合形成多倍体植株。
二、 植物单倍体在植物遗传育种中的应用
单倍体的优点： 1. 单倍体的每个染色体组都是单的，加倍后，由不育 变可育，快速纯合； 2. 单倍体每一种基因都只有一个，在单倍体内，每个 基因都能发挥自己对性状发育的作用，不再区分基 因的显隐性，是研究基因性质及作用的优良材料； 3. 异源多倍体的各个染色体组之间并不是绝对异源的 ，一些染色体组间的染色体可能存在部分同源的关 系，对研究物种起源和进化有帮助。
第四节 花粉培养
•花粉培养(小孢子培养):从花药中分离出花粉粒, 使之成为分散的或游离状态,通过培养使花粉粒脱 分化,进而发育成完整植株的过程.
花粉培养技术
• 1、取材时期：四分体时期到单核早期。
花粉培养技术
• 2、花粉的分离：
1）自然散落法(漂浮培养自然释放法) ： 将花药接 种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落 后，收集培养。 2）机械游离法 a.磁搅拌法：用磁力搅拌器低速搅拌培养液中的 花药，使花粉游离出来； b.挤压法：在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤 出后收集培养。
花粉培养技术
• 3、小孢子纯化： 对获得的小孢子混合物进 行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子
花粉培养技术
• 4、花粉的培养
• 平板培养：花粉置琼脂固化培养基上培养。 • 液体培养： 花粉悬浮在液体培养基中培养，需震 荡，以利通气。 • 双层培养：先铺一层琼脂固体培养基（加入失活 花药的浸提液），凝固后，在表面加入少量液体 培养基培养。 • 看护培养：利用花药或花药愈伤组织释放出的活 性物质促进花粉小孢子发育。 • 微室培养：利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微 室进行花粉培养。
单核花粉粒（单核靠边期）
精细胞
有丝分裂
双核早期
精细胞 (3-细胞花粉粒）
N
选择花药时，一般通过镜检来确定其中的花粉 是否处于适宜的发育期。
最常用的方法有醋酸洋红法。但是，某些植物 的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青-铬矾法， 这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。
（二）花药培养的基本程序是：
外植体选择－消毒—剥取花药—接种—诱导培
供体植株 花粉培养 小孢子（N） 雄核发育
花粉植株 （N）
自然加倍 人工加倍
纯合植株 （2N）
一年内获得纯系
（2）提高了目标基因型的选择效率 例：
二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中 选择基因为AAbb的纯合单株
常规方法： AAbb出现的概率为1/16，并且不能 将AAbb与Aabb、aAbb区分开。
一、 植物单倍体与人工诱发单倍体的应用
人工诱发单倍体（artificial induced haploid）——单倍 体细胞在人工离体条件下培养，使其单性发育成植 物体。 人工诱发单倍体的方法： 1. 组织和细胞离体培养 2. 远缘杂交 3. 体细胞染色体消失 4. 异质体 5. 孪生苗 6. 半配合和辐射等
①体细胞干扰 ②生殖细胞的自发加倍
花粉植株的倍性及染色体加倍
2. 花粉植株的倍性：
单倍体、二倍体、多倍体、非整倍体 3. 影响非整倍体植株出现的频率的因素：
• ①植株的种类
• ②接种花粉的发育时期
• ③培养基中激素的浓度和种类
• ④花粉植株发生的方式 • ⑤愈伤组织继代培养时间长短
花粉植株的倍性及染色体加倍
• ③花粉粒的鉴定；
• ④气孔密度测定。
一、单倍体植株的鉴定
2. 直接鉴定：染色体数目的检测，也是最准 确的倍性鉴定方法。
• ①根尖的鉴定； • ②幼穗或花蕾的鉴定；
二、单倍体植株的二倍化
秋水仙素
1. 浓度的选择 2. 处理时间的选择 3. 助渗剂使用
花粉植株的倍性及染色体加倍
1. 对花粉再生植株群体进行鉴定的必要性：
花药培养获得单倍体的技术途径已在禾本科作 物、茄科作物、十字花科作物的育种中广泛应用。
（二）花药培养的基本程序是：
外植体选择－消毒—剥取花药—接种—诱导培
养—植株再生
外植体的选择：
供试材料的遗传背景，供试材料的生理状态，花
粉的发育时期等。
四分体
4个单核花粉粒（细胞壁薄、细胞质浓、核位于细胞中央） 营养细胞（大） （两者仅以质膜相隔） 生殖细胞（小） （2-细胞花粉粒）
单倍体方法： AAbb出现的概率为1/4。
单倍体 二倍体
AB------ --------------------> AABB aB----------------------------> aaBB Ab----------------------------> AAbb ab-- --------------------------> aabb
4. 单倍体植株的鉴定
1）形态学鉴定
2）染色体分析
5. 单倍体植株的二倍化
①小苗浸泡法
②生长锥处理
③培养基加倍
花粉植株的形态发生方式
1 、胚状体发育途径： 小孢子经历胚发生的各 个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。
烟草花药培养——通过胚状体途径再生形成小植株
花粉植株的形态发生方式
2、愈伤组织发育途径：小孢子分裂数次 形成愈伤，再分化形成花粉植株。此
途径产生的植株会出现变异且倍性复
杂。
水 稻 花 药 培 养 的 愈 伤 化 发 生 途 径
第十三章 人工诱发单倍体及其应用
第一节 植物单倍体概念及人工 诱发单倍体的应用
一、 植物单倍体与人工诱发单倍体的应用
单倍体(haploid)——指具有配子体（gametophyte）染色 体数的孢子体(植物个体)(sporophyte)。
二倍体(diploid )植物其单倍体（haploid）即一倍体（ monoploid ）如， 玉米 2n = 2x = 20 n= x = 10； 水稻 2n = 2x = 24 n= x = 12 四倍体(tetraploid)植物其haploid为dihaploid 如，马铃薯 2n = 4x = 48， n = 2x = 24 六倍体(hexaploid)植物其haploid为triploid 如，普通小麦2n = 6x = 42， n = 3x = 21 八倍体(octoploid)植物其haploid为tetraploid 如，草莓 2n = 8x = 56 ，n = 4x = 28
（四）花药培养与花粉培养的异同点
– 培养目的相同，均获得小孢子植株。
– 花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞 培养。 – 花粉培养没有药壁组织干扰，单倍体产量高。
二、 花药培养技术
（一）研究历史： 首先报道通过花药培养获得单倍体植株成功的是 印度学者Guha和Maheshwari (1964, 1966)。 1996年的统计数据表明,已有至少250多种植物花 药培养成功。
激素：相对较低的激素水平 蔗糖：一般2-3%，高浓度对禾谷类较有利 培养条件－温度和光照： 番茄花药培养对蔗糖浓度的诱导反应 蔗糖浓度 2％ 3％ 4％ 6％ 10％ 13％ 17％ 诱导频率 5％ 10％ 12％ 18％ 25％ 45％ 8％
第三节 花药培养注意的问题
1. 材料选择（基因型；生理状态；光照；花 药发育时期）